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Virus della diarrea virale bovina (BVDV) tipo 3:
una minaccia emergente per i bovini?
N
N. DECARO1, V. MARI1, M.S. LUCENTE1, R. SCIARRETTA1, M. LOSURDO1, G. ELIA1,
I. PADALINO2, V. MARTELLA1, N. CAVALIERE2, P. CORDIOLI3, C. BUONAVOGLIA1
1
Dipartimento di Medicina Veterinaria - Università degli Studi di di Bari, Valenzano (BA)
Istituto Zooprofilattico Sperimentale di Puglia e Basilicata, Foggia
3
Istituto Zooprofilattico Sperimentale di Lombardia ed Emilia Romagna, Brescia
2
RIASSUNTO
In questa nota si riportano i dati clinici, patogenetici ed immunologici relativi all’infezione causata da un nuovo pestivirus,
Hobi virus o virus della diarrea virale bovina (BVDV) tipo 3, in Italia. Questo pestivirus emergente, identificato quasi dieci anni fa in un lotto di siero fetale bovino di provenienza brasiliana, fino a pochi anni fa era stato isolato solo in Sud America ed
Asia. Nel 2010 stipiti BVDV-3 sono stati identificati in Italia in bovini con malattia respiratoria e, successivamente, in aborti
osservati in un allevamento di bovine da latte della Calabria. Da una manza con sintomatologia respiratoria è stato possibile
isolare sia il biotipo non citopatogeno (ncp) che quello citopatogeno (cp) di BVDV-3, i quali differivano per la presenza in quest’ultimo di un inserto sovrapponibile a sequenze di origine bovina, associate in precedenza a stipiti cp di BVDV-1 e BVDV-2.
Indagini condotte sugli animali presenti in allevamento hanno permesso di identificare un vitello con infezione persistente
(PI), che è stato monitorato per circa sei mesi sia per gli aspetti clinici che per gli aspetti virologici. L’infezione sperimentale di
animali appartenenti a specie tradizionalmente sensibili ad altri pestivirus ha dimostrato che bovini ed ovini sono in grado di
infettarsi, sviluppando una forma clinica di tipo respiratorio ed eliminando il virus con secreti ed escreti, mentre i suini sieroconvertono in assenza di sintomatologia e di escrezione virale. La scarsa cross-reattività sierologica esistente tra BVDV-3 e
BVDV-1, valutata nel modello ovino, ha suscitato preoccupazioni sulla possibile mancata o incompleta protezione conferita
dai vaccini attualmente in commercio (allestiti con BVDV-1) nei confronti dell’infezione sostenuta da questo pestivirus emergente. Infine, è stato messo a punto un test diagnostico (nested PCR) per la identificazione e simultanea caratterizzazione molecolare di tutte le specie BVDV attualmente conosciute in campioni clinici. Indagini future dovranno accertare la reale circolazione di questo pestivirus nella popolazione bovina italiana valutando l’impatto dello stesso sulle produzioni zootecniche.
PAROLE CHIAVE
Bovino, diarrea virale bovina, Hobi pestivirus (BVDV-3).
INTRODUZIONE
Nei ruminanti domestici le infezioni da pestivirus sono associate ad una varietà di forme cliniche che includono infezioni subcliniche, immunodepressione, forme respiratorie, gastroenterite, turbe della riproduzione, forme emorragiche e
malattie sistemiche come la malattia delle mucose1,2.
I pestivirus (famiglia Flaviviridae, genere Pestivirus) sono
virus ad RNA monocatenario, a polarità positiva, codificante per una poliproteina, che è scissa, ad opera di proteasi cellulari e virali, in proteine strutturali (C, Erns, E1, E2) e non
strutturali (Npro, NS2-3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B)3. In base all’attuale classificazione dell’International Committee
on Taxonomy of Viruses (http://www.virustaxonomyon
line.com), il genere Pestivirus comprende quattro specie riconosciute: virus della diarrea virale bovina tipo 1 (BVDV1), virus della diarrea virale bovina tipo 2 (BVDV-2), virus
della border disease (BDV), virus della peste suina classica
Autore per la corrispondenza:
Nicola Decaro ([email protected]).
(CSFV). A queste è stato proposto di aggiungere una quinta
specie, Pestivirus della giraffa. Attualmente, pertanto, i pestivirus dei ruminanti comprendono due specie di BVDV,
BVDV-1 e BVDV-2, differenziabili su base genetica ed antigenica e, una sola specie di BDV, cui appartengono numerosi sottogruppi.
Recentemente nella specie bovina sono stati descritti diversi
pestivirus emergenti. Un pestivirus atipico è stato isolato da
un lotto di siero fetale bovino originario del Brasile4. Questo
virus, D32/00_“HoBi” è stato proposto come una nuova specie del genere Pestivirus, BVDV-35. Altri due pestivirus Hobi-like, ceppi CH-KaHo/Cont e Brz buf 9, sono stati identificati in Sud America rispettivamente in una coltura cellulare
probabilmente contaminata da siero fetale bovino infetto e
nel sangue di una bufala6. Fino a poco tempo fa, esisteva
un’unica sequenza del genoma completo di un pestivirus
HoBi-like, ceppo Th/04-KhonKaen, isolato da un siero bovino durante un’indagine epidemiologica per BVDV in Tailandia. Tuttavia, anche in questo caso non è noto se il virus era
associato o meno a manifestazioni cliniche7.
Nella presente nota vengono riportati i dati clinici, patogenetici ed immunologici relativi all’infezione da BVDV-3 in
Italia.
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BVDV-3 E MALATTIA RESPIRATORIA
Il focolaio di malattia respiratoria è stato osservato in un allevamento di bovine da latte della Calabria nel periodo compreso tra dicembre 2009 e febbraio 20108. L’allevamento, nel
quale si sono verificati anche i casi clinici riportati nei successivi paragrafi, era costituito da circa 600 soggetti di razza
frisona. Gli ultimi ingressi di animali si riferivano a 10 manze importate dalla Germania 22 mesi prima dell’insorgenza
della forma respiratoria. In allevamento venivano regolarmente somministrati interventi vaccinali per la profilassi di
clostridiosi, rotavirosi e coronavirosi, mentre non era effettuata alcuna vaccinazione per BVDV. Successivamente, subito dopo la diagnosi di infezione da pestivirus Hobi-like, si è
dato inizio ad un piano di profilassi specifica per BVDV.
Questo è stato attuato sia mediante la vaccinazione sistematica di tutto l’effettivo che mediante uno screening ripetuto
degli animali con lo scopo di identifcare ed abbattere gli immunotolleranti, principali diffusori del virus in allevamento.
I segni clinici hanno interessato 26 vitelli di 6-7 mesi di età,
su un totale di circa 100 soggetti della stessa età, i quali presentavano febbre (39,4-40,1°C), tosse, tachipnea e presenza
di scolo nasale sieromucoso. Gli esami ematologici condotti
su sei vitelli con sintomi hanno evidenziato una modesta
leucopenia, con valori compresi tra 2,55 e 3,52 × 109 leucociti/l (valori di riferimento 4-12 × 109 leucociti/l). Da questi
animali sono stati prelevati tamponi nasali per gli esami virologici e batteriologici. La maggior parte degli animali è
guarita progressivamente nell’arco di due settimane a seguito della somministrazione di terapia di supporto (antibiotici
e fluidoterapia). Due vitelli di 6 mesi con sintomatologia più
grave sono morti e l’esame autoptico ha evidenziato la presenza di broncopolmonite apicale e tracheite con presenza di
essudato catarrale. I lobi polmonari con lesioni sono stati
prelevati per le successive analisi.
Tutti i campioni analizzati sono risultati positivi al test nested PCR per la ricerca di pestivirus9 e sono stati caratterizzati come BVDV-2. Gli esami virologici, batteriologici e parassitologici hanno escluso la presenza negli stessi campioni
di altri patogeni, ad eccezione dei polmoni dei vitelli deceduti dai quali sono stati isolati Streptococcus bovis e Vibrio
spp. L’analisi di sequenza del frammento del gene Erns amplificato in nested PCR ha evidenziato una identità nucleotidica tra gli stipiti BVDV identificati nell’allevamento pari al
99,8-100%. Tuttavia, dall’analisi mediante BLAST è emerso
che l’identità nucleotidica con gli stipiti BVDV-2 maggiormente correlati non superava il 74%, mentre una più stretta
correlazione genetica (più del 90% di identità nucleotidica)
è stata dimostrata nei confronti del pestivirus atipico ‘Hobi’like Th/04_KhonKaen, proposto come nuova specie BVDV3. Mediante real-time RT-PCR specifica per BVDV-3, i campioni sono risultati contenere titoli di RNA virale compresi
tra 2,57 × 103 e 5,48 × 105 per µl di estratto. Gli stipiti BVDV
identificati nei polmoni dei vitelli morti sono stati isolati con
successo su cellule MDBK, come dimostrato dalla positività
al test di immunofluorescenza indiretta (IFI) effettuato con
un anticorpo monoclonale panpestivirus. Mediante prove di
RT-PCR e successivo sequenziamento, è stato possibile determinare quasi per intero il genoma dello stipite Italy-1/101, rappresentativo dei ceppi circolanti in allevamento. La sequenza ottenuta (12.104 nucleotidi) è stata depositata in
GenBank con il numero di accesso HQ231763.
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L’analisi comparativa ha dimostrato che lo stipite BVDV-3
isolato possiede la stessa organizzazione genomica degli altri
membri del genere Pestivirus, rappresentata da una ORF di
11.700 nucleotidi fiancheggiata da due regioni non codificanti (UTR). La più elevata identità nucleotidica (90%) è stata riscontrata nei confronti dello stipite BVDV-3 tailandese
Th/04_KhonKaen, mentre le identità con stipiti BVDV-1 e
BVDV-2 si sono attestate su valori molto più bassi, rispettivamente del 66,2-67% e del 67,1-67,4%. Valori simili sono
stati ottenuti dal confronto con ceppi BDV e CSFV di riferimento. Analizzando le regioni E2, 5’ UTR e Npro, lo stipite
Italy-1/10-1 è sempre stato caratterizzato come BVDV-3, ma
le correlazioni genetiche più elevate sono state evidenziate
nei confronti dei ceppi sudamericani D32/00_‘Hobi’ e CHKaHo/cont, dei quali sono disponibili solo sequenze parziali
di alcune regioni.
Mediante analisi filogenetica ottenuta con il metodo neighbor-joining sulla sequenza dell’intero genoma dello stipite
Italy-1/10-1 e di stipiti pestivirus di riferimento, risultano
evidenti sei cluster monofiletici (Fig. 1): BVDV-1, BVDV-2,
BVDV-3, BDV, CSFV e Pestivirus della giraffa. Nell’ambito di
questo albero, lo stipite Italy-1/10-1 ricade nello stesso gruppo del virus Th/04_KhonKaen, che risulta nettamente separato dagli altri membri del genere Pestivirus. L’analisi delle
singole regioni ha prodotto una segregazione sovrapponibile, nella quale lo stipite italiano segrega con gli stipiti sudamericani. La stessa topologia è stata ottenuta con il metodo
della parsimonia in tutte le regioni analizzate.
Figura 1 - Albero filogenetico costruito con il metodo neighbor-joining sull’intero genoma dei membri del genere Pestivirus. I seguenti stipiti sono stati utilizzati per l’analisi filogenetica (numeri di accesso GenBank indicati in parentesi): BDV H2121, Gifhorn, X818,
Reindeer; CSFV Brescia X, HCLV, Brescia, Alfort-A19, Shimen/HVRI,
Riems, CZ-J-2008; BVDV-1 ILLNC, ZM-95, Oregon-C24V, CP7-5A,
SD1, Singer_Arg, KE9, NADL, VEDEVAC; BVDV-2 JZ05-1, New
York’93, XJ-04, C413, Hokudai Lab/09; BVDV-3 Th/04_KhonKaen,
Italy 1/10-1, Italy-83/10ncp, Italy-83/10cp; Pestivirus della giraffa 1H138. La barra rappresenta il numero di sostituzioni nucleotidiche
per sito.
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Virus della diarrea virale bovina (BVDV) tipo 3: una minaccia emergente per i bovini?
Questo studio ha chiaramente evidenziato che BVDV-3 non
è presente solo nei continenti americano ed asiatico, ma circola anche in Italia, per cui si tratta del primo focolaio clinico segnalato nel continente europeo. Per la prima volta è stata dimostrata una chiara associazione tra uno stipite BVDV3 e la comparsa di sintomatologia clinica (malattia respiratoria). Infatti, le precedenti segnalazioni, pur se relative ad infezioni naturali, non avevano messo in evidenza alcuna associazione con manifestazioni cliniche10. Dal punto di vista genetico, lo stipite italiano è risultato maggiormente correlato
ai ceppi sudamericani piuttosto che al prototipo tailandese
Th/04_KhonKaen. Poiché la maggior parte delle segnalazioni riguarda la identificazione di questi virus in lotti di siero
fetale bovino contaminati, è verosimile che l’introduzione di
questo nuovo BVDV nel continente europeo sia legata all’impiego di vaccini o altri prodotti preparati con siero bovino infetto. Esistono, infatti, precedenti segnalazioni di infezione da BVDV conseguente all’impiego di prodotti immunizzanti contaminati11-13.
A
B
BVDV-3 E TURBE RIPRODUTTIVE
Gli aborti sono stati osservati in giugno 2011 nello stesso allevamento di bovine da latte della Calabria già interessato
dalla malattia respiratoria. L’episodio ha riguardato 8 bovine
pluripare gravide di 4-6 mesi, su un totale di 98 animali gravidi, le quali non hanno manifestato alcun segno prodromico prima dell’aborto, né sequele dopo l’aborto stesso14. Due
feti abortiti (280/11-A e 280/11-B) sono stati inviati ai nostri
laboratori, dove sono stati prelevati frammenti degli organi
interni per le prove diagnostiche.
Tutti i campioni analizzati sono risultati positivi a due distinti test RT-PCR per la ricerca di pestivirus9,15 e sono stati
caratterizzati come BVDV-3 con un protocollo diagnostico
recentemente messo a punto per la identificazione di tutte e
tre le specie BVDV15 (Fig. 2A). I titoli virali, calcolati mediante real-time RT-PCR specifica16, erano compresi tra 4,31
× 102 (rene del feto 280/11-B) e 5,78 × 104 (polmone del feto 280/11-B) copie di RNA per µl di estratto. Gli esami molecolari hanno escluso la presenza negli stessi campioni di altri agenti abortigeni. In sezioni al criostato degli organi contenti i titoli virali più elevati (polmone e milza) sottoposte a
test di immonufluorescenza indiretta (IFI) con anticorpi
monoclonali anti-NS3, è stata evidenziata una marcata presenza di antigeni virali (Fig. 2B). L’isolamento virale è stato
tentato dal polmone del feto 280/11-A utilizzando cellule in
linea continua di rene bovino MDBK. Le colture inoculate
non hanno mostrato effetto citopatico, ma la replicazione virale è stata dimostrata mediante test IFI con anticorpo monoclonale anti-NS3 e mediante real-time RT-PCR BVDV-3
specifica (Fig. 2C).
Mediante analisi di sequenza delle regioni E2, 5’ UTR e Npro,
lo stipite Italy-280/11-A è risultato strettamente correlato al
prototipo italiano Italy-1/10-1, isolato oltre un anno prima
nello stesso allevamento. L’analisi filogenetica ottenuta con il
metodo neighbor-joining sulle sequenze ottenute e su analoghe sequenze di stipiti pestivirus di riferimento ha confermato tale correlezione genetica, evidenziando per il virus
isolato dall’aborto lo stesso pattern filogenetico dello stipite
isolato dai casi di patologia respiratoria (dati non mostrati).
Prima della segnalazione in Italia, sequenze ‘Hobi’-like erano
C
Figura 2 - Identificazione di BVDV-3 in feti bovini abortiti. A) Elettroforesi in gel di agarosio dei prodotti di amplificazione ottenuti mediante protocollo nested PCR di caratterizzazione15. Corsia 1,
marker GeneRuler 100bp DNA Ladder (MBI Fermentas GmbH, St.
Leon-Rot, Germany); corsia 2, BVDV-1 stipite NADL; corsia 3,
BVDV-2 stipite 232/02; corsia 4, BVDV-3 stipite Italy-1/10-1; corsie
5-9, campioni tissutali (placenta, polmone, milza, fegato, rene) del
feto 280/11-A; corsie 10-14, campioni tissutali (placenta, polmone,
milza, fegato, rene del feto 280/11-B; corsia 15, controllo negativo
(milza di vitello negativo per BVDV). B) Polmone del feto 280/11-A:
test di immunofluorescenza. C) Cellule MDBK inoculated con il polmone del feto 280/11-A: test di immunofluorescenza.
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state identificate in due feti abortiti in Brasile, ma nulla è noto riguardo i dati anamnestici e la caratterizzazione di questo
virus17. La possibilità che BVDV-3 rappresenti un’ulteriore
minaccia per l’apparato genitale della bovina rende quanto
mai urgente l’adozione di misure specifiche di profilassi, predisposte sulla base delle caratteristiche patogenetiche ed immunologiche di questo virus ed attuate utilizzando test diagnostici specifici.
BVDV-3 E BIOTIPO CITOPATOGENO
In base alla capacità di indurre effetto citopatico sulle colture cellulari infette, sono noti due distinti biotipi di pestivirus,
citopatogeno (cp) e non citopatogeno (ncp). Nella specie bovina, entrambi i biotipi sono coinvolti nella patogenesi della
malattia delle mucose (MD), una forma clinica grave, ad esito letale, tipica dei vitelli persistentemente infetti (PI) e immunotolleranti per BVDV ncp18. Un bovino con MD è, in genere, infetto da entrambi i biotipi. Le analisi molecolari hanno dimostrato che il biotipo cp deriva dal biotipo ncp a seguito di eventi ricombinanti con sequenze di origine cellulare, duplicazioni o delezioni di sequenze virali19,20, oppure
mutazioni puntiformi nel gene NS221. Il risultato finale è
sempre la produzione massiva di proteina NS3 libera, la quale rappresenterebbe un segnale apoptotico per le cellule infette22. Stipiti cp sono stati segnalati per BVDV-1, BVDV-2,
BDV e pestivirus della giraffa, mentre, al momento, solo ceppi ncp sono stati identificati per BVDV-34,7,8.
Nel mese di marzo del 2010, una manza di 13 mesi (Italy83/10), su un totale di 70 animali della stessa età, appartenenti al medesimo allevamento interessato dalla forma respiratoria e, in un tempo successivo, dagli aborti, è deceduta
dopo aver manifestato febbre (40,3°C), moderato scolo nasale, tosse secca e grave dispnea23. Le indagini ematologiche
avevano evidenziato grave leucopenia (2,87 × 109 leucociti/l,
valori di riferimento 4-12 × 109 leucociti/l). All’esame necroscopico erano evidenti tracheite e broncopolmonite catarrale. Dalla carcassa sono stati prelevati campioni di polmone e
di feci per le successive analisi virologiche e batteriologiche
per evidenziare i principali agenti causali di malattia respiratoria nel bovino. Le indagini di laboratorio hanno permesso
di identificare uno stipite pestivirus caratterizzato come
BVDV-3. Mediante real-time RT-PCR, i polmoni della manza sono risultati contenere 7,98 x 106 copie di RNA virale per
µl di estratto. Gli esami virologici e batteriologici hanno fornito esito costantemente negativo per i patogeni di rilevanza
clinica del bovino. Le cellule MDBK inoculate con i campioni positivi per BVDV-3 hanno mostrato fluorescenza citoplasmatica al test IFI (Fig. 3A). Nelle cellule infette, tuttavia,
sono state osservate alterazioni morfologiche (effetto citopatico) caratteristiche della replicazione dei pestivirus cp (Fig.
3B). In base a queste osservazioni era stata ipotizzata la contemporanea presenza nei campioni esaminati di una coppia
‘Hobi’-like cp e ncp. I due distinti stipiti cp e ncp (Italy83/10cp e Italy-83/10ncp) sono stati effettivamente separati
mediante passaggi seriali su cellule utilizzando il metodo delle placche e della diluizione finale.
L’analisi del genoma dei virus Italy-83/10cp e Italy-83/10ncp
(numeri di accesso GenBank JQ612704 e JQ612705) ha evidenziato un’organizzazione genomica sovrapponibile agli
altri membri del genere Pestivirus. Gli stipiti cp e ncp sono
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risultati essere strettamente correlati dal punto di vista genetico (identità nucleotidica del 97%), differenziandosi
quasi esclusivamente per la presenza di una inserzione nel
gene NS2-3. Tale inserzione è altamente simile ad una sequenza genomica della specie bovina (Bos taurus) denominata J-domain protein interacting with viral protein (Jiv)
(Fig. 3C). Mediante analisi filogenetica, gli stipiti Italy83/10cp e Italy-83/10ncp ricadono nel cluster dei pestivirus
‘Hobi’-like e risultano maggiormente correlati ai ceppi di
origine sudamericana, esattamente come il prototipo italiano Italy-1/10-1 (Fig. 1).
Diverse mutazioni sono state associate all’insorgenza di stipiti BVDV cp a partire da stipiti ncp. La maggior parte di
queste mutazioni sono situate all’interno della regione NS23 ed esitano nella abnorme produzione di NS3 libera, la quale è associata alla esaltazione della replicazione virale mediante aumento della produzione di complessi della replicasi. Un meccanismo particolare è rappresentato dall’inserzione di sequenze Jiv all’interno del gene NS2 poco prima del sito di clivaggio tra NS2 ed NS3. Le sequenze Jiv agiscono inducendo il cambiamento conformazionale del complesso
NS2-3 e la successiva attivazione dell’autoproteasi NS224. Sequenze Jiv sono finora state identificate nella regione NS2 di
diverse specie di pestivirus, ma non del virus emergente Hobi-like. Pertanto, la segnalazione italiana è la prima ad aver
riportato l’isolamento e la caratterizzazione di uno stipite
BVDV-3 cp. La stretta correlazione genetica tra i due virus
suggerisce che lo stipite cp sia insorto a seguito di mutazione
(inserzione della sequenza Jiv per ricombinazione con sequenze cellulari) dello stipite ncp.
Le coppie BVDV cp e ncp sono di solito isolate a partire da
animali con MD. In base alle attuali conoscenze la MD si manifesta in bovini persistentemente infetti (detti anche immunotolleranti) ed è caratterizzata da lesioni di tipo emorragico e/o ulcerativo-necrotico. Risulta quindi interessante l’isolamento della coppia BVDV-3 da un soggetto che aveva presentato solo sintomi di tipo respiratorio. I risultati del presente lavoro aprono scenari interessanti in merito al potenziale patogeno di stipiti BVDV-3 ed alla loro capacità di indurre il fenomeno dell’immunotolleranza e sindromi cliniche analoghe alla MD. Solo il continuo monitoraggio epidemiologico negli allevamenti e gli studi di infezione sperimentale potranno chiarire in futuro tali aspetti ancora non
adeguatamente conosciuti.
BVDV-3 ED INFEZIONE PERSISTENTE
I pestivirus sono in grado di indurre il fenomeno dell’immunotolleranza in vitelli infettati in utero tra i due ed i
quattro mesi di gravidanza. I vitelli immunotolleranti per
BVDV sono anche definiti persistentemente infetti (PI), in
quanto risultano costantemente viremici ed incapaci di produrre anticorpi verso il virus responsabile dell’immunotolleranza nell’intero arco dello loro esistenza. I vitelli PI possono apparire normali o avere dimensioni ridotte alla nascita, scarso accrescimento ponderale, mantello arruffato e disomogeneo, forme respiratorie, gastroenteriche e neurologiche. Queste forme cliniche sono indotte direttamente dalla
replicazione virale oppure da agenti patogeni opportunisti
che si virulentano a seguito del grave quadro di immunosoppressione virus-indotta25. Infezioni persistenti sono ri-
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A
B
C
Figura 3 - Identificazione e caratterizzazione del biotipo cp di BVDV-3. A) Isolamento di BVDV-3 su cellule MDBK: fluorescenza citoplasmatica ottenuta utilizzando un anticorpo monoclonale anti-NS3. B) Isolamento di BVDV-3 su cellule MDBK: effetto citopatico caratterizzato da vacuolizzazione citoplasmatica e lisi del monostrato. C) Allineamento delle inserzioni Jiv di 15 stipiti pestivirus messe a confronto con
la analoga sequenza cellulare del bovino (Bos taurus, numero di accesso Genbank AY027882). I punti indicano residui conservati rispetto al
Jiv cellulare. I seguenti stipiti sono stati utilizzati per l’allineamento: BDV Cumnock (U43603), Moredun (U43602); BVDV-1 NADL (AJ133738),
MD1 (Z54332), Indiana (Z54331); BVDV-2 125c (U25053), 296c (AF268172), 5912c (AF268179), 6082c (AF268180), Galena (AF268176),
ND8799c (AF268175); 297c (AF268177), Pestivirus della giraffa 1-H138 (AF268178); BVDV-3 Italy-83/10cp (JQ612705).
portate per BVDV-1, BVDV-2, BDV e CSFV, mentre, al momento, non ci sono segnalazioni per quanto riguarda
BVDV-3. Nella manza con forma respiratoria da cui era stata isolata la coppia di virus cp/ncp23 non era stato possibile
valutare lo stato di immunotolleranza.
In ottobre 2011, nell’allevamento dove era già stato isolato
BVDV-3, è nato un vitello con peso alla nascita inferiore alla norma e con ridotto indice di accrescimento rispetto ad
altri soggetti della stessa età26. All’età di 4 mesi il vitello presentava pelo arruffato, sintomi respiratori (tosse e scolo nasale) ed aree alopeciche su testa, collo, spalla e grassella destre, indicative di micosi cutanea. Le successive indagini di
laboratorio hanno evidenziato che il vitello era sieronegativo per BVDV sia al test ELISA commerciale (BVDV-Ab
SVANOVIRTM ELISA test, Svanova Biotech AB, Uppsala,
Svezia) che al test di virusneutralizzazione (VN). I test virologici, effettuati su campioni di sangue intero15,16, hanno invece dimostrato che lo stesso animale era costantemente viremico per BVDV-3, dato che è stato confermato nei prelievi successivi. Lo stipite BVDV-3 responsabile dello stato di
PI è stato isolato su cellule MDBK senza indurre la comparsa di effetto citopatico anche dopo numerosi passaggi seriali. L’assenza di inserzioni nella regione NS2-3 ha confermato che si trattava di uno stipite BVDV-3 ncp. Mediante analisi di sequenza del gene E2, il virus è risultato strettamente
correlato agli altri stipiti BVDV-3 isolati nello stesso allevamento8,14,23, mostrando un’identità genetica compresa tra il
99,2% ed il 99,6%.
A marzo 2012 il vitello è stato trasferito nell’unità di isolamento del Dipartiemnto di Medicina Veterinaria dell’Uni-
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versità degli Studi di Bari, dove è stato sottoposto a monitoraggio clinico, ematologico, biochimico, virologico e sierologico fino a settembre dello stesso anno. Al momento della
stesura del presente lavoro l’animale era ancora in vita. A distanza di due giorni dal trasferimento, l’animale ha manifestato diarrea e persistenza dei sintomi respiratori. Mediante
colorazione di Ziehl-Neelsen e metodo della flottazione con
soluazione satura di cloruro di sodio è stato possibile evidenziare la presenza nelle feci di Cryptosporidium parvum
per oltre un mese, nonostante un trattamento di due settimane con alofunginone lattato (500 µg/kg, PO, q 24 h). La
forma respiratoria è stata trattata con enrofloxacin (10
mg/kg, SC, q 24 h for 10 days), mentre una soluzione iodata al 2% di acido salicilico è stata utilizzata per il trattamento topico della dermatomicosi. A fine aprile la sintomatologia respiratoria si è aggravata e dai campioni clinici è stato
isolato in brodo Hayflick un micoplasma27, successivamente
caratterizzato come Mycoplasma bovirhinis mediante PCR
ad ampio spettro28. A seguito di questo isolamento è stata
somministrata ossitetraciclina cloridrato (11 mg/kg, PO, q
12 h per 7 giorni). I trattamenti farmacologici sono stati ripetuti periodicamente in coincidenza con l’esacerbarsi della
sintomatologia. Le condizioni cliniche sembravano migliorare durante la terapia, per riprecipitare nei periodi di sospensione. Ad un anno di età il vitello presentava ancora ridotto accrescimento e pelo arruffato (Fig. 4A). Il peso e l’altezza al garrese si attestavano su valori di 204 kg e 102 cm,
rispettivamente, a fronte di misurazioni medie di vitelli della stessa età e della stessa azienda rispettivamente di 380 kg
e 135 cm.
Campioni di sangue intero, siero ed urine sono stati prelevati ad intervalli di due settimane, da marzo a settembre 2012,
per le succesive analisi. Nonostante lo stato di PI, il vitello
non ha presentato, in questo periodo, alcuna significativa alterazione dei parametri ematologici e biochimici, ad eccezione di una lieve linfopenia osservata in maggio (2,6 × 109
linfociti/l; limite di riferimento minimo 3,0 × 109 linfociti/l).
BVDV-3 è stato rilevato in maniera continua per l’intero periodo di osservazione, mentre anticorpi specifici non sono
mai stati evidenziati nei campioni di siero dell’animale mediante ELISA o VN. Di particolare interesse è il rilevamento
ad alto titolo del virus nelle urine (titoli mediani pari a 2,01
× 106 copie di RNA µl-1 di estratto), mentre titoli inferiori sono stati osservati nel sangue (8,51 × 105 copie RNA) e nei
tamponi nasali (2,92 × 105 copie di RNA) e solo tracce di
RNA virale erano presenti nelle feci (6,06 × 103 copie di RNA
µl-1 di estratto) (Fig. 4B).
Questo studio, oltre a segnalare per la prima volta l’esistenza
di animali PI anche in riferimento all’infezione sostenuta da
BVDV-3, ha evidenziato una elevata escrezione virale mediante le urine, un riscontro che potrebbe avere importanti
implicazioni diagnostiche e profilattiche qualora confermato
da successivi studi. In effetti, gli studi sperimentali finora
condotti29 hanno riguardato solo animali con infezione acuta, non persistente, e non hanno comunque preso in considerazione l’escrezione virale mediante le urine. I vitelli PI per
altri BVDV possono sviluppare forme di MD a seguito di superinfezione da parte di virus cp originato dal ceppo ncp responsabile dell’infezione persistente. Sebbene il vitello PI per
BVDV-3 non abbia sviluppato forme cliniche di MD nei sei
mesi di osservazione, non si può escludere che tali forme
possano insorgere in futuro.
179
A
B
Figura 4 - Identificazione di soggetto con infezione persistente (PI)
da BVDV-3. A) Ridotte dimensioni del vitello PI. B) Viremia ed
escrezione di BVDV-3 mediante urine, secrezioni nasali e feci dello
stesso anmale. I titoli di RNA virale sono stati calcolati con real-time
RT-PCR e sono espressi come numero di copie µl-1 di estratto.
BVDV-3 E SPETTRO D’OSPITE
Per valutare lo spettro d’ospite in vivo di BVDV-3 sono state
effettuate prove di infezione sperimentale di vitelli, agnelli e
suinetti29. Utilizzando lo stipite prototipo Italy-1/10-1, isolato dal focolaio di malattia respiratoria in Calabria (8), al terzo passaggio su cellule MDBK (titolo pari a 106 TCID50 ml-1).
Gli animali sottoposti ad infezione sperimentale, tutti sieronegativi e virus negativi per pestivirus, includevano: 7 vitelli
di 6 mesi di età, 7 agnelli di 5 mesi di età e 7 suinetti di 2 mesi di età. Per ciascuna specie animale, 5 soggetti sono stati infettati per via oronasale con 5 ml di virus, mentre i restanti 2
animali sono stati utilizzati come controlli. Tutti gli animali
sono stati monitorati per 28 giorni valutando: 1) la comparsa di eventuali segni clinici (febbre, diarrea, sintomi respiratori ed altri segni tipici delle infezioni da BVDV); 2) gli incrementi ponderali; 3) i parametri ematologici; 4) l’escrezione virale; 5) la sieroconversione.
I controlli di tutte le specie animali utilizzate non hanno manifestano alcun sintomo clinico, né alterazioni ematologiche,
escrezione virale o sieroconversione per BVDV. Nei vitelli infetti sono stati osservati sintomi clinici lievi, rappresentati da
ipertermia a 3 (40,5°C) e 7 (39,7°C) giorni post-infezione
(gpi) e comparsa di scolo nasale mucosieroso da 5 a 11 gpi.
Una lieve leucopenia è stata rilevata da 3 a 10 gpi, anche se le
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Virus della diarrea virale bovina (BVDV) tipo 3: una minaccia emergente per i bovini?
A
B
C
D
Figura 5
conte leucocitarie non sono mai scese al di sotto del 50% rispetto a quelle registrate prima dell’infezione. Nello stesso periodo i leucociti hanno oscillato tra il 41,7% e l’81,6% rispetto ai valori di base. La viremia è stata rilevata da 5 a 24 gpi e
l’escrezione virale si è manifestata da 5 a 21 gpi per via nasale
e da 7 a 21 gpi per via fecale. I titoli virali calcolati mediante
real-time RT-PCR specifica16 sono risultati generalmente bassi. La risposta anticorpale, comparsa a 14 gpi, ha raggiunto i
massimi livelli a 21-28 gpi, attestandosi su titoli mediani in VN
pari a 1:512. Mediante ELISA (BVDV-Ab SVANOVIRTM ELISA test, Svanova Biotech AB, Uppsala, Svezia), invece, sono
stati ottenuti valori di densità ottica solo leggeremente superiori rispetto al valore soglia o cut-off del test (Fig. 5).
Gli agnelli infetti hanno manifestato una sintomatologia respiratoria leggeremente più evidente, con abbondante scolo
nasale osservato per 19 giorni (mediana delle rilevazioni
complessive), mentre non si è verificato alcun incremento
delle temperature. Le conte leucocitarie e linfocitarie hanno
presentato un lieve decremento tra 5 e 10 gpi, mantenendosi però sempre al di sopra del 60% rispetto ai valori registrati prima dell’infezione. In questi animali la viremia è comparsa a 5 gpi ed è durata fino al termine del periodo di osservazione (28 giorni), ma i titoli virali registrati sono stati
più bassi rispetto a quelli osservati nei vitelli. Anche se solo 3
su 5 agnelli erano viremici a 28 gpi, in questi animali è stata
registrata una viremia di più lunga durata rispetto ai vitelli,
nei quali l’RNA virale è stato rilevato fino ad un massimo di
24 gpi. Gli agnelli hanno eliminato il virus per via nasale e fecale tra 5 e 21 gpi e 7 e 18 gpi, rispettivamente, ma in alcuni
soggetti l’escrezione è risultata intermittente. Anticorpi per
BVDV-3 sono stati evidenziati solo mediante test VN (titoli
mediani pari a 1:64 rilevati a 21-28 gpi), mentre non è stata
osservata alcuna reattività al test ELISA (Fig. 6).
I suinetti inoculati non hanno presentato sintomi per l’intero periodo di osservazione; i parametri ematologici non
hanno subito significative fluttuazioni rispetto alla baseline e
non sono state registrate né viremia né escrezione virale. Tuttavia, tutti i soggetti hanno prodotto una debole risposta anticorpale evidenziabile esclusivamente mediante VN a 21-28
gpi (titoli mediani pari a 1:4) (Fig. 7).
Al momento l’ospite naturale di BVDV-3 non è noto con
certezza, anche se i casi sporadici di infezione naturale sono
stati finora descritti in bovini e bufali7,8,14,23,26. In base alle segnalazioni di infezione naturale ed agli studi sperimentali è
probabile che l’ospite primario di BVDV-3 sia il bovino, sebbene altre specie (bufali, pecore) siano risultate sensibili all’infezione con sviluppo di forme cliniche.
BVDV-3 E CROSS-REATTIVITÀ
CON BVDV-1
Per ampliare le conoscenze attualmente disponibili sulla correlazione immunologica tra BVDV-3 e gli altri stipiti BVDV,
sono state effettuate delle prove di immunizzazione in vivo
nelle specie ovina30. Allo scopo sono stati utilizzati gli stipiti
citopatogeni BVDV-1 NADL e BVDV-3 Italy-83/10cp (23)
coltivati su cellule MDBK. Gli stock virus (titolo pari a 105.50
TCID50 ml-1 di sospensione virale) sono stati inattivati con
una soluzione 1:2000 di betapropiolattone (0,05% v/v) ed
emulsionati inTween-80 (4,1% v/v) e, successivamente, con
un mix di tre adiuvanti a base di oli minerali (50% v/v):
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Figura 6
Montanide ISA 563 (Seppic Inc., Parigi, Francia), Marcol 52
(Esso Italiana S.r.l., Roma, Italia) e Montane 80 (Seppic Inc.,
Parigi, Francia) nella proporzione 30:63:7 (27). I vaccini sono stati aliquotati in dosi da 5 ml e conservati a +4°C.
Lo studio sperimentale è stato effettuato su 14 pecore di età
compresa tra 2 e 3 anni, sieronegative per pestivirus, suddivise in due gruppi di 7 animali. Cinque pecore di ciascun
gruppo sono state inoculate per via intramuscolare con due
dosi di vaccino (BVDV-1 o BVDV-3, rispettivamente), somministrate a distanza di 4 settimane, mentre i restanti due
animali per gruppo sono stati utilizzati come controlli. La
produzione di anticorpi è stata monitorata mediante test
ELISA (BVDV-Ab SVANOVIRTM ELISA test, Svanova Biotech AB, Uppsala, Svezia) e VN7,29 ed i dati sono stati sottoposti ad analisi statistica con il test Mann-Whitney (R software,
versione 2.8.1). Tutti gli animali inoculati con i vaccini hanno mostrato risposta anticorpale sia mediante ELISA che
mediante VN, mentre nei controlli non è stato registrato alcun movimento anticorpale. Il test ELISA è stato in grado di
svelare la presenza di anticorpi per pestivirus a 14 gpi in entrambi i gruppi di pecore (immunizzate per BVDV-1 e per
BVDV-3). I livelli anticorpali hanno raggiunto un picco a 42
gpi (Fig. 8A). Non è stata registrata alcuna differenza significativa tra i livelli anticorpali indotti da BVDV-1 e da BVDV3 (p = 0,84). Mediante test VN, nelle pecore immunizzate per
BVDV-1 la risposta anticorpale omologa (per BVDV-1) ed
eterologa (per BVDV-3) è comparsa a 28 gpi (media geometrica di 512 e 27,9, rispettivamente), per aumentare progressivamente fino al termine dello studio (media geometrica di
4705 e 128, rispettivamente, Fig. 8B). La differenza tra i titoli omologhi ed eterologhi è risultata statisticamente signifi-
cativa. Allo stesso modo, le pecore inoculate con BVDV-3
hanno prodotto anticorpi VN a 28 gpi, raggiungendo la massima risposta a 42 gpi. I titoli anticorpali omologhi sono aumentati da 255,6 a 2702,3 (medie geometriche), mentre gli
eterologhi sono risultati significativamente più bassi dal
punto di vista statistico (p = 0,0092), con medie geometriche
pari a 9,6 e 147,2 a 28 e 42 dpi, rispettivamente (Fig. 8C).
Studi preliminari avevano già in parte evidenziato la presenza
di una scarsa cross-reattività immunologica tra BVDV-3 ed altri pestivirus31,32. Il presente studio ha ulteriormente confermato che BVDV-1 induce una risposta anticorpale in grado di
neutralizzare solo parzialmente BVDV-3, rinforzando le precedenti preoccupazioni sulla capacità dei vaccini attualmente
in uso di conferire protezione nei confronti dell’infezione sostenuta da virus Hobi-like. Per acquisire dati definitivi su questa delicata questione sono tuttavia necessari studi di crossprotezione su bovini, effettuando prove di challenge di animali vaccinati. Un altro elemento interessante è rappresentato dagli elevati titoli anticorpali osservati non solo mediante VN ma
anche con un test ELISA allestito con antigene BVDV-1. Nelle
prove di infezione sperimentale, lo stesso test (BVDV Ab SVANOVIRTM ELISA test) aveva rilevato anticorpi per pestivirus a
bassissimo titolo nei bovini, mentre gli ovini erano risultati
completamente negativi, anche a fronte di discreti titoli anticorpali VN29. Una possibile spiegazione per tali risultati, solo
apparentemente contrastanti, risiede nella diversa modalità di
inoculazione (oronasale o intramuscolare). È infatti noto che,
in corso di infezione naturale, BVDV riesce ad interferire con
lo sviluppo di una risposta immune rapida ed efficace, per cui
gli anticorpi raggiungono titoli elevati a distanza di molte settimane dall’infezione. Nel presente studio l’antigene è stato
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A
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Figura 7
Figura 5, 6, 7 - Infezione sperimentale di vitelli (Fig. 5), agnelli (Fig. 6) e suinetti (Fig. 7) con BVDV-3. Gli animali, inoculati per via oronasale con lo stipite Italy-1/10-1 sono stati monitorati per 28 giorni per la valutazione di temperatura rettale (A), formula leucocitaria (B), viremia ed escrezione virale (C) e risposta anticorpale (D). Le temperature sono presentate come gradi Celsius (°C) mediani, mentre le conte
leucocitarie totali e differenziali sono presentate come percentuali mediane rispetto al tempo 0. I titoli mediani di RNA virale sono stati calcolati con real-time RT-PCR e sono espressi come numero di copie µl-1 di estratto. La risposta anticorpale è presentata come mediane dei titoli osservati in virus neutralizzazione (VN) e delle densità ottiche (OD) ottenute in ELISA.
combinato con un potente adiuvante ed inoculato per via intramuscolare: queste due condizioni potrebbero aver esaltato
la produzione anticorpale, rendendola svelabile con un test altrimenti poco sensibile. Non è, infine, da trascurare il diverso
biotipo utilizzato nei diversi esperimenti, in quanto nelle prove di infezione è stato utilizzato uno stipite ncp, mentre quelle di immunizzazione sono state condotte impiegando uno
stipite cp, il quale è in grado di esprimere elevate quantità di
proteina NS3 libera. Occorre, pertanto, evidenziare che i test
ELISA allestiti con antigene BVDV-1 potrebbero avere una
certa utilità per la ricerca di anticorpi nei confronti di BVDV3 in animali inoculati per via parenterale (qualora siano sviluppati vaccini specifici), ma non con infezione naturale.
Questo dato sottolinea ulteriormente la necessità di attrezzare i sistemi diagnostici in modo specifico nei confronti di
BVDV-3.
TEST MOLECOLARE
PER L’IDENTIFICAZIONE E
CARATTERIZZAZIONE
DEI PESTIVIRUS BOVINI
L’identificazione di BVDV-3, dapprima in lotti commerciali
di siero fetale bovino e, successivamente, in focolai di infe-
zione naturale, ha posto seri problemi riguardo la disponibilità di test diagnostici che siano, allo stesso tempo, sensibili e
specifici per questo pestivirus emergente. A parte la scarsa
sensibilità dei test sierologici basati sulle metodiche ELISA,
probabilmente a causa della bassa correlazione antigenica
esistente tra BVDV-3 e le altre specie BVDV, le metodiche
molecolari attualmente utilizzate nell’ambito dei programmi
di sorveglianza e controllo sono risultate totalmente incapaci di rilevare il nuovo virus o, comunque, poco sensibili4,7,10.
Il test maggiormente utilizzato nei laboratori per la caratterizzazione dei pestivirus dei ruminanti9 ha erroneamente tipizzato i virus Hobi-like come BVDV-28. Il problema opposto è stato, invece, osservato con un test real-time RT-PCR
appositamente sviluppato per l’identificazione di BVDV-3, il
quale reagisce in maniera non specifica anche con stipiti
BVDV-2 ad elevato titolo e, comunque, non è in grado di rilevare simultaneamente BVDV-1 e BVDV-216.
Per superare i limiti dei test attualmente in uso è stato messo a punto un protocollo di nested PCR per la simultanea
identificazione e caratterizzazione molecolare di tutte le specie BVDV, inclusi gli emergenti stipiti Hobi-like15.
I primer per le amplificazioni in RT-PCR e nested PCR sono
stati disegnati mediante software Primer3, versione 0.4.0
(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/), su un allineamento multiplo dei genomi di stipiti di riferimento BVDV-1, BVDV-2,
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BVDV-3, BDV e CSFV disponibili in GenBank, in modo da selezionare le regioni conservate (per la prima amplificazione) e
differenziali (per la nested PCR) tra le diverse specie virali. I
primer per la RT-PCR amplificano un frammento di 1013 basi appaiate (bp) comprendente le regioni genomiche 5’ UTR,
Npro e C, mentre gli oligonucleotidi utilizzati in nested PCR sono rappresentati dal primer reverse della prima amplificazione e da un set di tre primer forward specie-specifici (Tabella
1). Le reazioni di prima (RT-PCR) e seconda (nested PCR)
amplificazione sono state condotte rispettivamente con i kit
SuperScriptTM One-Step RT-PCR for Long Templates (Life
Technologies, Invitrogen, Milan, Italy) e AmpliTaq Gold (Applera Italia, Monza, Italy). Le condizioni termiche dei due protocolli sono riportate in Tabella 1.
La prima amplificazione ha prodotto amplificati delle dimensioni attese in tutti i pestivirus di referenza, inclusi BDV e
CSFV. Mediante nested PCR gli stipiti BVDV-1, BVDV-2 e
BVDV-3 sono stati caratterizzati correttamente, dando amplificati di 501, 829 e 210 bp, rispettivamente (Fig. 9). Non è stata osservata alcuna cross-reazione tra le diverse specie BVDV
e nessun amplificato è stato ottenuto dagli stipiti di referenza
BDV e CSFV. Un protocollo di nested PCR messo a punto negli anni ’90 (prima quindi dell’insorgenza di BVDV-3) per la
caratterizzazione dei pestivirus dei ruminanti9 ha invece riconosciuto correttamente BVDV-1 e BVDV-2, mentre BVDV-3
è stato erroneamente riconosciuto come BVDV-2.
Per la validazione del nuovo protocollo sono stati testati
campioni clinici raccolti nel periodo 2005-2011. L’analisi di
94 campioni bovini (9 aborti, 17 campioni respiratori, 2
campioni fecali e 66 campioni di sangue intero) e di due
aborti caprini, che erano stati precedentemente analizzati
con il vecchio protocollo di tipizzazione molecolare9, ha evidenziato una concordanza tra le due metodiche per 91 campioni. Dei restanti 5 campioni, tutti tipizzati come BVDV-2
con il vecchio protocollo, 3 sono stati riconosciuti come
BVDV-3 dal nuovo test, mentre altri due, corrispondenti agli
aborti caprini, hanno prodotto amplificati in RT-PCR ma
non in nested PCR, e non sono stati riconosciuti come
BVDV. L’analisi di sequenza dei prodotti ottenuti in prima
amplificazione ha dimostrato la corretta tipizzazione dei tre
stipiti BVDV-3, mentre per i campioni caprini si trattava di
stipiti BDV (negativi, pertanto, in nested PCR).
CONCLUSIONI
Figura 8 - Prove di cross-neutralizzazione tra BVDV-1 e BVDV-3
(Hobi-like) in pecore inoculate con antigeni inattivati ed adiuvati. A)
Valori medi di densità ottica (OD) osservati nei sieri degli animali inoculati con BVDV-1 o BVDV-3 mediante test BVDV Ab SVANOVIR™
ELISA. B) Titoli di anticorpi VN (medie geometriche) omologhi ed
eterologhi nei sieri di pecore inoculate con BVDV-1. C) Titoli di anticorpi VN (medie geometriche) omologhi ed eterologhi nei sieri di
pecore inoculate con BVDV-3. Per ciascun valore sono riportate le
deviazioni standard.
Le infezioni da pestivirus hanno ripercussioni negative sulle
produzioni zootecniche e causano ingenti perdite economiche.
I dati relativi ai danni economici provocati dall’infezione da
pestivirus in Italia, anche se ritenuti molto elevati, sono frammentari e non bene definiti. Un recente studio sull’impatto
economico da infezioni da pestivirus nella specie bovina, effettuato in Danimarca, ha dimostrato che le perdite sono comprese tra 10 e 40 milioni di dollari per milione di nuovi nati33.
Nonostante l’impiego estensivo dei programmi di profilassi
sia diretta (identificazione ed abbattimento degli animali PI)
che indiretta (vaccinazione delle manze prima dell’accoppiamento), le infezioni da pestivirus nei ruminanti sono ancora
molto diffuse. Mentre nel caso di BDV, questo sicuramente è
legato alla mancanza in commercio di vaccini specifici, per
quanto riguarda BVDV i dati disponibili indicano che i vaccini in uso possono essere uno strumento efficace, ma la lo-
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Virus della diarrea virale bovina (BVDV) tipo 3: una minaccia emergente per i bovini?
Tabella 1 - Oligonucleotidi utilizzati nei test nested PCR per la caratterizzazione dei pestivirus.
Riferimento
bibliografico
Test
Target
Dimensoni
Senso Posizionea Specificità amplificato
(bp)
Primer
Sequenza (da 5’ a 3’)
P1
AACAAACATGGTTGGTGCAACTGGT
+
1424-1448
BVDV, BDV,
CSFV
826
1684-1713
BDV
566
+
1802-1821
BVDV-2
448
GGGGGTCACTTGTCGGAGG
+
2027-2045
BVDV-1
223
CTCTGCTGTACATGGCACATG
+
368-388
RT-PCR
b
P2
CTTACACAGACATATTTGCCTAGGTTCCA
–
2222-2250
TS1
TATATTATTTGGAGACAGTGAATGTAGTAG
+
TS2
TGGTTAGGGAAGCAATTAGG
TS3
PanBVDVpcrF
Erns
9
nPCR
RT-PCR
b
5’ UTR,
Npro, C
15
nPCR
a
b
BVDV, BDV,
CSFV
1013
PanBVDVpcrR
CGTCGAACCAGTGACGACT
–
1364-1383
BVDV1npcrF
TTTCAAGCTGCTCHGAYAC
+
879-897
BVDV-1
501
BVDV2npcrF
ATCCTGACCAATGCTAGGTCC
+
551-571
BVDV-2
829
BVDV3npcrF
TCCTGTGGCAACCGGTAGGT
+
1173-1192
BVDV-3
210
Protocollo termico
50°C per 30 min,
94°C per 2 min; 45 cicli a
94°C per 30 sec, 55°C
per 30 sec, 68°C per
1 min; 68°C per 10 min
94°C per 10 min; 25 cicli a
94°C per 30 sec, 50°C per
30 sec, 72°C per 1 min;
72°C per 10 min
50°C per 30 min, 94°C
per 2 min; 45 cicli a 94°C
per 30 sec, 50°C per
30 sec, 68°C per 1 min;
68°C per 10 min
94°C per 10 min; 25 cicli a
94°C per 30 sec, 50°C per
30 sec, 72°C per 1 min;
72°C per 10 min
La posizione degli oligonucleotidi si riferisce alla sequenza genomica di BVDV-1 stipite NADL (numero di accesso GenBank M31182).
Il primer reverse è comune a RT-PCR e nested PCR.
Figura 9 - Elettroforesi in gel di agarosio dei prodotti ottenuti in RTPCR (corsie 2-5) e nested PCR (corsie 7-10) per l’identificazione e la
caratterizzazione dei pestivirus bovini. Corsia 1, marker GeneRuler
100bp DNA Ladder (MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Germany);
corsia 6, marker GeneRuler 1kb DNA Ladder (MBI Fermentas
GmbH); corsie 2, 7, BVDV-1 stipite NADL; corsie 3, 8, BVDV-2 stipite 232/02; corsie 4, 9, BVDV-3 stipite 1/10-1-Italy; corsie 5, 10, controllo negativo (sangue di vitello negativo per pestivirus).
ro efficacia deve essere prontamente migliorata per conferire
una protezione più completa34. Le prove di cross-neutralizzazione hanno dimostrato l’esistenza di notevoli differenze
antigeniche tra la nuova specie BVDV-3 ed i più classici
BVDV-1/BVDV-2. Vitelli infettati sperimentalmente con
BVDV-3 hanno mostrato titoli anticorpali elevati con prove
di neutralizzazione nei confronti del virus omologo, ma non
di quello eterologo (BVDV-1). Inoltre, i valori di densità ottica erano solo leggermente al di sopra del valore soglia
quando si utilizzava un kit ELISA commerciale con antigene
BVDV-1. Questo ha posto alcune preoccupazioni circa l’efficacia dei programmi di controllo per BVDV-3, considerando
che, utilizzando i comuni protocolli diagnostici, gli anticorpi
per questo virus potrebbero non essere rilevati29,30. Da tutto
ciò nasce l’esigenza di affrontare il problema sviluppando
nuovi sistemi di diagnosi sierologica finalizzati a monitorare
le infezioni da BVDV e consentendo, nel contempo, di sierotipizzare le infezioni sostenute dalle diverse specie virali.
Le differenze genetiche ed antigeniche dimostrate tra gli stipiti Hobi-like ed i classici stipiti BVDV-1/BVDV-2 sollevano
anche notevoli perplessità circa l’efficacia dei vaccini disponibili in commercio nei confronti di BVDV-3 e suggeriscono
di sviluppare vaccini specifici contro questo nuovo virus.
L’abilità dei pestivirus di modulare la risposta immunitaria
dell’ospite probabilmente è variabile tra i diversi isolati. È
stato infatti ipotizzato che l’elevata diversità genetica esistente tra i virus possa avere importanti implicazioni nello sviluppo di vaccini, poiché la risposta immunitaria indotta da
un ceppo potrebbe conferire solo protezione parziale nei
confronti di un ceppo differente, anche all’interno dello stesso genotipo. Nuovi vaccini e strategie di vaccinazione sono
quindi sempre importanti in questo campo. L’esigenza di
mettere a punto vaccini innovativi ed universalmente efficaci nei confronti dei pestivirus in generale e di BVDV-3 in
particolare rappresenta, quindi, una stimolante sfida sul piano scientifico ed una risposta di alto profilo alle richieste che
giungono dal mondo produttivo zootecnico.
RINGRAZIAMENTI
Le attività di ricerca sono state supportate da finanziamenti
erogati dal Ministero della Salute (Ricerca corrente 2011,
progetto “Epidemiologia del virus della diarrea virale bovina
tipo 3 (BVDV-3) nel Sud Italia”) e dal Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca (PRIN 2010-2011, progetto “Pestivirus dei ruminanti: virus emergenti, aspetti diagnostici e profilattici”).
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N. Decaro et al. Large Animal Review 2013; 19: 174-185
❚ Bovine viral diarrhoea virus type 3:
a new threat to italian cattle industry?
SUMMARY
We report the clinical, pathogenetic and immunological features of the infection caused by a novel bovine pestivirus, namely Hobi virus or bovine viral diarrhea virus (BVDV) type
3, in Italy. This emerging pestivirus, first detected more than
10 years ago in a commercial batch of foetal bovine serum
produced in Brazil, has been reported so far only in southern
America and Asia. In 2010, Hobi-like viruses were detected
in Italy in association with outbreaks of respiratory disease
and reproductive failures occurring in a cattle herd of the
Calabria region. A virus pair consisting of cytopathogenic
(cp) and noncytopathogenic (ncp) BVDV-3 was isolated
from a heifer dead as a consequence of respiratory distress.
At the genetic level the two viruses differed for the presence
in the cp strain of an insertion displaying high similarity to
a bovine sequence previously associated to other cp BVDVs.
By screening the cattle herd affected by clinical forms induced by the novel pestivirus, a BVDV-3 persistently infected
(PI) calf was detected, which was monitored for about 6
months with regards to clinical conditions, viremia and viral
shedding. Experimental infection of cattle, sheep and swine
showed that BVDV-3 is able to infect all those species,
although only ruminants displayed clinical signs and virus
shedding. The poor serological cross-reactivity existing
between BVDV-1 and BVDV-3, which was assessed in the
sheep model, raised some concerns about the ability of currently available vaccines, mostly containing BVDV-1, to protect effectively against the new pestiviral species. To overcome the limitations of available diagnostic assays, a new tool
(nested PCR) was developed which ensures unambiguous
molecular characterisation of all BVDV species, including
BVDV-3, in clinical samples. Future studies will assess the
real circulation of this pestivirus in Italian cattle herds and
evaluate the BVDV-3 impact on animal productions.
KEY WORDS
Cattle, bovine viral diarrhoea, Hobi pestivirus (BVDV-3).
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