Tripanosomosi Africana

Tripanosomosi Africana
Philum Sarcomastigophora
Classe Zoomastigophore
Ordine Kinetoplastida
Famiglia Trypanosomatidae
Genere Trypanosoma
Sezione SALIVARIA
Epidemiologia
50 milioni di persone a rischio
<20% sotto sorveglianza
20,000 nuovi casi/anno
epidemie periodiche e devastanti
200 foci endemici
Tripanosomosi Africana
Distribuzione
Tripanosomi africani :
§  Trypanosoma brucei gambiense
§ Trypanosoma brucei rhodesiense
§ Trypanosoma brucei brucei
(agente eziologico del “nagana”-malattia dei ruminanti)
EPIDEMIOLOGIA
T.b.gambiense
Diffuso nelle zone umide fluviali dell’Africa centrooccidentale
VETTORE: Glossina palpalis che vive in ambienti umidi
SERBATOI: - uomo
- maiale
T.b.rhodesiense
Diffuso nelle savane delle regioni africane sudorientali
VETTORE: Glossina morsitans che vive in zone secche
SERBATOI: - diverse specie animali (insetti zoofili)
- solo occasionalmente l’uomo
Trypanosoma brucei gambiense
E’ diffuso nell’Africa centro occidentale e si distingue in due
sottopopolazioni:
gruppoI
-limitata variabilità genetica
-bassa virulenza negli animali di laboratorio
gruppoII
- maggiore variabilità genetica
-media virulenza negli animali di laboratorio
Trypanosoma brucei rhodesiense
E’ diffuso nell’Africa orientale, è capace di infettare l’uomo ed è più
virulento
Gene SRA: - conferisce resistenza - elemento di distinzione certa
traT.b.rhodhesiense e T.b.brucei
Trypanosoma brucei gambiense
e
Trypanosoma brucei rhodesiense
Agenti eziologici della malattia del sonno
trasmessa all’uomo da ditteri ematofagi
del genere Glossina (mosca tse tse)
Glossina
uomo
Glossina infetta
CICLO VITALE
NELL’UOMO
Uomo
Tripomastigoti
metaciclico
è depositato nel derma (infiammazione)
•  linfonodi e sangue
Tripomastigoti snelli
Tripomastigoti tozzi
Assunti dalla
glossina
• Tali forme sono dipendenti dal “glucosio”
come fonte di energia che viene
metabolizzato nei glicosomi.
- linfa
-sangue
-liquor cefalorachidiano
Glossina
Tripomastigoti
tozzi
Uomo infetto
CICLO VITALE NEL VETTORE
intestino medio
Tripomastigoti
prociclici snelli
- cambia il proprio metabolismo in funzione
della principale fonte energetica dell’insetto
costituita prevalentemente dalla prolina
- viene sostituita la VSG con un’altra glicoproteina
che è la prociclina
Tripomastigoti
mesociclici
= perdita dell’infettività verso il mammifero
Epimastigoti
Tripomastigoti
metaciclici
ghiandole salivari
sostituiscono la superficie
di prociclina con VSG
Forme di tripanosomi
Morfotipi nel
vettore:
Tripomastigote
Epimastigote
Tripomastigote
metaciclico
Morfotipi nell’uomo:
Tripomastigote
Sottile
Tripomastigote
intermedio
Tripomastigote tozzo
Nell’uomo:Tripomastigoti ematici
sono caratterizzati da due forme
1) forma snella
- membrana cellulare ondulante - flagello libero
- nucleo ovale
- incessante attività riproduttiva
- trasformazione della propria struttura antigenica di superficie
determinata dalla glicoproteina VSG (Variant Surface Glicoprotein)
permette l’evasione dalle difese immunitarie dell’ospite
2) forma tozza
- nucleo rotondeggiante
- priva di flagello libero ( poco mobile)
l’unica forma infettante per il vettore
Nell’insetto:
§  Tripomastigoti tozzi
intestino medio
§  Tripomastigoti prociclici snelli
intestino anteriore
ghiandole salivari
§  Epimastigoti
§  Tripomastigoti metaciclici
Sole forme infettanti per l’ospite mammifero
I vettori
Glossine spp
22 specie
habitat ombreggiati (20-30oC)
Si nutrono di giorno Il parassita si sviluppa in
10-14 giorni
Vettori Tripanosomosi Africana
• Glossina morsitans
• T. brucei rhodesiense
• Glossina palpalis
• T. brucei gambiense
African Sleeping Sickness
T.b.gambiense
• 
• 
• 
• 
• 
Virulence
Reservoir
Zoonotic
Vector
Distribution
Less
Human/animal
Less
G.palpalis
Western Africa
T.b.rhodesiense
More
Human/animal
More
G.morsitans
Eastern Africa
MALATTIA DEL SONNO
La malattia del sonno o
tripanosomosi africana si
estende dal Sud del Sahara
al Nord del Kalahari e si
manifesta in due forme:
§ 
CRONICA dovuta a T.b.gambiense
(manifestazione lenta della malattia)
§ 
ACUTA dovuta a T.b.rhodesiense
(manifestazione rapida e grave della malattia)
PATOGENESI
I tripanosomi metaciclici inoculati dalla Glossina
§  si moltiplicano localmente negli spazi intracellulari
“chancre” cutaneo
- edema
- danno tissutale locale
§  penetrano attraverso la via linfatica nel sangue
§  invadono il sistema nervoso centrale
lesioni a carico delle meningi
Tripanosomosi Africana
fasi di invasione:
•  Formazione di un nodulo nel punto di
inoculo (chancre)
•  Invasione di linfoghiandole, fegato e milza
Tripanosomosi Africana
sintomi in fase emolinfatica
•  Febbre intermittente
•  Spleno- ed Epatomegalia
•  Ingrossamento linfonodi
Tripanosomosi Africana sintomi
I fase invasiva del SNC
(da 3 mesi a diversi anni dopo l’inoculo)
• 
• 
• 
• 
Regressione dei sintomi precedenti
Persistenza di febbri intermittenti
Insonnia, difficoltà di concentrazione
Irritabilità
Tripanosomosi Africana sintomi
II fase invasiva del SNC
(da 3 mesi a diversi anni dopo l’inoculo del parassita)
•  Infiltrati linfocitari nelle meningi
•  Infiltrati linfocitari nell’encefalo
•  Fenomeni di demielinizzazione
in encefalo e nervi periferici
•  Turbe neuropsichiche
•  Sonnolenza
•  Coma profondo
DIAGNOSI
La tripanosomosi africana va sospettata in soggetti
residenti o provenienti da aree endemiche
•  per T.b.rhodesiense la maggior parte dei casi si
manifesta allo stato precoce della malattia
•  per T.b.gambiense la malattia si manifesta dopo mesi o
anni, quando è caratterizzata da meningoencefalite
Le forme tripomastigote vanno ricercate direttamente nel
sangue, liquor, aspirati linfonodali
•  tecniche parassitologiche dirette
•  tecniche sierologiche: DAT, ELISA
Diagnosis
•  Direct microscopy
–  Blood (T.b. rhodesiense.)
–  Lymph node aspirate (T.b.gambiense)
–  Lumbar puncture (Late T.brucei.rhod. &
T.b.gamb.)
•  Serology
•  Animal inoculation
Tripanosomosi Africana
diagnosi di laboratorio
•  Reperimento di
tripomastigoti nel
sangue, nel liquor ed
in aspirati da linfonodi
TERAPIA
Il trattamento chemioterapico specifico per la
tripanosomosi africana differisce a seconda
dello stadio della malattia
§ PENTAMIDINA
§ SURAMINA: indicato nello stadio ematolinfatico
§ MELARSOPROLO: indicato nello stadio meningoencefalico
§ Alfa – difluorometilornitina (DFMO):
utile su T.b.gambiense in fase terminale
LOTTA E PREVENZIONE
Lotta:
§  incendi o estirpazioni della vegetazione dove
le mosche tse-tse si moltiplicano
§  disinfestazioni con insetticidi
§  distruzione di mandrie di animali
selvatici (T.b.rhodesiense)
Prevenzione:
§  esami periodici della popolazione a rischio basati su
esame clinico, sierologico e parassitologico
§  controllo dei maiali (possibili serbatoi della malattia)
Mutual self-defence: the trypanolytic factor story
Pays E, Vanhollebeke B.
Microbes Infect. 2008 10:985-9
Around 1900 Laveran and Mesnil discovered that African trypanosomes (prototype:
Trypanosoma brucei brucei) do not survive in the blood of some primates and humans.
The nature of the trypanolytic factor present in these sera has been the focus of a
long-standing debate between different groups, but recent developments have allowed
the proposal of a coherent model incorporating most seemingly divergent views and
providing an interesting example of the complex interplay that continuously occurs
between hosts and parasites. Possibly as an adaptation to their natural environment,
great African apes (Hominoidea) and humans have acquired a new member of the
apolipoprotein-L family, termed apoL1. This protein is the only one of the family to be
secreted in the blood, where it binds to a subset of HDL particles that also contain
another human-specific protein, haptoglobin-related protein or Hpr. T. b. brucei
possesses a specific surface receptor for the haptoglobin-hemoglobin (Hp-Hb)
complex, as a way to capture heme into hemoproteins that contribute to cell growth
and resistance to the oxidative stress of the host. As this receptor does not
discriminate between Hp and Hpr, Hpr-containing HDL particles of human serum are
efficiently taken up by the parasite, leading to the simultaneous internalization of
apoL1, Hpr and Hb-derived heme. Once in the lysosome, apoL1 is targeted to the
lysosomal membrane, where its colicin-like anionic pore-forming activity triggers an
influx of chloride ions from the cytoplasm. Osmotic effect linked to this ionic flux leads
to uncontrolled swelling of the lysosome, ultimately causing the death of the parasite.
Mutual self-defence: the trypanolytic factor story
Pays E, Vanhollebeke B.
Microbes Infect. 2008 10:985-9
Two T. brucei clones, termed Trypanosoma brucei rhodesiense and
Trypanosoma brucei gambiense, have managed to resist this lysis
mechanism and, therefore, cause sleeping sickness in humans. While the
mechanism of this resistance is still not known in the case of T. b. gambiense,
the dominant factor responsible for resistance of T. b. rhodesiense has been
identified. This protein, named SRA for Serum Resistance-Associated, is a
truncated version of the major and variable surface antigen of the parasite,
the Variant Surface Glycoprotein or VSG. Presumably due to its defective
nature, SRA is not targeted to the plasma membrane as do regular VSGs, but
ends up in the late endosomal compartment. In this location SRA is thought to
neutralize apoL1 through coiled-coil interactions between alpha-helices.
Meccanismi specifici di evasione del
T. brucei
• Variazione antigenica: le VSG
• Attivazione policlonale ed aspecifica di
linfociti B
• Immunosoppressione dell’ospite
• Produzione di gp63-like protein
Variazione antigenica: le
VSG
Struttura:
• Glicoproteine dimeriche di superficie
• C-terminale ancorata alla membrana, N-terminale caratterizzata da
regioni variabili e costanti
Variant Surface Glycoprotein
60kd (450aa) glycoprotein (CHO 7-17%)
C-terminal anchored in membrane
Often as a dimer (alpha helix)
Only epitopes in end third of N-terminal exposed
Densely clustered 107molecules/parasite
Schematic representation of the major surface glycoconjugates of procyclic
and metacyclic Trypanosoma brucei
Essentials of Glycobiology
Second Edition
Chapter 40, Figure 2
Variazione antigenica: le VSG
La variazione antigenica porta alla mancata eliminazione di
subpopolazioni di parassiti.
Il sistema immunitario, infatti, non è in grado di esprimere in tempo
anticorpi specifici contro gli antigeni temporaneamente espressi.
Parasitemia in Af rican Sleeping Sickness
10
Log 10 Trypanosomes per ml
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
10
20
Days af ter Inf ection
30
Espressione VSG
•  Fase infettante (tripomastigote metaciclico)
espressione di 10-15 diverse VSG
•  7 giorni dall’infezione: inizio switch periodico
delle VSG
•  Fase tardiva: possibile ri-espressione VSG
iniziali
Production of VSG
Gene rearrangement
Produces an expression linked copy (ELC)
ELC transposed to telomeric end of chromosome replacing existing gene
Switch occurs every 106 divisions
100-1000 copies of different VSG’s in clone
Genetic mechanisms of antigenic variation. The Trypanosoma brucei genome contains more than
1,000 variant surface glycoprotein (VSG) genes (shown as coloured boxes). Only one of these VSG
variants is expressed at any one time. Gene expression occurs in a telomeric expression site (ES), where
the VSG gene is co-transcribed with expression-site-associated genes (ESAGs; shown as numbered
boxes).The T. brucei genome contains a set of 15–20 similar (but not identical) ESs, 3 examples of which
are depicted. In T. b. rhodesiense, one particular ES, known as R-ES, contains the serum-resistance
associated (SRA) gene, which confers resistance to lysis by human serum40. Antigenic variation (that is,
the expression of a different VSG variant) can result from two mechanisms (indicated in red): transcriptional
switching and homologous recombination. Transcriptional switching occurs by a process known as in situ
activation, in which expression of the active ES is turned off, and expression of a previously silent ES is
turned on. This process does not involve DNA rearrangement. By contrast, homologous recombination
involves replacement of the active VSG gene. This can occur by one of two mechanisms: gene conversion,
which involves replacement with a copy of a VSG gene from the repertoire; or reciprocal exchange, which
involves replacement with a VSG gene from another ES (and thereby exchange of a VSG gene between
two ESs). These replacements occur through recombination between homologous regions, such as 70
base-pair repeats.
Gain and loss of resistance to human serum. Tsetse flies inject the mammalian host with T. b.
rhodesiense in the metacyclic form, and these trypanosomes then transform into long, slender
bloodstream forms, in which different VSG ESs can be activated. Only trypanosomes in which
the R-ES is active can resist lysis by human serum. Under these conditions, in situ activation
(transcriptional switching) of other VSG ESs is counter-selected (indicated by a small red cross),
owing to the requirement for SRA expression to resist lysis. Therefore, antigenic variation only
occurs through homologous recombination targeted to the active VSG gene. In non-human
hosts, expression of the R-ES seems to be counter-selected, although in situ inactivation of the
R-ES does require many passages in mice6, 39. This counter-selection might result from the
absence of most ESAGs from the R-ES, because these ESAGs might not be completely
dispensable.
Il meccanismo di variazione antigenica
realizzato con le VSG rende particolarmente
complesso lo sviluppo di un vaccino contro
il T. brucei
Meccanismi specifici di evasione del
T. brucei
• Variazione antigenica: le VSG
• Attivazione policlonale ed aspecifica di
linfociti B
• Immunosoppressione dell’ospite
• Produzione di gp63-like protein
Attivazione policlonale di linfociti B
Le molecole rilasciate dai tripanosomi o le stesse VSG
agiscono da mitogeni
Espansione clonale non specifica dei linfociti B
Produzione massiva di IgM non specifiche
IgM eterospecifiche e autoanticorpi
contro proteine e acidi nucleici
dell’ospite
Formazione complessi Ag-Ab con
iperplasia di milza e linfonodi
Meccanismi specifici di evasione del
T. brucei
• Variazione antigenica: le VSG
• Attivazione policlonale ed aspecifica di
linfociti B
• Immunosoppressione dell’ospite
• Produzione di gp63-like protein
Immunosoppressione dell’ospite
1.  Alterazione delle funzioni cellulari B e T:
–  produzione di IgM non seguita da produzione di IgG
–  soppressione della proliferazione dei linfociti T
2.  Alterazione nell’attivazione dei macrofagi:
–  iperattivazione dei macrofagi da parte di porzioni
delle proteine VSG
3. Variazione del pattern di citochine
rilasciate da linfociti
Prodotti di secrezione dei Tripanosomi
(es.proteina T Lymphocyte Triggering Factor)
Induzione dei CD8+a produrre
alti livelli di IFN-γ
Induzione della
produzione di una MAP
chinasi che contribuisce
alla proliferazione dei
tripanosomi
Diminuzione dell’espressione dei
IL-2R e della sintesi dell’IL-2
Soppressione proliferazione
linfociti T
Attraverso esperimenti di laboratorio, effettuati
su ratti e topi, è stato evidenziato che:
• i Tripanosomi stimolano la produzione di IFN-γ nei
linfociti CD8+ ma non nei CD4+
• la proteina TLTF (T-lymphocytes triggering factor) si lega
direttamente alla molecola CD8 esposta sulla superficie
dei linfociti
• la produzione di IFN-γ induce la produzione di una
MAP-chinasi responsabile della proliferazione dei
Tripanosomi
Meccanismi specifici di evasione del
T. brucei
• Variazione antigenica: le VSG
• Attivazione policlonale ed aspecifica di
linfociti B
• Immunosoppressione dell’ospite
• Produzione di gp63-like protein
Produzione di gp63-like protein
Anche i Tripanosomi hanno geni codificanti
proteine simili alle gp-63 presenti nella
Leishmania. Sebbene la loro funzione non sia
stata ancora ben definita, si suppone abbiano
un ruolo specifico nell’evasione della lisi
mediata dal complemento
Riassumendo…
I tripanosomi utilizzano vari meccanismi per evadere dalla
risposta immune, e le strategie dipendono dalle momentanee
necessità del parassita (stadio, localizzazione nell’ospite e
stato del sistema immunitario).
I più comuni sistemi di evasione sono volti a prevenire il
confronto tra parassita e sistema immunitario.
Si realizzano attraverso:
• Secrezione di molecole che modulano il sistema immunitario
• Controllo del set di citochine prodotte
• Anergia delle cellule immunitarie
Nuove
evidenze
sulla biologia
cellulare di
T.brucei
The genome of the African trypanosome
Trypanosoma brucei.
Berriman M, Ghedin E, Hertz-Fowler C, Blandin G, Renauld H, Bartholomeu
DC, Lennard NJ, Caler E, Hamlin NE, Haas B, Böhme U, Hannick L, Aslett MA,
Shallom J, Marcello L, Hou L, Wickstead B, Alsmark UC, Arrowsmith C, Atkin
RJ, Barron AJ, Bringaud F, Brooks K, Carrington M, Cherevach I, Chillingworth
TJ, Churcher C, Clark LN, Corton CH, Cronin A, Davies RM, Doggett J, Djikeng
A, Feldblyum T, Field MC, Fraser A, Goodhead I, Hance Z, Harper D, Harris BR,
Hauser H, Hostetler J, Ivens A, Jagels K, Johnson D, Johnson J, Jones K,
Kerhornou AX, Koo H, Larke N, Landfear S, Larkin C, Leech V, Line A, Lord A,
Macleod A, Mooney PJ, Moule S, Martin DM, Morgan GW, Mungall K,
Norbertczak H, Ormond D, Pai G, Peacock CS, Peterson J, Quail MA,
Rabbinowitsch E, Rajandream MA, Reitter C, Salzberg SL, Sanders M, Schobel
S, Sharp S, Simmonds M, Simpson AJ, Tallon L, Turner CM, Tait A, Tivey AR,
Van Aken S, Walker D, Wanless D, Wang S, White B, White O, Whitehead S,
Woodward J, Wortman J, Adams MD, Embley TM, Gull K, Ullu E, Barry JD,
Fairlamb AH, Opperdoes F, Barrell BG, Donelson JE, Hall N, Fraser CM,
Melville SE, El-Sayed NM.
Science. 2005 Jul 15;309(5733)
La funzione flagellare è essenziale
per la forma sanguigna del
Trypanosoma.
L’induzione di un danno flagellare
potrebbe essere il punto di
partenza per curare la malattia
del sonno
Sia la forma sanguigna che quella
prociclica (nel vettore) del Trypanosoma
Brucei presentano un flagello che
emerge da un pocket flagellare
posteriore.
Tale flagello comprende:
1- assonema circondato da membrana
2- PFR - ”paraflagellar rod”
Come si può impiegare la
proteomica del flagello per
la lotta al Tripanosoma?
-Isolamento di assonema, PFR associato e
corpo basale del flagello della forma prociclica
-Separazione delle proteine mediante
elettroforesi.
- Digestione delle bande ottenute con tripsina
- Analisi dei peptidi risultanti con LC – MS
-Identificazione di 331 proteine costituenti il
Proteoma Flagellare di T. brucei (TbFP)
Le proteine del TbFP presentano omologhi nel genoma
di T.Cruzi e L.Major.
La comparazione tra le proteine del TbFP e del
proteoma flagellare di Chlamydomonas e
Tetrahymena thermophila ha confermato invece la
presenza di un ampio numero di proteine nel TbFP
non codificato negli altri 2 organismi.
Molto probabilmente queste proteine risiedono nel
PFR che rappresenta una struttura flagellare
specifica del Tripanosoma.
L’identificazione di omologhi
del TbFP nell’uomo
responsabili delle malattie
ereditarie legate alla
motilità ciliare ha fornito lo
spunto per bloccare la
funzionalità flagellare nel
T.brucei
Identificazione, oltre alle 3 dineine
assonemali, di omologhi di altre 7
proteine direttamente implicate in
patologie umane.
Tra le proteine ci sono: Hydin,
PACRG e Scorpion.
Analisi funzionale con la tecnica
dell’RNAi della proteina Hydin nella
forma prociclica del Trypanosoma
GRAVE DIFETTO DI MOTILITA’
Analisi di altre 10 proteine del
TbFP con l’approccio dell’RNAi,
8 delle quali mostrano in seguito
ad ablazione, un fenotipo
flagellare.
2 geni (Tb PACRGA e Tb
PACRGB) non hanno effetti se
ablati singolarmente ma la
repressione simultanea determina
la paralisi del flagello.
Tutti gli esperimenti di RNAi a
cui sono state sottoposte le
forme procicliche dei
Tripanosomi mostrano che la
motilità può essere seriamente
compromessa mentre la
proliferazione cellulare rimane
inalterata.
Uso della stessa tecnica di RNAi
inducibile contro 5 proteine del TbFP
della forma sanguigna.
Tutte le 5 analisi risultano in un
Trypanosoma che non completa la
citochinesi, formando cellule mostruose
incapaci di proliferare.
Trypanosoma
1
Kinetoplasto
1 Nucleo
1K1N
Sono replicati 1
volta durante il
ciclo cellulare
RNAi induced
Le cellule cessano di dividersi
ma continuano a progredire
attraverso il ciclo cellulare.
Le cellule iniziano nuovi cicli di
fase S e mitosi,portando a
grandi cellule contorte
contenenti più Kinetoplasti e
più nuclei
MOSTRI
Cellule 4K4N e cellule 8K8N
Cellule non indotte
hanno morfologia
normale,
producendo un nuovo
flagello durante il
ciclo cellulare prima
della citochinesi,
con il flagello che
emerge dal
pacchetto flegellare
e che si estende
lungo il
Trypanosoma
In seguito ad induzione con RNAi e ablazione di PFR2
eTAX1, le cellule producono un nuovo flagello ma non
completano la divisione e perdono tutti i normali assi
morfogenetici diventando contorte e multiflagellate.
La spiegazione del fenotipo letale nelle
cellule circolanti è che la citochinesi
fallisce come primo evento in assenza della
corretta motilità flagellare
I cicli cellulari successivi formano nuovi
flagelli in posizioni inappropriate
La mancanza di assi morfogenetici precisi
compromette l’equilibrio membrana/
citoscheletro durante la morfogenesi del
pocket flagellare
La compromissione della funzione
flagellare cui consegue
l’incapacità del parassita di
dividersi “POTREBBE” aprire
una nuova prospettiva per il
controllo della malattia.