rilievi virologici ed istopatologici in agnelli e capretti con

Large Animals Review, Anno 6, n. 2, Aprile 2000
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RILIEVI VIROLOGICI ED ISTOPATOLOGICI
IN AGNELLI E CAPRETTI
CON INFEZIONE DA PESTIVIRUS
V. MARTELLA1, A. PRATELLI1, E. BOLLO2, D. BUONAVOGLIA3, A. PERILLO1,
G. GRECO1, F. GUARDA2, C. BUONAVOGLIA1
1
Dipartimento di Sanità e Benessere Animale - Facoltà di Medicina Veterinaria - Bari
2
Dipartimento di Patologia Animale - Facoltà di Medicina Veterinaria - Torino
3
Istituto di Malattie Infettive – Facoltà di Medicina Veterinaria - Messina
Summary
Virological and histopathological investigations on 6 lambs and 2 kids still birth and dead at 1-2 weeks of age showing severe enteric symptoms are reported. From the organs of all the animals (spleen, brain, thimus) pestivirus strains were isolated on lamb kidney cell coltures (IRO4) and typed as Bovine Viral Diarrhoea Virus (BVDV) or Border Disease Virus (BDV) by
RT-PCR assay. The histopatological lesions consisted of areas of hypomyelination in the brain, and a slight depletion of thymic medullary lymphocytes associated with increase in reticular cells.
INTRODUZIONE
La Border Disease (BD) è una patologia infettiva degli
ovini e dei caprini sostenuta da un virus, Border Disease
virus (BDV), appartenente alla famiglia Flaviviridae1;2, genere pestivirus. BDV è antigenicamente correlato ad altri
due virus inclusi nel genere pestivirus: il virus della Diarrea Virale del bovino (BVDV)3;4 ed il virus della Peste Suina Classica (PSC). Le prime segnalazioni della malattia,
fornite da pastori britannici, risalgono al secolo scorso, ma
la prima descrizione ufficiale è stata fatta solo nel 19595.
La malattia, indicata con il termine “Border Disease” in
quanto inizialmente osservata al confine (border) tra l’Inghilterra e il Galles, risulta attualmente diffusa in diversi
Paesi6;7;8;9;10;11;12, e anche in Italia13, soprattutto nelle regioni
meridionali e insulari14.
L’infezione da BDV negli animali adulti determina infezioni subcliniche15;16;17; nelle pecore gravide il virus supera
la barriera placentare ed infetta il feto che, se non ha ancora raggiunto l’immunocompetenza, nascerà immunotollerante verso BDV e con infezione persistente (i.p.)18.
Gli agnelli immunotolleranti presentano alterazioni del
sistema nervoso centrale, tremori muscolari, alterazioni del
tegumento19 e dell’apparato scheletrico20;21;22.
Frequentemente tuttavia l’infezione da BDV decorre in
maniera subdola. Gli animali possono nascere disvitali, e
possono presentare patologie non direttamente indicative
di una infezione da BDV (enteriti e polmoniti). Questi
soggetti, generalmente, muoiono nei primi giorni di vita.
Un altro aspetto particolare dell’infezione da pestivirus è
legato alla possibile circolazione interspecie (bovino-ovinosuino) di questi virus. Uno stipite virale isolato può essere
quindi caratterizzato come BVDV, BDV, PSC solo con l’impiego di raffinate metodiche di biologia molecolare, e non
solo in base alla specie di origine. Il risultato della digestione
con le endonucleasi di restrizione AvaI (Anabaena variabilis)
e BglI (Bacillus glabigii) di un amplificato PCR ottenuto da
uno stipite pestivirus può permettere di suddividere i pestivirus in tre genogruppi: stipiti PSC (1° genogruppo), stipiti
BVDV-like (2° genogruppo), stipiti BDV (3° genogruppo)23.
Recentemente, tuttavia è stato messo a punto un test PCR in
grado di amplificare solo il genoma di BDV24.
(OVI-CAPRINI)
Vengono riportati i risultati di esami virologici ed istopatologici effettuati su 6 agnelli e 2 capretti nati disvitali e morti nelle
prime due settimane di vita con una grave forma di enterite. Dagli organi di tutti gli animali (milza, timo, cervello) sono stati
isolati su cellule di rene ovino (IRO4) stipiti pestivirus successivamente tipizzati con la tecnica PCR come Bovine Viral
Diarrhoea Virus (BVDV) o Border Disease Virus (BDV). Gli esami istopatologici hanno evidenziato aree di ipomielinogenesi nel
sistema nervoso centrale, e deplezione linfocitaria a carico della porzione midollare del timo, associata a proliferazione delle
cellule del reticolo.
ALTRE SPECIE
Riassunto
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Rilievi virologici ed istopatologici in agnelli e capretti con infezioni da pestivirus
FIGURA 1 - Agnello con infezione da pestivirus.
FIGURA 2 - Timo di agnello normale e timo ipoplasico di agnello con infezione da pestivirus.
Gli esami virologici sono stati effettuati sugli organi di 8
animali (6 agnelli e 2 capretti). L’esame anatomo-patologico,
oltre alla grave forma di enterite catarrale, aveva evidenziato
in tutti i soggetti atrofia del timo (Fig. 2) ed ipoplasia del cervelletto. I pool di cervello, milza e timo di ciascun animale,
sono stati omogenati al 10% (p/v) in D-MEM, e dopo centrifugazione e trattamento con antibiotici, sono stati inoculati su
monostrati di cellule di rene di agnello in linea continua,
IRO4 (Merial, Lione - Francia) esenti da pestivirus contaminanti e fatte sviluppare su vetrini. Dopo 5 giorni di incubazione in termostato a CO2, i vetrini, previa fissazione in acetone,
sono stati sottoposti ad IFI, utilizzando anticorpi monoclonali specifici per pestivirus. In assenza di positività al test IFI
ciascun campione è stato passato su cellule almeno tre volte.
per pestivirus. Allo scopo le cellule, dopo l’eliminazione del
terreno, sono state tripsinizzate con una soluzione di tripsina
e versene (STV) e pellettate. Per l’estrazione è stato utilizzato
il kit di estrazione di RNA (RNeasy Total RNA Kit - Qiagen
GmbH - Germany).
La RT-PCR è stata eseguita con due diverse coppie di primers: la prima, 324/326 (324: 5’-ATG CCC WTA GTA
GGA CTA GCA-3’; 326: 5’-TCA ACT CCA TGT GCC
ATG TAC-3’), amplifica un frammento di 287 bp in comune
a tutti i pestivirus, mentre la seconda coppia, PBD1/PBD2
(PBD1: 5’-TCG TGG TGA GAT CCC TGA G-3’; PBD2: 5’GCA GAG ATT TTT TAT ACT AGC CTA TWC-3’), amplifica un frammento di 230 bp specifico per BDV24.
Per la prima coppia di primers la sintesi di c-DNA è stata
realizzata in un volume di reazione totale di 20 µl contenente 2,5 µl di RNA, PCR buffer 10x (KCl 500 mM, Tris-HCl
100 mM, pH 8,3), MgCl2 25 mM, 1,25 mM di ciascun oligonucleotide trifosfato, RNasi 20 U/µl, RT 50 U/µl, primer
326 0,6 µg/µl. Per la seconda coppia, la sintesi di c-DNA è
stata eseguita secondo la metodica indicata dalla ditta
Perkin-Elmer. In entrambi i casi la sintesi di c-DNA è stata
condotta a 37°C per 30’ con una fase finale di 94°C per 5’.
La PCR con la coppia di primers 324-326 è avvenuta in un
volume totale di reazione di 100 µl contenente PCR buffer
10x, MgCl2 25 mM, 2 mM di ciascun oligonucleotide trifosfato, Amplitaq DNA polimerasi 5U, primer 324 0,6 µg/µl.
Con i primers PBD1 e PBD2 il volume totale di reazione è
stato di 50 µl contenente PCR buffer 10x, MgCl2 25 mM, 2
mM di ciascun oligonucleotide trifosfato, Amplitaq DNA
polimerasi 5U, PBD1 10 pmol/µl, PBD2 10 pmol/µl, RNA 3
µl. La reazione di amplificazione è stata effettuata in un
DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, USA)
per 34 cicli: denaturazione a 94°C per 1’, allineamento a
56°C per 1’ e polimerizzazione a 72°C per 1’.
Otto µl di amplificato sono stati posti su gel di agarosio
al 2,5% e sottoposti a elettroforesi a 65 V per 90’. La visualizzazione è stata fatta con transilluminatore a UV dopo
colorazione con etidio bromuro.
RT-PCR
Enzimi di restrizione
L’estrazione dell’RNA virale è stata realizzata a partire
dai monostrati di cellule IRO4 risultate positive al test IFI
Per la definizione del genogruppo di appartenenza degli
stipiti isolati, l’amplificato ottenuto con la coppia di pri-
Nella presente nota si riportano i risultati di esami virologici ed istopatologici effettuati su agnelli e capretti disvitali, morti nella prima settimana di vita con sintomi a carico dell’apparato gastroenterico.
MATERIALI E METODI
Allevamenti esaminati
L’indagine è stata condotta in diversi allevamenti ovicaprini del sud Italia nei quali erano stati segnalati casi di
aborto, nonché la nascita di agnelli e capretti disvitali
(Fig. 1) che, generalmente, morivano nelle prime settimane di vita, con una grave forma di enterite catarrale emorragica associata a meteorismo e anoressia. In tutti gli allevamenti era stata effettuata la vaccinazione nei confronti
delle clostridiosi. Gli esami batteriologici eseguiti sugli
animali morti avevano permesso di evidenziare in tutti i
soggetti la presenza di Clostridium spp.
Esami virologici
Large Animals Review, Anno 6, n. 2, Aprile 2000
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FIGURA 3 - Immunofluorescenza Indiretta su monostrato cellulare infetto con uno stipite non citopatico di pestivirus.
(OVI-CAPRINI)
ALTRE SPECIE
mers 324/326 è stato sottoposto a digestione con gli enzimi di restrizione AvaI e BglI secondo quanto descritto da
Vilcek23. La digestione è avvenuta in un volume totale di
reazione di 50 µl a 37°C per 2h. I frammenti ottenuti dalla reazione enzimatica sono stati separati mediante corsa
elettroforetica in gel di agarosio al 2,5% e visualizzati
con transilluminatore a UV dopo colorazione con etidio
bromuro.
Esami istologici
Per gli esami istologici, porzioni di encefalo e timo sono
stati fissati in formalina tamponata al 10%, inclusi in paraffina e sezionati allo spessore di 4 µm. Le sezioni sono
state sottoposte a colorazione con ematossilina-eosina e
osservate al microscopio ottico. Sulle sezioni di encefalo è
stata inoltre eseguita la colorazione con Luxol Fast Blue
per la mielina.
RISULTATI
Da tutti gli organi degli 8 animali esaminati, sono stati
isolati su cellule 8 stipiti pestivirus non citopatici evidenziati con il test IFI con anticorpi monoclonali (Fig. 3).
La PCR effettuata sulle cellule positive al test IFI utilizzando la coppia di primers 324/326 ha generato, secondo
quanto atteso, un amplificato di 287 bp (Fig. 4). Gli amplificati delle PCR, sottoposti a digestione con gli enzimi
di restrizione AvaI e BglI, sono stati tagliati solo dall’enzima AvaI (Fig. 5), permettendo quindi di classificare gli stipiti pestivirus esaminati come appartenenti al 2° genogruppo (BVDV-like).
La PCR con la coppia di primers PBD1/PBD2 specifica
per BDV, ha generato un amplificato di 230 bp sulle cellule inoculate con i pool di organi di 2 agnelli (Fig. 6).
L’esame istologico eseguito sul sistema nervoso centrale
ha evidenziato aree di edema ed ipomielinogenesi caratterizzate da una diffusa vacuolizzazione della sostanza bianca (Figg. 7 e 8). In un soggetto si è inoltre rilevata disarchitettura generalizzata del tessuto nervoso. Per quanto riguarda il timo, l’esame istopatologico ha evidenziato una
deplezione dei linfociti a carico della porzione midollare,
FIGURA 4 - PCR con la coppia di primers 324/326. Linea 1: Marker
(pGem, Promega); linea 2: campione positivo per pestivirus (287bp).
con proliferazione delle cellule del reticolo (Figg. 9 e 10).
In un soggetto la deplezione linfocitaria appariva più
pronunciata, e risultava associata ad assenza di demarcazione tra porzioni corticali e midollari. Sono stati
inoltre osservati fenomeni degenerativi dei corpuscoli
di Hassal con fenomeni di ipercheratosi e paracheratosi
(Figg. 11 e 12).
DISCUSSIONE
La patologia neonatale rappresenta una delle cause più
frequenti di mortalità degli agnelli e dei capretti e, generalmente, si estrinseca con gravi forme di enterite associata ad infezione da Escherichia coli o, soprattutto, da
Clostridium perfringens. La mortalità degli animali, i costi
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Rilievi virologici ed istopatologici in agnelli e capretti con infezioni da pestivirus
FIGURA 7 - Cervello di agnello: edema e ipomielonogenesi. (Ematossilina-Eosina; forte ingrandimento).
FIGURA 5 - Digestione con le endonucleasi AvaI e BglI di un amplificato
PCR (287 bp) di pestivirus del II genogruppo. Linea 1: Marker (pGem,
Promega); linea 2: amplificato tagliato da AvaI (117 bp, 171 bp); linea
3: amplificato non tagliato da BglI.
FIGURA 8 - Cervello di agnello (corteccia cerebrale): edema. (Ematossilina-Eosina; piccolo ingrandimento).
FIGURA 9 - Timo di agnello: deplezione linfoide con scomparsa di parte
midollare. (Ematossilina-Eosina; piccolo ingrandimento).
FIGURA 6 - PCR con la coppia di primers PBD1/PBD2. Linea 1: Marker
(pGem, Promega); linea 2: controllo negativo; linea 3: stipite BDV
(230bp).
delle terapie farmacologiche, i ritardati incrementi ponderali, possono causare danni economici rilevanti che,
spesso, non vengono limitati neanche con l’adozione di
misure di profilassi diretta o indiretta (vaccinazioni per le
clostridiosi).
Negli ultimi anni i pestivirus dei ruminanti hanno assunto un ruolo fondamentale nel complesso quadro della
patologia infettiva, sia come patogeni primari in grado
In effetti, i risultati delle prove effettuate negli allevamenti esaminati nel presente studio, permettono di ritenere che la patologia neonatale possa essere una conseguenza
dell’infezione da pestivirus e che, in qualche misura, quest’ultimi possano determinare una esaltazione della stessa.
Le lesioni istologiche più significative sono state osservate oltre che a carico del cervelletto anche nel timo, e
quest’ultimo dato può giustificare la condizione di immunodepressione degli animali.
Un dato interessante è emerso dalla caratterizzazione
degli stipiti isolati. In base ai risultati dell’analisi con gli
enzimi di restrizione, gli stipiti dovrebbero essere considerati appartenenti al secondo genogruppo (BVDV-like) in
quanto sono stati tagliati solo da AvaI23. Tuttavia il test
PCR con i primers PBD1/PBD2 ha permesso di identificare 2 stipiti BDV tipici, confermando che la PCR è sicuramente uno dei test più affidabili per la caratterizzazione
dei pestivirus.
I risultati della presente indagine hanno inoltre evidenziato che, dagli ovini e dai caprini, a conferma della spiccata circolazione interspecie dei pestivirus, possono essere
frequentemente isolati stipiti BVDV, in grado di causare
sintomi e lesioni sovrapponibili a quelle causate da BDV, e
che la caratterizzazione dei pestivirus, come BVDV o
BDV, non può quindi essere effettuata solo in base alla
specie di origine del virus.
Abbreviazioni
FIGURA 11 - Timo di agnello: fenomeni di ipercheratosi. (EmatossilinaEosina; medio ingrandimento).
D-MEM: Dulbecco-Minimal Essential Medium; IFI: Immunofluorescenza Indiretta; RT-PCR: Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction.
Parole Chiave
Pestivirus, piccoli ruminanti, esami virologici, lesioni istologiche.
Key words
Pestivirus, small ruminants, virological essay, histological
lesions.
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a ipercheratosi. (Ematossilina-Eosina; forte ingrandimento).
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cioè di causare aborti ed ipofertilità, e sia come “key
agents”, in grado cioè di esaltare, grazie alla loro azione
immunodepressiva, il potere patogeno di altri microrganismi. Quest’ultima caratteristica dei pestivirus può fornire utili elementi per valutare in maniera corretta i reali
meccanismi che permettono l’insorgenza delle patologie
condizionate e, in particolare, della patologia neonatale
degli ovi-caprini.
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(OVI-CAPRINI)
FIGURA 10 - Timo di agnello: stesso quadro della Figura 9. (Ematossilina-Eosina; medio ingrandimento).
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