Progetto

PROGETTO DI RICERCA
Ruolo della NGS e della biopsia liquida nella determinazione del profilo molecolare
del carcinoma ovarico.
Proposto dalla dott.ssa Angela Listì , per il Concorso per l'ammissione al Corso di Dottorato di Ricerca
(XXXII ciclo) in "Oncologia e Chirurgia Sperimentali-Internazionale "
dell’Università degli Studi di Palermo
BACKGROUND
Il carcinoma dell’ovaio rappresenta in Italia circa il 35% di tutti i tumori dell’apparato genitale femminile ed
è considerata la quinta causa di morte per cancro nel sesso femminile (anni 50-69) (1). Le neoplasie epiteliali
ovariche sono di origine mesoteliale e sono classificate secondo il tipo cellulare (sieroso, mucinoso,
endometrioide, a cellule chiare, transizionale), e sottoclassificate (borderline, alto ,medio e basso grado di
malignità) in base agli aspetti architetturali, alle caratteristiche nucleari ed alla presenza o assenza di
invasione stromale (2).
Sulla base delle informazioni ad oggi disponibili, si stima che la maggior parte dei carcinomi ovarici insorge
su base sporadica mentre circa il 10% su base eredo-familiare. Nel corso degli anni ‘90, sono stati identificati
due geni oncosoppressori denominati BRCA1 e BRCA2 (BReast CAncer susceptibility gene 1 e 2) che si
trasmettono con modalità di tipo autosomico dominante, e se mutati, sono responsabili dell’insorgenza di
circa l’ 80% delle neoplasie eredo- familiare della mammella e del 70% dell’ovaio. (3)
L’analisi dello stato mutazionale dei geni BRCA su sangue periferico per la ricerca di mutazioni ereditarie è
eseguito già da molti anni attraverso metodologie ampiamente validate come il sequenziamento di Sanger o
in fase di validazione come il sequenziamento di nuova generazione (NGS, Next Generation Sequencing)
Finora il test genetico BRCA1/2 ha avuto una valenza preventiva permettendo di individuare famiglie ad
alto rischio (Hereditary brest ovarian cancer , HBOC) portatrici di una variante patogenetica su uno di questi
geni e di guidarli a intraprendere percorsi di diagnosi precoce . Il test quindi risultava relativamente utile
per il probando e di maggiore utilità per l’eventuale identificazione di “portatori sani” tra i familiari.
Oggi l’analisi dello stato mutazionale dei geni BRCA1/2 ha acquisito un valor aggiuntivo nel carcinoma
ovarico. Recenti studi hanno dimostrato che le pazienti portatrici di una variante patogenetica ereditaria dei
geni BRCA1/2 presentavano prognosi più favorevole e spiccata sensibilità al trattamento con farmaci a base
di platino e / o inibitori dell’enzima poly ADP- ribosio polimerasi (PARP). L’efficacia degli inibitori di
PARP nel carcinoma dell’ovaio si realizza attraverso un meccanismo di “letalità sintetica”. Infatti la
concomitante perdita di due enzimi essenziali nei meccanismi di riparo del DNA , ossia BRCA1/2 (a causa
di mutazioni patogenetiche) e PARP1( in seguito a alla inibizione farmacologica di tipo target ) conduce la
cellula tumorale a morte per apoptosi . Studi clinici hanno evidenziato una spiccata attività degli inibitori di
PARP nelle pazienti affette da carcinoma ovarico sieroso ad alto grado con mutazioni germinali e somatiche
di BRCA1/2 portando all’approvazione del primo farmaco appartenente a questa famiglia, Olaparib, come
terapia di mantenimento dopo recidiva platino-sensibile.
In base agli studi oggi disponibili si attende che circa i 2/3 delle mutazioni di BRCA siano di tipo germinale
mentre circa 1/3 siano di tipo somatico. Ad oggi il test di BRCA su sangue periferico è in grado di rivelare
esclusivamente le varianti germinali , ed è l’unico raccomandato come test predittivo nella pratica clinica.
Il test eseguito su tessuto tumorale è in grado di evidenziare anche le varianti acquisite per via somatica ma
non ci sono ancora oggi delle metodiche standardizzate per l ’esecuzione e l’interpretazione di tale test.
Inoltre sempre nell’ambito dei carcinomi ovarici , sono stati identificati geni difettivi codificanti per altre
proteine chiave nei meccanismi di riparo al DNA di tipo homologous recombination HR, come
P53,RAD51,ATM, ATR, CHEK1, CHEK2, PALB2,CtIP, MNR complex, FANC , che identificano il profilo
molecolare Homologous Recombination Deficency HRD . Queste alterazioni, incluse le mutazioni
somatiche e il silenziamento epigenetico dei geni BRCA1/2 conferiscono un fenotipo clinico/patologico
con caratteristiche simili ai tumori ovarici BRCA mutati (carcinoma sieroso ad alto grado , platino sensibile,
responsivo a trattamento con PARP inibitori) pur non possedendo mutazioni germinali a carico dei geni
BRCA1/2, e perciò definiti “BRACAness o BRACA like”. ( 4, 5, 6, 7,8)
I MIRNAs o microRNA sono dei piccoli RNA non codificanti ( di circa 19-25 nucleotidi) caratterizzati dalla
capacità di regolare post trascrizionalmente determinanti processi cellulari. I miRNA agiscono mediante il
legame ai messaggeri target nella regione 3’UTR determinandone la degradazione. In particolare il miR506 appartiene ad una famiglia di un microRNA coinvolti nella regolazione della transizione epitelio
mesenchimale, responsabile della metastatizzazione e progressione di malattia . Una de-regolazione
dell’espressione del mir-506 è stata ritrovata nei carcinomi ovarici sierosi ad alto grado, e può essere
utilizzata come biomarker predittivo di risposta/ resistenza alle terapie mediche . (9,11)
La valutazione dell’espressione dei miRNA può essere effettuata anche su acidi nucleici circolanti
(Circulating Nucleids Acids ,CNA ) reperibili nel plasma. La biopsia liquida infatti rappresenta una preziosa
sorgente di biomarkers circolanti il cui rilascio nel sangue può verificarsi da diversi siti tra cui il tumore
primitivo, le metastasi, le cellule tumorali circolanti e le cellule normali e si propone di integrare la biopsia
tissutale, che risulta invece una procedura altamente invasiva, talvolta tecnicamente difficoltosa, e non
sempre gradita dal paziente stesso.(10)
OBIETTIVI
Per tale ragione lo scopo del lavoro prevede di :
Sviluppare dei pannelli NGS che permettano la caratterizzazione del fenotipo molecolare HRD su
sangue ,tessuto paraffinato e plasma.
Associare le eventuali alterazioni molecolari (HRD) riscontrate con le caratteristiche clinico
patologiche delle pazienti reclutati.
Associare le alterazioni molecolari (HRD) riscontrate con l’efficacia/resistenza alle terapie mediche
per valutarne il potenziale ruolo come marcatori prognostici e predittivi.
Valutare l’espressione del mir-506 (coinvolto nei meccanismi della EMT) in tessuto FFPE e in
biopsia liquida ed eventuale correlazione con la resistenza alla terapia medica.
MATERIALI E METODI
Arruolamento pazienti e raccolta campioni.
Lo studio sarà effettuato utilizzando, dopo consenso informato, campioni tissutali di pazienti con carcinomi
ovarici sierosi ad alto grado dei quali sarà richiesto il tessuto paraffinato e sangue periferico .
Tali campioni potranno essere richiesti dal laboratorio di “Genetica ed Oncologia Molecolare Clinica e di
Target Therapy” del “Centro di Riferimento regionale per la prevenzione, la diagnosi e la cura dei tumori rari
e dei tumori solidi eredo-familiari dell’adulto”, dell’U.O. di Oncologia Medica del Policlinico “P. Giaccone”
di Palermo, affinché venga eseguita l’analisi mutazionale per la ricerca di biomarcatori validati e in corso di
validazione con ruolo predittivo. Tale raccolta sarà possibile in quanto il policlinico P.Giaccone rappresenta
il centro di riferimento della “Rete Tumori Eredo-Familiari Sicilia”, nata dall’esigenza di creare una proficua
e permanente collaborazione tra centri oncologici su tutto il territorio regionale, finalizzata al miglioramento
dell'assistenza ai pazienti con tumori eredo-familiari.
Estrazioni di acidi nucleici.
Lo studio prevede di utilizzare una pluralità di campioni biologici per poter ottenere lo stato mutazionale
germinale e somatico dei geni al momento della raccolta ma anche di poter continuare a monitorare i
biomarcatori predittivi in questione per i pazienti reclutati. A tale scopo ci poniamo l’obiettivo di poter
raccogliere il sangue periferico, il plasma e i tessuti paraffinati.
Dal sangue periferico possiamo ottenere :
Acidi nucleici circolanti dal plasma. Il plasma si ottiene dal sangue periferico per centrifugazione
entro le due ore dal prelievo , in accordo con la seguente procedura:
Centrifugare (senza trasferire il sangue) a 1200g per 10 minuti a 4°C. Trasferire il plasma, avendo cura di
non prelevare la parte corpuscolata del sangue, in nuove provette eppendorf da 1.5 o 2 mL ,per centrifugare
nuovamente a 3000g per 10 minuti a 4°C .
La fase finale prevede di trasferire, avendo cura di non prelevare il pellet residuo sul fondo della provetta, in
nuove eppendorf da 1.5 o 2 mL. Naturalmente le provette devono riportare un codice identificativo che sarà
lo stesso presente nella cartella clinica e nel consenso informato del paziente in questione e inoltre sarà
affidato un codice binario composto da lettere e numeri cosi per agevolare la raccolta di nuovi prelievi ai
follow-up e conservare il campione a -80°C fino all’uso da plasma . L’estrazione degli acidi nucleici
circolanti può avvenire con il Circulating Nucleic Acid kit ( Qiagen), oppure Serum and plasma miRNA kit
Qiagen per ottenere i micro RNA circolanti
DNA genomico totale . il DNA genomico si ottiene dall’ intera quota di cellule corpuscolate presenti
nel fluido ematico,depositate a formare l’anello nel buffy coat al disopra del plasma durante le
procedure di centrifugazione. L’estrazione di DNA genomico da sangue periferico avviene mediante
l’uso di QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN)
Le sezioni di tessuto paraffinato rappresentano il materiale biologico di partenza che può essere disponibile
sotto forma di biopsie esplorative o di tessuto neoplastico asportato con l’intervento chirurgico.
Le sezioni di tessuto in paraffina, dello spessore di almeno 10 micron, vengono raccolte in una provetta
sterile, Eppendorf, deparaffinate in appropriato solvente, lavate in alcool e disidratate prima di iniziare
l’estrazione del DNA/RNA .
La percentuale di cellule neoplastiche presenti nel campione viene preventivamente valutata dall’anatomopatologo, al fine di stabilire l’idoneità del campione, in quanto una bassa percentuale di tali cellule, può
condizionare la possibilità di individuare i biomarcatori predittivi validati nella pratica clinica.
Non esistono ad aggi metodiche standardizzate per l’esecuzione e l’interpretazione dell’analisi BRCA sui
tessuti tumorali .L’esecuzione del test BRCA sul tessuto tumorale presenta complessità maggiori dei test su
tessuto già inseriti nella routine diagnostica oncologica . La peculiare complessità analitica del test BRCA
somatico è dovuta al fatto che differenti varianti potenzialmente patogenetiche si possono osservare lungo
tutto il gene BRCA1(23esoni) BRCA2(27 esoni) possono coesistere sia mutazioni puntiformi che ampie
delezioni/duplicazioni , più alterazioni genetiche strutturali;
La procedura di estrazione di DNA da tessuto paraffinato può avvenire con l’ausilio del QIAamp FFpe tissue
KIT (Quiagen, USA . L’estrazione di RNA sarà invece propedeutica all’analisi dei valori di espressione del
miR-506, che può essere condotto mediante Realtime PCR o Digital PCR .L’ Estrazione dei microRNA può
avvenire su tessuto FFPE con l’ausilio del kit miRNeasy FFpe tissue (Quiagen, USA).
Quantizzazione .
Fondamentale al procedere delle analisi risulta il passaggio della quantizzazione dell’acido nucleico estratto,
che può essere effettuata mediante NANODROP ( life technologies) o Qubit 2.0 Fluorometer
(life technologies) con il dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit. Il NANODROP utilizza la diversa capacità
delle proteine e degli acidi nucleici di assorbire UV, per fornire un rapporto della purezza dell’acido
nucleico estratto. Il Qubit2.0 invece basa la propria tecnologia su un sistema di fluorescenza risultando
sicuramente più sensibile e idoneo per le procedure da svolgere in NGS.
Analisi in NGS
Il pannello multigenico Amplicon-NGS sarà progettato tramite lo strumento on-line Ion AmpliSeq Designer
che consente il disegno di pannelli personalizzati con amplificazione ultra-multiplex PCR. La tecnologia
NGS è un tipico sistema di sequenziamento “high-throughput” in quanto è in grado di generare
contemporaneamente ed in breve tempo milioni di sequenze geniche. L'approccio tipico prevede quattro fasi:
1) il DNA genomico a doppia elica è prima frammentato in milioni di piccoli segmenti (della lunghezza di
circa 150 bp); 2) le estremità di questi frammenti sono “riparate” in modo da generare estremità piatte (blunt
ends); 3) alle estremità 5' e 3' di ciascun frammento vengono aggiunti (ligati) adattatori; 4) i frammenti con
coniugati gli adattatori sono amplificati simultaneamente per la generazione della “library finale”: in questa
fase è possibile incorporare nelle libraries dei codici a barre (barcode) che vengono utilizzati nel
sequenziamento multiplex ), processo che consente di sequenziare parallelamente in una singola run più
campioni.
Seconda peculiarità della NGS risulta sicuramente la grande mole di dati ricavabili dall’analisi delle
sequenze e a tale ragione risultano indispensabili determinati software bioinformatici che hanno il compito di
discriminare tra le varianti geniche che possono essere rilevate automaticamente rispetto a quelle che sono
ostacolate da errori di sequenziamento a causa di omopolimeri o di artefatti di amplificazione in PCR.
L’analisi potrà essere condotta tramite la Ion Torrent Variant Caller and Annovar che viene utilizzata sia per
il rilevamento di varianti geniche che per l'annotazione del gene e le relative previsioni funzionali.
Polimorfismi a singolo nucleotide e mutazioni dovute a inserzioni e delezioni che coprono le regioni
codificanti del BRCA1 e BRCA2 possono essere recuperate dagli archivi pubblici di varianti fenotipiche
molecolari ClinVar , e dal data base COSMIC (Catalogue of Somatic Mutation in Cancer). Attualmente c’è
una grande quantità di informazioni disponibili nella letteratura scientifica pubblicata su queste modifiche.
COSMIC è stato progettato per memorizzare e visualizzare informazioni delle mutazione somatica e
informazioni relative ai tumori umani. Questi dati vengono poi convertiti in un file Hotspot e utilizzato per
guidare lo screening delle varianti geniche somatiche e germinali.
Real Time Pcr
La REAL TIME PCR permette di misurare durante la fase esponenziale della PCR la quantità del prodotto
amplificato. Il dato in tempo reale è ottenuto registrando la caratteristica emissione di florescenza delle sonde
specifiche per il frammenti di interesse Lo strumento usato è il ABI-PRISm 7900 Ht Sequence Detection
System (Applied Biosystems) dotato di software SDS 2.1 (Applied Biosystems). La quantizzazione relativa
consente di analizzare il livello di espressione di un gene, e nella fatti specie del miR-506 nei campioni in
esame, normalizzati rispetto ai relativi controlli. Attualmente un ulteriore metodica utilizzabile è
rappresentata dalla DIGITAL PCR che come la qPCR usa la fluorescenza come tecnologia di base
impiegata nella metodica di rivelazione. Il campione utilizzato in dPCR viene diluito e ripartito in
centinaia di camere di reazione, in maniera tale che in ogni partizione si troverà una sola molecola
di acido nucleico o nessuna. La partizione del campione diminuisce la quantità di DNA che funge
da background e di conseguenza aumenta la sensibilità nei confronti del target. Per tale ragione
l’utilizzo della dPCR potrebbe essere preferibile alla qPCR a parità di idoneità di campione per una
maggiore specificità di rilevazione e di sensibilità della quantità del prodotto rilevato.
ANALISI STATISTICA
Su tutti i dati sarà effettuata un’analisi descrittiva, utilizzando le statistiche usuali: media, mediana,
deviazione standard, range, valore minimo e massimo per le variabili continue; frequenze assolute e relative
per le variabili categoriche.
I dati di sopravvivenza raccolti verranno analizzati mediante il metodo di Kaplan-Meier.
In ragione dei risultati osservati sarà valutata l’associazione tra le caratteristiche biomolecolari della malattia
e il trattamento effettuato, gli eventi maggiori, l’ampiezza dell’intervallo libero da progressione e la
sopravvivenza globale.
L’associazione fra l’andamento temporale dei biomarcatori molecolari sierici e l’attività/efficacia del
trattamento effettuato verrà valutata mediante il test statistico chi-quadro.
In considerazione degli scopi puramente descrittivi dello studio, non verrà effettuata alcuna valutazione
dell’adeguatezza del campione .
Firma del candidato
Palermo, 05/07/2016
Angela listì
BIBLIOGRAFIA:
1) I numeri del cancro in Italia 2015, AIOM CCM AIRTUM 2015.
2) Linee guida AIOM 2015
3) Antoniou AC, Pharoah PD, Easton DF and Evans DG (2006) BRCA1 and BRCA2 cancer risks. J Clin
Oncol 2
4)BRCA somatic and germline mutation detection in paraffin embedded ovarian cancers by nextgeneration sequencing
Mafficini A. Oncotarget. 2016 PMID: 26745875PMCID: PMC4811444
5) BRCA somatic mutations and epigenetic BRCA modifications in serous ovarian cancer
Review Article Moschetta M. Ann Oncol. 2016 PMID: 27037296
6 )Ovarian cancer: Status of homologous recombination pathway as a predictor of drug response
Review Article De Picciotto N. Crit Rev Oncol Hematol. 2016
7 )PMID: 26964893 Hereditary ovarian cancer: not only BRCA 1 and 2 genes
Review Article Toss A. Biomed Res Int. 2015 PMID: 26075229PMCID: PMC444987
8 )The molecular analysis of BRCA1 and BRCA2: Next-generation sequencing supersedes
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9 )Epithelial-mesenchymal transition-associated miRNAs in ovarian carcinoma, with highlight on the
miR-200 family: prognostic value and prospective role in ovarian cancer therapeutics
Review Article Koutsaki M. Cancer Lett. 2014 PMID: 24952258
10) Liquid Biopsies in Oncology and the Current Regulatory Landscape
Review Article Strotman LN. Mol Diagn Ther. 2016 PMID: 27324559
11 )The miR-200 Family: Versatile Players in Epithelial Ovarian Cancer Review Article Muralidhar GG.
Int J Mol Sci. 2015 PMID: 26213923PMCID: PMC4581173