Large Animals Review, Anno 6, n. 2, Aprile 2000 73 RILIEVI VIROLOGICI ED ISTOPATOLOGICI IN AGNELLI E CAPRETTI CON INFEZIONE DA PESTIVIRUS V. MARTELLA1, A. PRATELLI1, E. BOLLO2, D. BUONAVOGLIA3, A. PERILLO1, G. GRECO1, F. GUARDA2, C. BUONAVOGLIA1 1 Dipartimento di Sanità e Benessere Animale - Facoltà di Medicina Veterinaria - Bari 2 Dipartimento di Patologia Animale - Facoltà di Medicina Veterinaria - Torino 3 Istituto di Malattie Infettive – Facoltà di Medicina Veterinaria - Messina Summary Virological and histopathological investigations on 6 lambs and 2 kids still birth and dead at 1-2 weeks of age showing severe enteric symptoms are reported. From the organs of all the animals (spleen, brain, thimus) pestivirus strains were isolated on lamb kidney cell coltures (IRO4) and typed as Bovine Viral Diarrhoea Virus (BVDV) or Border Disease Virus (BDV) by RT-PCR assay. The histopatological lesions consisted of areas of hypomyelination in the brain, and a slight depletion of thymic medullary lymphocytes associated with increase in reticular cells. INTRODUZIONE La Border Disease (BD) è una patologia infettiva degli ovini e dei caprini sostenuta da un virus, Border Disease virus (BDV), appartenente alla famiglia Flaviviridae1;2, genere pestivirus. BDV è antigenicamente correlato ad altri due virus inclusi nel genere pestivirus: il virus della Diarrea Virale del bovino (BVDV)3;4 ed il virus della Peste Suina Classica (PSC). Le prime segnalazioni della malattia, fornite da pastori britannici, risalgono al secolo scorso, ma la prima descrizione ufficiale è stata fatta solo nel 19595. La malattia, indicata con il termine “Border Disease” in quanto inizialmente osservata al confine (border) tra l’Inghilterra e il Galles, risulta attualmente diffusa in diversi Paesi6;7;8;9;10;11;12, e anche in Italia13, soprattutto nelle regioni meridionali e insulari14. L’infezione da BDV negli animali adulti determina infezioni subcliniche15;16;17; nelle pecore gravide il virus supera la barriera placentare ed infetta il feto che, se non ha ancora raggiunto l’immunocompetenza, nascerà immunotollerante verso BDV e con infezione persistente (i.p.)18. Gli agnelli immunotolleranti presentano alterazioni del sistema nervoso centrale, tremori muscolari, alterazioni del tegumento19 e dell’apparato scheletrico20;21;22. Frequentemente tuttavia l’infezione da BDV decorre in maniera subdola. Gli animali possono nascere disvitali, e possono presentare patologie non direttamente indicative di una infezione da BDV (enteriti e polmoniti). Questi soggetti, generalmente, muoiono nei primi giorni di vita. Un altro aspetto particolare dell’infezione da pestivirus è legato alla possibile circolazione interspecie (bovino-ovinosuino) di questi virus. Uno stipite virale isolato può essere quindi caratterizzato come BVDV, BDV, PSC solo con l’impiego di raffinate metodiche di biologia molecolare, e non solo in base alla specie di origine. Il risultato della digestione con le endonucleasi di restrizione AvaI (Anabaena variabilis) e BglI (Bacillus glabigii) di un amplificato PCR ottenuto da uno stipite pestivirus può permettere di suddividere i pestivirus in tre genogruppi: stipiti PSC (1° genogruppo), stipiti BVDV-like (2° genogruppo), stipiti BDV (3° genogruppo)23. Recentemente, tuttavia è stato messo a punto un test PCR in grado di amplificare solo il genoma di BDV24. (OVI-CAPRINI) Vengono riportati i risultati di esami virologici ed istopatologici effettuati su 6 agnelli e 2 capretti nati disvitali e morti nelle prime due settimane di vita con una grave forma di enterite. Dagli organi di tutti gli animali (milza, timo, cervello) sono stati isolati su cellule di rene ovino (IRO4) stipiti pestivirus successivamente tipizzati con la tecnica PCR come Bovine Viral Diarrhoea Virus (BVDV) o Border Disease Virus (BDV). Gli esami istopatologici hanno evidenziato aree di ipomielinogenesi nel sistema nervoso centrale, e deplezione linfocitaria a carico della porzione midollare del timo, associata a proliferazione delle cellule del reticolo. ALTRE SPECIE Riassunto 74 Rilievi virologici ed istopatologici in agnelli e capretti con infezioni da pestivirus FIGURA 1 - Agnello con infezione da pestivirus. FIGURA 2 - Timo di agnello normale e timo ipoplasico di agnello con infezione da pestivirus. Gli esami virologici sono stati effettuati sugli organi di 8 animali (6 agnelli e 2 capretti). L’esame anatomo-patologico, oltre alla grave forma di enterite catarrale, aveva evidenziato in tutti i soggetti atrofia del timo (Fig. 2) ed ipoplasia del cervelletto. I pool di cervello, milza e timo di ciascun animale, sono stati omogenati al 10% (p/v) in D-MEM, e dopo centrifugazione e trattamento con antibiotici, sono stati inoculati su monostrati di cellule di rene di agnello in linea continua, IRO4 (Merial, Lione - Francia) esenti da pestivirus contaminanti e fatte sviluppare su vetrini. Dopo 5 giorni di incubazione in termostato a CO2, i vetrini, previa fissazione in acetone, sono stati sottoposti ad IFI, utilizzando anticorpi monoclonali specifici per pestivirus. In assenza di positività al test IFI ciascun campione è stato passato su cellule almeno tre volte. per pestivirus. Allo scopo le cellule, dopo l’eliminazione del terreno, sono state tripsinizzate con una soluzione di tripsina e versene (STV) e pellettate. Per l’estrazione è stato utilizzato il kit di estrazione di RNA (RNeasy Total RNA Kit - Qiagen GmbH - Germany). La RT-PCR è stata eseguita con due diverse coppie di primers: la prima, 324/326 (324: 5’-ATG CCC WTA GTA GGA CTA GCA-3’; 326: 5’-TCA ACT CCA TGT GCC ATG TAC-3’), amplifica un frammento di 287 bp in comune a tutti i pestivirus, mentre la seconda coppia, PBD1/PBD2 (PBD1: 5’-TCG TGG TGA GAT CCC TGA G-3’; PBD2: 5’GCA GAG ATT TTT TAT ACT AGC CTA TWC-3’), amplifica un frammento di 230 bp specifico per BDV24. Per la prima coppia di primers la sintesi di c-DNA è stata realizzata in un volume di reazione totale di 20 µl contenente 2,5 µl di RNA, PCR buffer 10x (KCl 500 mM, Tris-HCl 100 mM, pH 8,3), MgCl2 25 mM, 1,25 mM di ciascun oligonucleotide trifosfato, RNasi 20 U/µl, RT 50 U/µl, primer 326 0,6 µg/µl. Per la seconda coppia, la sintesi di c-DNA è stata eseguita secondo la metodica indicata dalla ditta Perkin-Elmer. In entrambi i casi la sintesi di c-DNA è stata condotta a 37°C per 30’ con una fase finale di 94°C per 5’. La PCR con la coppia di primers 324-326 è avvenuta in un volume totale di reazione di 100 µl contenente PCR buffer 10x, MgCl2 25 mM, 2 mM di ciascun oligonucleotide trifosfato, Amplitaq DNA polimerasi 5U, primer 324 0,6 µg/µl. Con i primers PBD1 e PBD2 il volume totale di reazione è stato di 50 µl contenente PCR buffer 10x, MgCl2 25 mM, 2 mM di ciascun oligonucleotide trifosfato, Amplitaq DNA polimerasi 5U, PBD1 10 pmol/µl, PBD2 10 pmol/µl, RNA 3 µl. La reazione di amplificazione è stata effettuata in un DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, USA) per 34 cicli: denaturazione a 94°C per 1’, allineamento a 56°C per 1’ e polimerizzazione a 72°C per 1’. Otto µl di amplificato sono stati posti su gel di agarosio al 2,5% e sottoposti a elettroforesi a 65 V per 90’. La visualizzazione è stata fatta con transilluminatore a UV dopo colorazione con etidio bromuro. RT-PCR Enzimi di restrizione L’estrazione dell’RNA virale è stata realizzata a partire dai monostrati di cellule IRO4 risultate positive al test IFI Per la definizione del genogruppo di appartenenza degli stipiti isolati, l’amplificato ottenuto con la coppia di pri- Nella presente nota si riportano i risultati di esami virologici ed istopatologici effettuati su agnelli e capretti disvitali, morti nella prima settimana di vita con sintomi a carico dell’apparato gastroenterico. MATERIALI E METODI Allevamenti esaminati L’indagine è stata condotta in diversi allevamenti ovicaprini del sud Italia nei quali erano stati segnalati casi di aborto, nonché la nascita di agnelli e capretti disvitali (Fig. 1) che, generalmente, morivano nelle prime settimane di vita, con una grave forma di enterite catarrale emorragica associata a meteorismo e anoressia. In tutti gli allevamenti era stata effettuata la vaccinazione nei confronti delle clostridiosi. Gli esami batteriologici eseguiti sugli animali morti avevano permesso di evidenziare in tutti i soggetti la presenza di Clostridium spp. Esami virologici Large Animals Review, Anno 6, n. 2, Aprile 2000 75 FIGURA 3 - Immunofluorescenza Indiretta su monostrato cellulare infetto con uno stipite non citopatico di pestivirus. (OVI-CAPRINI) ALTRE SPECIE mers 324/326 è stato sottoposto a digestione con gli enzimi di restrizione AvaI e BglI secondo quanto descritto da Vilcek23. La digestione è avvenuta in un volume totale di reazione di 50 µl a 37°C per 2h. I frammenti ottenuti dalla reazione enzimatica sono stati separati mediante corsa elettroforetica in gel di agarosio al 2,5% e visualizzati con transilluminatore a UV dopo colorazione con etidio bromuro. Esami istologici Per gli esami istologici, porzioni di encefalo e timo sono stati fissati in formalina tamponata al 10%, inclusi in paraffina e sezionati allo spessore di 4 µm. Le sezioni sono state sottoposte a colorazione con ematossilina-eosina e osservate al microscopio ottico. Sulle sezioni di encefalo è stata inoltre eseguita la colorazione con Luxol Fast Blue per la mielina. RISULTATI Da tutti gli organi degli 8 animali esaminati, sono stati isolati su cellule 8 stipiti pestivirus non citopatici evidenziati con il test IFI con anticorpi monoclonali (Fig. 3). La PCR effettuata sulle cellule positive al test IFI utilizzando la coppia di primers 324/326 ha generato, secondo quanto atteso, un amplificato di 287 bp (Fig. 4). Gli amplificati delle PCR, sottoposti a digestione con gli enzimi di restrizione AvaI e BglI, sono stati tagliati solo dall’enzima AvaI (Fig. 5), permettendo quindi di classificare gli stipiti pestivirus esaminati come appartenenti al 2° genogruppo (BVDV-like). La PCR con la coppia di primers PBD1/PBD2 specifica per BDV, ha generato un amplificato di 230 bp sulle cellule inoculate con i pool di organi di 2 agnelli (Fig. 6). L’esame istologico eseguito sul sistema nervoso centrale ha evidenziato aree di edema ed ipomielinogenesi caratterizzate da una diffusa vacuolizzazione della sostanza bianca (Figg. 7 e 8). In un soggetto si è inoltre rilevata disarchitettura generalizzata del tessuto nervoso. Per quanto riguarda il timo, l’esame istopatologico ha evidenziato una deplezione dei linfociti a carico della porzione midollare, FIGURA 4 - PCR con la coppia di primers 324/326. Linea 1: Marker (pGem, Promega); linea 2: campione positivo per pestivirus (287bp). con proliferazione delle cellule del reticolo (Figg. 9 e 10). In un soggetto la deplezione linfocitaria appariva più pronunciata, e risultava associata ad assenza di demarcazione tra porzioni corticali e midollari. Sono stati inoltre osservati fenomeni degenerativi dei corpuscoli di Hassal con fenomeni di ipercheratosi e paracheratosi (Figg. 11 e 12). DISCUSSIONE La patologia neonatale rappresenta una delle cause più frequenti di mortalità degli agnelli e dei capretti e, generalmente, si estrinseca con gravi forme di enterite associata ad infezione da Escherichia coli o, soprattutto, da Clostridium perfringens. La mortalità degli animali, i costi 76 Rilievi virologici ed istopatologici in agnelli e capretti con infezioni da pestivirus FIGURA 7 - Cervello di agnello: edema e ipomielonogenesi. (Ematossilina-Eosina; forte ingrandimento). FIGURA 5 - Digestione con le endonucleasi AvaI e BglI di un amplificato PCR (287 bp) di pestivirus del II genogruppo. Linea 1: Marker (pGem, Promega); linea 2: amplificato tagliato da AvaI (117 bp, 171 bp); linea 3: amplificato non tagliato da BglI. FIGURA 8 - Cervello di agnello (corteccia cerebrale): edema. (Ematossilina-Eosina; piccolo ingrandimento). FIGURA 9 - Timo di agnello: deplezione linfoide con scomparsa di parte midollare. (Ematossilina-Eosina; piccolo ingrandimento). FIGURA 6 - PCR con la coppia di primers PBD1/PBD2. Linea 1: Marker (pGem, Promega); linea 2: controllo negativo; linea 3: stipite BDV (230bp). delle terapie farmacologiche, i ritardati incrementi ponderali, possono causare danni economici rilevanti che, spesso, non vengono limitati neanche con l’adozione di misure di profilassi diretta o indiretta (vaccinazioni per le clostridiosi). Negli ultimi anni i pestivirus dei ruminanti hanno assunto un ruolo fondamentale nel complesso quadro della patologia infettiva, sia come patogeni primari in grado In effetti, i risultati delle prove effettuate negli allevamenti esaminati nel presente studio, permettono di ritenere che la patologia neonatale possa essere una conseguenza dell’infezione da pestivirus e che, in qualche misura, quest’ultimi possano determinare una esaltazione della stessa. Le lesioni istologiche più significative sono state osservate oltre che a carico del cervelletto anche nel timo, e quest’ultimo dato può giustificare la condizione di immunodepressione degli animali. Un dato interessante è emerso dalla caratterizzazione degli stipiti isolati. In base ai risultati dell’analisi con gli enzimi di restrizione, gli stipiti dovrebbero essere considerati appartenenti al secondo genogruppo (BVDV-like) in quanto sono stati tagliati solo da AvaI23. Tuttavia il test PCR con i primers PBD1/PBD2 ha permesso di identificare 2 stipiti BDV tipici, confermando che la PCR è sicuramente uno dei test più affidabili per la caratterizzazione dei pestivirus. I risultati della presente indagine hanno inoltre evidenziato che, dagli ovini e dai caprini, a conferma della spiccata circolazione interspecie dei pestivirus, possono essere frequentemente isolati stipiti BVDV, in grado di causare sintomi e lesioni sovrapponibili a quelle causate da BDV, e che la caratterizzazione dei pestivirus, come BVDV o BDV, non può quindi essere effettuata solo in base alla specie di origine del virus. Abbreviazioni FIGURA 11 - Timo di agnello: fenomeni di ipercheratosi. (EmatossilinaEosina; medio ingrandimento). D-MEM: Dulbecco-Minimal Essential Medium; IFI: Immunofluorescenza Indiretta; RT-PCR: Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction. Parole Chiave Pestivirus, piccoli ruminanti, esami virologici, lesioni istologiche. Key words Pestivirus, small ruminants, virological essay, histological lesions. Bibliografia 1. FIGURA 12 - Timo di agnello. Corpuscoli di Hassal degenerati associati a ipercheratosi. (Ematossilina-Eosina; forte ingrandimento). 2. 3. cioè di causare aborti ed ipofertilità, e sia come “key agents”, in grado cioè di esaltare, grazie alla loro azione immunodepressiva, il potere patogeno di altri microrganismi. Quest’ultima caratteristica dei pestivirus può fornire utili elementi per valutare in maniera corretta i reali meccanismi che permettono l’insorgenza delle patologie condizionate e, in particolare, della patologia neonatale degli ovi-caprini. 4. 5. 6. 7. Collett, M.S., Anderson, D.K., Retzel, E. Comparisons of the pestivirus bovine viral diarrhoea virus with the members of the Flaviviridae. J. Gen. Virol., 69:2637, 1988. Francki, R.I.B., Fauquet, C.M., Knudson, D.L., Brown, F. Classification and Nomenclature of Viruses. 5th report of the International Commitee on Taxonomy of Viruses. Arch. Virol., 2:228, 1991. Akkina, R.K., Raisch, K.P. Intracellular virus-induced polypeptides of pestivirus border disease virus. Virus Res., 16:95, 1990. Moennig, V., Plagemann, P.G.W. The pestiviruses, Adv. Vir. Res., 41:53, 1992. Hughes L.E., Kershaw G.F., Shaw I.G. “B” or Border disease. An undescribed disease in sheep. Vet. Rec., 71:313, 1959. Cravero, G.C., Fatzer, R., Fankhauser, R. Border-Krankheit (Hypomyelinogenesis congenita) bei Lammern in der Schweitz. Schw Arch Tierheil, 117:119, 1975. Liess, B., Blindow, H., Orban, S., Sasse-Patze, B., Frey, H.R., Timm, D. Aborte, totgeburten, kummern, lammersterben in zwei schafherden nordwest-deutschlands. “Border disease” in der Bundesrepublik. (OVI-CAPRINI) FIGURA 10 - Timo di agnello: stesso quadro della Figura 9. (Ematossilina-Eosina; medio ingrandimento). 77 ALTRE SPECIE Large Animals Review, Anno 6, n. 2, Aprile 2000 78 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Rilievi virologici ed istopatologici in agnelli e capretti con infezioni da pestivirus Deuts Tierarz Wochens, 89:6, 1982. Brugere-Picoux, J., Maes, H., Moussa, A., Russo, P., Parodi, A.L. Identification de la “Border disease” ou “maladie de la frontière” chez le mouton en france. Bull. Acad. Vet. Fr., 57:555, 1984. Jackson, T.A., Osburn, B.I., Crenshaw, G.I. Experimental production of hairy fleece and chorea in Californian lambs. Vet. Rec., 91:223, 1972. Acland, H.M., Gard, G.P., Plant, J.W. Infection of sheep with mucosal disease virus. Austr. Vet. J., 48:70, 1972. Porter, W.L., Lewis, K.H.C., Manktelow, B.W. Hairy shaker disease in lambs: acquired immunity, abortions and trasmission via mucous membranes. New Zealand Vet. J., 20:1, 1972. Physick-Sheard, P.W., Hopkins, J.B., O’Connor, R.D. A Border disease-like syndrome in a southern Ontario sheep flock. Can. Vet. J., 21:53, 1980. Buonavoglia C., Tempesta M., Marsilio F., Buonavoglia D., Gatti A., Sands J.J., Compagnucci M. Border disease degli ovi-caprini: nota sull’isolamento e caratterizzazione del virus in Italia. Odv, 12:47, 1991. Buonavoglia C., Marsilio F., Tempesta M., Buonavoglia D., Cavalli A. Persistent pestivirus infection in sheep in Apulia (Southern Italy). Microbiologica, 17:163, 1994. Shaw, I.G., Winkler, C.E., Gibbons, D.F., Terlecki, S., Hebert, C.N., Patterson, D.S.P., Done, J.T. Border disease of sheep: vaccination of ewes before mating. Vet. Rec., 84:147, 1969. Ward, G.M. Experimental infection of pregnant sheep with bovine viral 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. diarrhea-mucosal disease virus. Cornell Veterinarian, 61:179, 1971. Vantsis, J.T., Barlow, R.M., Fraser, J., Rennie, J.C., Mould, D.L. Experiments in Border disease. VIII. Propagation and properties of a cytopathic virus. J. Comp. Pathol., 85:111, 1976. Westbury, H.A., Napthine, D.V., Straube, E. Border disease: persistent infection with the virus. Vet. Rec., 104:406, 1979. Eliot, M., Toma, B. Border disease. Point Veteriner, 15/72:55, 1983. Barlow, R.M., Vantsis, J.T., Gardiner, A.C., Linklater, K.A. The definition of Border disease: problems for the diagnostician. Vet. Rec., 104:334, 1979. Plant, J.W., Acland, H.M., Gard, G.P., Walker, K.H. Clinical variations of border disease in sheep according to the source of the inoculum. Vet. Rec., 113:58, 1983a. Plant, J.W., Acland, H.M., Gard, G.P., Walker, K.H. Pathology in the ovine foetus caused by ovine pestivirus. Austr. Vet. J., 60:137, 1983b. Vilcek, S., Herring, A.J., Herring, J.A., Nettleton, P.F., Lowings, J.P., Paton, D.J. Pestiviruses isolated from pigs, cattle and sheep can be allocated into at least three genogroups using polymerase chain reaction and restriction endonuclease analysis. Arch. Virol., 136:309, 1994. Vilcek, S., Nettleton, P., Belak, S. The use of 5’NCR-noncoding region (5’NCR) for practical genetic detection and analysis of pestiviruses. European Symposium on Control of BVDV infection in Cattle, Lillehammer, Sept. 3-5, p.15, 1997.