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Analisi quantitativa delle immagini per applicazioni in Life Science 15 Aprile 2011 Immagini & Computer S.n.c. Via Don Carlo Riva 4 20010 Bareggio (Mi) Analisi quantitativa delle immagini “L’analisi quantitativa delle immagini rappresenta l’arte di trasformare una sensazione visiva nella sua forma schematica e discreta consentendone la descrizione, la classificazione e l’interpretazione matematica e logica univoca delle sue componenti spaziali e temporali.” Analisi quantitativa delle immagini Premesse Analisi quantitativa delle immagini L‟analisi delle immagini è una disciplina il cui scopo principale è estrarre informazioni quantitative a partire dalla rappresentazione digitale del nostro evento biologico Tali informazioni devono essere presenti in quantità e qualità sufficienti alla loro valutazione all‟interno della nostra immagine digitale. Abbiamo quindi bisogno di una rappresentazione digitale quanto più fedele possibile all‟originale da cui è stata generata. La fedeltà e la presenza delle informazioni è funzione diretta dei limiti di risoluzione e contrasto imposti dal sistema. Analisi quantitativa delle immagini I limiti di risoluzione e contrato Limiti fisici derivanti dalla costruzione dell’immagine ottica Limiti derivanti dalla trasformazione dell’immagine ottica in digitale Limiti derivanti dalla errata manipolazione dell’immagine digitale Risultato Analisi quantitativa delle immagini Risoluzione & Contrasto Analisi quantitativa delle immagini Come si forma una immagine ottica Il piano di fuoco selezionato viene, attraverso il sistema ottico (obiettivo), proiettato su un piano focale secondario (posteriore). Quello che noi osserviamo attraverso gli oculari non è il campione originale ma la sua trasposizione ottica generata attraverso il processo di convoluzione. Obiettivo Lunghezza di camera 18 - 25 cm Piano di fuoco del campione Oculare Piano di Fuoco Oculare Piano di Fuoco posteriore Piano di Fuoco osservato ∞ Analisi quantitativa delle immagini Come si forma una immagine ottica Considerate il campione come un insieme di infiniti punti di emissione luminosa con dimensioni inferiori al limite di risoluzione ottica Quando la luce che arriva dai vari punti che compongono il campione attraversa il sistema ottico essi appaiono come piccole strutture (Airy pattern) e non come punti nell‟immagine ricostruita . La parte centrale del pattern è conosciuta come Airy Disk e contiene + dell‟80% della intensità totale del punto. Analisi quantitativa delle immagini Definizione di risoluzione ottica La risoluzione ottica è definita come la distanza minima che separa 2 oggetti puntiformi presenti sul piano focale affinché essi possano essere visualizzati come entità separate. La risoluzione laterale ed assiale di un sistema ottico si calcola utilizzando la formula di Abbe (dove N.A.= n sen a ) R laterale WF = 0,61 λem/ N.A. R assiale WF= 2 λem * n / N.A Il criterio di Rayleigh propone come limite di risoluzione la distanza minima tra 2 punti tale che il contrasto ottenuto rappresenti il 26.5% del totale. Il limite di risoluzione si raggiunge quando il primo anello periferico del pattern di Airy di un punto si sovrappone al punto di massima del disco principale del punto contiguo. Si consideri che: Più il picco centrale del pattern di Airy è sottile più è elevato il potere risolutivo del sistema ottico. L’ampiezze del picco è determinata sia dall’angolo solido con il quale l’ottica è in grado di raccogliere la luce (Apertura Numerica), sia dalla lunghezza d’onda della luce raccolta. Analisi quantitativa delle immagini Definizione di risoluzione ottica Il concetto di risoluzione ottica è indissolubilmente associato al concetto di contrasto Il contrasto è espresso come la differenza tra il valore massimo e minimo di intensità presente nell‟immagine. C = (Max – Min) / Med Con riferimento ai pattern di Airy il contrasto è dato dalla differenza tra il picco di massima (disco centrale) ed il valore di intensità più prossimo. Minore la distanza tra gli oggetti minore il contrasto esistente tra i due. La Cut-Off distance determina le distanza esistente tra due punti (massimo dei picchi di Airy) a partire dalla quale il valore di contrasto viene azzerato. Il criterio di Sparrow definisce la risoluzione di un sistema come la distanza di Cut-Off calcolata. Analisi quantitativa delle immagini Principali sorgenti di degrado della risoluzione (contrasto) Analisi quantitativa delle immagini Principali sorgenti di degrado della risoluzione (contrasto) Marcatura adeguata delle strutture Preparazione del campione Sistema Ottico Rumore Background Causa una variazione (fluttuazione) del segnale intorno al suo valore reale. Il segnale deve risultare significativamente più elevato del rumore. Degrado delle caratteristiche dell’immagine originale. Introduzione di aberrazioni ottiche e di fenomeni di diffrazione. Si aggiunge al reale segnale e ne compromette la quantificazione. Deve essere sottratto al valore del segnale. •Rumore Poisson (campione) •Rumore ottico •Diffrazione Luce •Aberrazioni sferiche e cromatiche •Fuori fuoco. •Artefatti •Autofluorescenza. •Disomogeneità luce •Luce estranea Analisi quantitativa delle immagini Disallineamento cromatico Errore sistematico caratteristico dei sistemi ottici (obiettivi). La luce monocromatica viene focalizzata su piani diversi in funzione della sua lunghezza d’onda. Errore più consistente lungo asse Z. Risente delle condizioni meccaniche ed ambientali (temperatura) Utilizzo di obiettivi corretti cromaticamente. Misura sperimentale del disallineamento attraverso sfere fluorescenti. Correzione con ricalcolo dello stack Analisi quantitativa delle immagini Errata localizzazione della luce A causa della profondità di campo dell‟obiettivo utilizzato, la luce proveniente dai piani di fuoco adiacenti a quello principale fornisce il proprio contributo nella formazione dell‟immagine. La profondità di campo identifica la porzione (o spessore) del campione i cui estremi rimangono simultaneamente a fuoco all‟interno della stessa immagine. La profondità di campo è funzione principalmente della apertura numerica della lente e della lunghezza d‟onda di emissione della luce utilizzata. Profondità di campo = R assiale/2 Analisi quantitativa delle immagini Errata localizzazione della luce Il processo fisico che rappresenta il modello di diffusione della luce è descritto dalla funzione che prende il nome di PSF (Point Spread Function) Campione PSF Proiezione ottica La Point Spread Function (PSF) rappresenta “il mattone” sul quale l‟immagine viene costruita. Analisi quantitativa delle immagini Aberrazione Sferica L’aberrazione sferica rappresenta una distorsione ottica generata dalla differente posizione di focalizzazione dei raggi oblicui (periferici) rispetto ai raggi centrali che attraversano la lente. L’aberrazione sferica introduce asimmetria nella distribuzione della luce, aggiunge componenti fuori fuoco e riduce il livello del segnale. L’aberrazione sferica è generata da una imperfezione del percorso ottico. La causa può essere identificata sia nella qualità costruttiva dell’obiettivo, sia nelle differenze esistenti tra gli indici di riflessione dei media utilizzati per interfacciare gli obiettivi (aria, olio, acqua, ect) e quelli dei media utilizzati per fissare il campione. Lo spessore del campione stesso può contribuire alla sua generazione. Analisi quantitativa delle immagini Background Si aggiunge come costante al segnale Regolando l’offset del sistema si acquisizione Valutando il valore del background con immagini di riferimento Disomogeneità di illuminazione Tipica dei sistemi Widefield Si risolve calibrando il sistema di illuminazione (centratura lampada e regolazione del Koeler). Correggendo attraverso immagine del background. Analisi quantitativa delle immagini La trasformazione digitale dell’immagine Analisi quantitativa delle immagini Trasformazione dell’immagine ottica in digitale Limiti di risoluzione e contrasto derivanti dalla trasformazione dell’immagine ottica in digitale Rispetto dei principi di campionatura X, Y, Z Adeguata considerazione della dinamica del segnale (rappresentazione dell‟evento) Ottimizzazione del rapporto Segnale/Rumore (SNR) Corretta definizione dei parametri operativi (potenza del laser, esposizione della telecamera, impostazione PMT, livello di illuminazione del campione) Corretta (e strutturata) memorizzazione delle immagini Analisi quantitativa delle immagini Il campionamento La densità di campionamento stabilisce il numero di unità digitali di base (pixel o voxel) chedevono essere acquisite per unità di superfice / volume. In pratica definisce le dimensioni ideali del pixel / voxel nelle specifiche condizioni operative allo scopo di salvaguardare il contenuto informativo del campione. Z Y X Analisi quantitativa delle immagini Il campionamento La dimensione ideale del pixel / voxel, al di fuori del quale il processo di acquisizione può produrre artefatti, viene calcolata secondo il teorema di Nyquist-Shannon. “La frequenza di campionamento di un segnale (Analogico ->Digitale) deve risultare più grande del doppio della bandapassante del segnale originale in modo da garantirne la perfetta ricostruzione digitale.” Voxel Struttura La massima dimensione del pixel / voxel deve risultare inferiore alla metà del più piccolo oggetto o struttura presente nell‟immagine. Analisi quantitativa delle immagini Il campionamento La dimensione del più piccolo oggetto o struttura presente nell‟immagine è equivalente al limite risolutivo del sistema ottico (e digitale) in uso. Calcolo Z secondo Nyquist Δz = λem / (2 N (1- cos α)) Λem = emission wavelenght N = medium index α = ½ angolo apertura obiettivo In pratica Λem = 520nm N = 1.515 NA = 1.3 -> α = αrcsen(NA/N) Δz = 520 /(2*1.515*(1-cos α)) Δz = 353 nm Calcolo XY secondo Nyquist Δxy = λem / (4 N sen α) Calcolatore Nyquist Un densità di campionamento inferiore al valore calcolato non è accettabile in quanto riduce il contrasto. Un minimo sovracampionamento non influisce sulla qualità delle informazioni. Un eccessivo sovracampionamento è inutile e spesso deleterio. Analisi quantitativa delle immagini Il campionamento Il valore di intensità contenuto nei singoli pixel / voxel sintetizza il reale contenuto dell‟area / volume descritta dall‟elemento digitale. In questo modo i valori minimi aumentano ed i valori massimi si riducono comprimendo il contrasto dell‟immagine. Analisi quantitativa delle immagini La gamma dinamica del segnale La gamma dinamica dell’immagine rappresenta il numero di valori discreti che compongono la scala numerica utilizzata per descrivere il segnale analogico nella sua forma digitale (Livelli di Grigio). La scala numerica (scala dei grigi) ha dimensioni standardizzate (8bit-256 GL, 12bit-4096 GL, 16bit-65356 GL) La gamma dinamica dell’immagine è determinata dalle caratteristiche fisiche del dispositivo di acquisizione utilizzato. (PMT o CCD). Discreto Continuo Per i sensori CCD la gamma dinamica reale è determinata dal rapporto tra la capacità di immagazzinamento dei fotoni (FWC) propria delle singole celle ed il contributo dei rumori intrinseci da esso generati. (Read Noise, Termal noise, ect) FWC inversamente proporzionale alle dimensioni della singola cella CCD. Analisi quantitativa delle immagini La gamma dinamica del segnale Ogni valore numerico presente nella scala dei grigi rappresenta un intervallo di intensità. Tanto più ampia è la scala numerica tanto più piccoli sono gli intervalli descritti. Considerando che il numero di valori su cui è suddivisa la scala di grigi e la sua estensione sono determinati dalle caratteristiche costruttive del dispositivo di lettura dei fotoni possiamo solo agire sul segnale, o sui parametri utilizzati per rilevarlo, per aumentare il numero di fotoni rilevato e di conseguenza migliorare il contrasto Segnale sovraesposto Aumentando l’intensità di illuminazione del campione 80 %o Ottimizziamo la dinamica digitale dell‟immagine durante l’acquisizione 20 %o Segnale sottoesposto Bilanciando adeguatamente guadagno PMT e potenza del laser Utilizzando tempi di esposizione adeguati (CCD) Utilizzando le funzioni di binning (CCD) Analisi quantitativa delle immagini Il Rapporto Segnale/Rumore (SNR) Rappresenta il rapporto tra i disturbi presente nell‟immagine e l‟effettivo segnale. Tecniche di riduzione del rumore Il valore SNR può essere migliorato agendo su : Adeguata gestione del range dinamico Tecniche di Image Restoration Analisi quantitativa delle immagini Archiviazione delle immagini Necessità di preservare le informazioni originali contenute nell’immagine. In questo caso sono da preferire i formati lineari non compressi o con compressioni di tipo “lostless” (Tiff, Bmp, ect) oppure i formati proprietari degli strumenti. No a formati “ibridi” (quali il Tiff - Palette) I danni introdotti dai sistemi di compressione ad alta efficienza (Jpeg, Jpeg2000, ect) non sono immediatamente percettibili. Essi si manifestano sotto forma di “pixellatura” artificiale dell’immagine. I singoli pixel subiscono una modifica in termini di contenuto cromatico e/o di intensità/densità. Tale variazione può introdurre un errore di valutazione importante (5% - 20%) direttamente rapportato al coefficiente di compressione utilizzato. Analisi quantitativa delle immagini Risoluzione digitale Analisi quantitativa delle immagini Risoluzione spaziale & Risoluzione discriminante La risoluzione spaziale rappresenta la dimensione, espressa in unità metriche, del più piccolo oggetto, proiettato sul piano di fuoco, identificabile come tale dal sistema di acquisizione. La risoluzione discriminante rappresenta la distanza minima, espressa in unità metriche, che deve intercorrere tra due oggetti proiettati sul piano di fuoco, e ben contrastati tra loro, per poter essere identificati come tali dal sistema di acquisizione. Analisi quantitativa delle immagini Risoluzione spaziale In presenza di un dispositivo CCD, la risoluzione spaziale risulta funzione delle dimensioni della singola cella del sensore (pixel size) e del’ingrandimento dell’obiettivo utilizzato secondo la formula:Rs= (Pixel size / Ingrandimento obiettivo) In presenza di un dispositivo PMT confocale, la risoluzione spaziale risulta funzione delle dimensioni Pin Hole utilizzato (Airy unit), dal fattore di ingrandimento (zoom) e dal numero di pixels utilizzati per la matrice di acquisizione. L‟impostazione di questi parametri è strettamente dipendenti dai valori di densità di campionamento calcolati utilizzando la formula di Nyquist. 4.6 um Analisi quantitativa delle immagini Risoluzione discriminante A causa delle caratteristiche fisiche del sensore CCD, due oggetti devono distare almeno di un pixel tra loro per poter essere discriminati come tali. Rd = ((Pixel size / Ingrandimento) * 2.3) Esempio : Pixel size = 6.4 um, Ingrandimento = 100x Risoluzione spaziale = (6.4 / 100) = 0.064 um ->(Pixel size / Ingrandimento) Risoluzione Discriminante = ((6.4 / 100) * 2.3) = 0.147 um ->(Pixel size / Ingrandimento) * 2.3 Analisi quantitativa delle immagini Risoluzione dell’immagine Caratteristica fisica dell’immagine digitale. Corrisponde al numero di pixel orizzontali / verticali che formano l’immagine (Da non confondere con i DPI.) . La risoluzione dell’immagine non è direttamente connessa alla capacità risolutiva del dispositivo che l’ha generata. 1024 x 768 pixel 2048 x 1536 pixel Analisi quantitativa delle immagini Correzione artefatti e ripristino della risoluzione Analisi quantitativa delle immagini Raccolta delle immagini Ripristino delle caratteristiche originali delle immagini. Rimozione del rumore Rilocazione della luce fuori fuoco Correzione degli artefatti Decadimento (Photobleaching,ect) Correzione disomogeneità fondo Instabilità di illuminazione Registrazione Mosaicatura Evoluzione e comportamento delle strutture Tracking Cinetica Ratio Imaging Identificazione delle strutture Segmentazione Distinzione da altre strutture Codifica dei confini e misura Classificazione Pubblicazione Data Mining Simulazione evento Creazione modello Analisi dei dati Analisi quantitativa delle immagini Correzione artefatti e ripristino della risoluzione Image Restoration insieme di procedure e funzioni atte al recupero di un segnale (immagine) nella sua forma originale. Deconvoluzione 3D operazione matematica utilizzata per recuperare un segnale degradato da un processo fisico. Filtri spaziali lineari e non Filtri in domini di frequenza (FFT) Nessuna alterazione dell‟immagine (analisi quantitativa) Image Restoration Correzione artefatti e ripristino della risoluzione Per ridistribuire correttamente la luce attraverso la deconvoluzione è necessario conoscere a priori il modello fisico che regola la diffusione della stessa nel sistema ottico in uso (descrittore della funzione di convoluzione). Proiezione ottica Deconvoluzione 3D Campione teorico Il modello fisico che rappresenta il modello di diffusione della luce è descritto dalla funzione che prende il nome di PSF (Point Spread Function) Analisi quantitativa delle immagini Visualizzare le informazioni Analisi quantitativa delle immagini Visualizzare le informazioni Memoria Tabelle colore Video R V B Display range Memoria Ridistribuzione dei livelli di grigio (Stretch, Log e Exp) BCG Analisi quantitativa delle immagini Semplificare le informazioni Analisi quantitativa delle immagini Quale è la nostra base di partenza? • Circa 1/3 del cervello umano elabora informazioni visive • Percezione visiva dipende dal modo in cui vengono elaborate le informazioni luminose prodotte da fotoni che colpiscono la retina • Elaborazioni diverse permettono di percepire aspetti diversi della visione: forme, colore, movimento, profondità. • Elaborazione molto veloce e complessa : percezione simultanea di dettagli e di aspetti globali dell‟immagine. Visione Valutazione Comprensione della scena Conoscenza Informazioni Le principali prerogative del sistema visivo umano sono la rapidità di interpretazione, la capacità di adattamento alle variazioni presenti nella scena rispetto al modello noto e la possibilità di incrementare la conoscenza. Analisi quantitativa delle immagini Quale è la nostra base di partenza? Immagine Ottica campione Sensore (CCD, PMT) Fotoni convertiti in una grandezza fisica proporzionale (ma non uguale) al numero dei fotoni rilevati. Matrice bidimensionale di pixel ognuno dei quali rappresenta una specifica area del campione I livelli di grigio espressi dai singoli pixel rappresentano il numero di fotoni presenti nella corrispondente area / volume del campione Analisi quantitativa delle immagini Semplificare per identificare Proprietà dei pixel : • Intensità (luminosità) • Coordinate spaziali X,Y • Identità ed iterazione con pixel adiacenti E‟ evidente la difficoltà nell‟assegnare, sulla sola base delle proprietà sopra indicate, i singoli pixel ad una specifica classe di appartenenza (filamento, nucleo, membrana, fondo ect) ? Analisi quantitativa delle immagini Identificazione delle strutture Manipolazione dell’immagine Preservare il contenuto informativo Metodi strettamente dipendenti dalle caratteristiche delle strutture da identificare Semplificazione delle strutture Binarizzazione Analisi quantitativa delle immagini Manipolazione delle immagini Analisi quantitativa delle immagini Manipolazione dell’immagine Gauss Varianza Gauss LF NegativeEdge Analisi quantitativa delle immagini Manipolazione dell’immagine Gauss LF Low Pass Sogliatura Gauss LF Positive Edge Sogliatura Analisi quantitativa delle immagini Manipolazione dell’immagine Filtri spaziali lineari e non Filtri in dominio di frequenza (FFT) I filtri operano trasformazioni (semplici o complesse) che modificano il contenuto informativo dei singoli pixel. I filtri lineari rimpiazzano il valore di ogni pixel con un valore ottenuto dalla valutazione dei pixel adiacenti (es. valore medio). Il filtro Gaussiano rappresenta il filtro lineare più utilizzato. Esso migliora l‟immagine riducendo il rumore casuale senza modificare il contenuto informativo. I parametri operativi dei filtri sono spesso richiesti in unità reali (micrometri) -> PSF Analisi quantitativa delle immagini Metodi di binarizzazione Analisi quantitativa delle immagini Riconoscimento dei contorni Si definisce bordo (edge) una forte variazione locale dei livelli di grigio tipicamente associata al contorno di una regione od al confine di separazione tra due regioni adiacenti. Per rilevare i bordi si ricorre al calcolo del gradiente di intensità, ovvero alla valutazione delle variazione dei livelli di grigio, ed al suo orientamento nell‟intorno del bordo da definire. Uno degli algoritmi più conosciuti è il LoG (Laplace ofGaussian) che determina il gradiente attraverso il calcolo della derivata seconda dei livelli di grigio. Filtro di Gauss + Laplace Analisi quantitativa delle immagini Riconoscimento dei contorni Il contorno può risultare chiuso ed identificare una specifica regione dell‟immagine (oggetto) oppure aperto e definirne solo una parte del confine. Uno dei principali motivi della mancata chiusura dei bordi è da ricondurre al basso contrasto esistente tra regioni dell‟immagine (es. fondo ed oggetto). Anche la presenza di rumore sull'immagine (basso SNR) è causa di difficoltà nella rilevazione dei contorni (generazione di falsi bordi). Immagine Edge detection & linking con operatore morfologico Binarizzazione Ogni area racchiusa dal un contorno è riempita con un solo valore di grigio e considerata struttura (oggetto). Analisi quantitativa delle immagini Segmentazione Tipicamente si tende a distinguere il fondo (background) dalle strutture di interesse. All„interno dell„intervallo di grigi si trova l„oggetto, all„esterno il fondo. Le tecniche di segmentazione sono sensibili ai vari artefatti presenti nell‟immagine (rumore, disomogeneità, ect). In presenza di strutture caratterizzate da intensità di fluorescenza differenti un unico intervallo di grigi non consente una perfetta identificazione delle stesse. Analisi quantitativa delle immagini Segmentazione Adattiva Le tecniche di segmentazione adattiva permettono di calcolare l„intervallo di grigio adeguato ad una zona specifica dell„immagine in funzione delle caratteristiche locali (valutazione statistica). Divisione in sotto aree di dimensione adeguata alle strutture presenti Calcolo della soglia locale Binarizzazione Analisi quantitativa delle immagini Segmentazione Adattiva E‟ possibile dividere l‟immagine in aree regolari di dimensioni differenti od in aree irregolari in base ad alcune caratteristiche di distribuzione del segnale preventivamente definite. Grandi aree con distribuzione omogenea (background) Aree con ampie variazioni in piccoli spazi Grandi aree con distribuzione omogenea (background) Aree caratteristiche omogenee in termini statistici e di clusters Analisi quantitativa delle immagini Segmentazione Adattiva Divisione in aree irregolari Fusione di alcune aree in base a criteri prestabiliti Identificazione e separazione delle strutture Binarizzazione Analisi quantitativa delle immagini Crescita delle regioni (Region Growing) Proposto da Haralick, fa uso di descrittori statistici. Si basa sulla progressiva aggregazione di pixel in regioni connesse. Tale aggregazione avviene sulla base di uno o più criteri di similarità. Originale Massimo locale Crescita delle regioni Definizione strutture Partendo da un punto qualsiasi dell‟immagine (massimo o minimo locale) vengono aggregati tutti i pixel del suo vicinato che soddisfano i parametri statistici assegnati (es. media e varianza). La regione viene considerata completa (e non cresce più) quando tutti i pixel sono stati classificati (come aggiunta si possono valutare alcuni criteri ad essa associati (forma, dimensione, ect) oppure incontra un‟altra regione in crescita. La procedura è ripetuta per ogni punto aggiunto e le statistiche della regione vengono aggiornate ciclicamente. Analisi quantitativa delle immagini Segmentazione Automatica Default Huang Intermodes IsoData Li MaxEntropy Mean MinError Minimum Moments Otsu Percentile RenyiEntropy Shanbhag Triangle Yen http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Auto_Threshold Basata su metodi di valutazione statistica, distributiva (cluster) o geometrica del contenuto informativo Analisi quantitativa delle immagini Segmentazione Automatica Huang Intermodes IsoData Li MaxEntropy Mean MinError Minimum Moments Otsu Percentile RenyiEntropy Shanbhag Triangle Yen http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Auto_Threshold Analisi quantitativa delle immagini Caso Pratico Valutazione SPOT presenti sulla membrana cellulare Collassamento (Proiezione – EDF) Analisi 3D Canali separati Analisi quantitativa delle immagini Caso Pratico Identificazione cellule Binarizzazione Erosione Operatore logico Filtro Gauss Sogliatura automatica Conteggio spot Mascheratura spot su membrana Analisi quantitativa delle immagini Estrazione delle informazioni Analisi quantitativa delle immagini Estrazione delle informazioni Possiamo ottenere qualsiasi grandezza fisica diretta descrivente : Dimensioni Area Perimetro Diametri Forma Posizione Roundness Aspectratio Centroide XY Analisi quantitativa delle immagini Estrazione delle informazioni Possiamo ottenere grandezze fisiche che descrivono il segnale presente : Intensità del segnale Variazione di segnale Distribuzione di segnale Analisi quantitativa delle immagini Le misure di intensità Analisi quantitativa delle immagini Le misure di intensità (campo chiaro) Differenza nelle condizioni di ripresa. Variazione del livello di intensità di illuminazione del campione Analisi quantitativa delle immagini Le misure di intensità Calibrazione delle condizioni di ripresa del campione LUCE COLORE BACKGROUND Lettura di un valore (GL) predeterminato in area fuori dal campione ma entro montante Sorgente luminosa Temperatura colore nel bianco (3200°-5000°) Bilanciamento dei 3 colori primari Immagine di riferimento per correzione disomogeneità di illuminazione Variabilità biologica del campione e condizioni di preparazione (spessore, colorazione, ect) UNITA‟ (DO) Analisi quantitativa delle immagini Le misure di intensità (fluorescenza) Corretto il confronto tra strutture appartenenti allo stesso campo Problematico il confronto diretto tra strutture appartenenti a campi / campioni differenti a causa delle: •Impostazioni del sistema di acquisizione. (esposizione, eccitazione, ect) •Fenomeni di FADING (Decadimento del segnale) •Variabilità biologica del campione. •Rumore, disomogeneità nella distribuzione del segnale, fuorifuoco, ect Analisi quantitativa delle immagini Le misure di intensità (fluorescenza) Quencing : generato da processi che producono il passaggio degli elettroni dallo stato di eccitazione a quello di riposo senza emissione di luce. Il processo di Quencing è reversibile. Photobleaching : Perdita permanente della capacità di emettere elettroni da parte del fluoroforo a causa di un danno chimico indotto. Una delle cause principali del Photobleaching è l‟interazione del fluoroforo con luce ed ossigeno. Il processo di Photobleaching non è reversibile. T = 0 sec T = 15 sec T = 30 sec Dye: FITC - Perdita del 50% del segnale in 30sec Utilizzo di Dyes con coefficiente di estinzione elevato Misura del decadimento del segnale nel tempo su aree del campione con marcatura aspecifica Analisi quantitativa delle immagini Le misure di intensità (fluorescenza) RANGE DINAMICO BACKGROUND LINEARITA‟ 100% Intensità relativa Segnale sovraesposto 33% Intensità relativa 80 %o 20 %o 10% Intensità relativa Segnale sottoesposto 3% Intensità relativa Mappa di riferimento per correzione disomogeneità di illuminazione Valutazione intensità del segnale massimo su piano focale adeguato 0.667% Intensità relativa Analisi quantitativa delle immagini Le misure di intensità Per interpretazione dei valori e del loro significato biologico è importante verificare se il marker utilizzato è stecchiometrico (diretta proporzionalità tra segnale e valore letto) . CUT-OFF di Intensità calcolato sperimentalmente su WT o Controlli (aspecifici) Identifica la superfice coperta dal marker Analisi quantitativa delle immagini Le misure di intensità Quali sono i parametri adatti a quantificare l„intensità del segnale ? Superfice coperta dal marker (solo tessuto) : 26674 pixel Percentuale di tessuto coperta dal marker : 18.6% Intensità media del segnale : 0.17 OD Intensità integrale del segnale (somma) : 5630.60 OD Superfice coperta dal marker (solo tessuto) : 50930 pixel Percentuale di tessuto coperta dal marker : 30.76% Intensità media del segnale : 0.229 OD Intensità integrale del segnale (somma) : 15315.20 OD Media : Valore dell„intensità media espressa dai singoli pixel (OD / GL) entro l„area coperta dal marker Moda : Valore di intensità pixel (OD / GL) maggiormente espresso dai pixel presenti nell„area coperta dal marker Integrale : Valore totale (Somma) dei singoli valori espressi dai singoli pixel presenti nell„area coperta dal marker Superfice : Estensione dell„area coperta dal marker Analisi quantitativa delle immagini Le misure di intensità Superfice coperta dal marker (solo tessuto) : 130548 pixel Percentuale di tessuto coperta dal marker : 42.49% Intensità media del segnale : 32.72 GL Intensità integrale del segnale (somma) : 5886375 GL Superfice coperta dal marker (solo tessuto) : 148416 pixel Percentuale di tessuto coperta dal marker : 48.30% Intensità media del segnale : 41.92 GL Intensità integrale del segnale (somma) : 9238327 GL CUT-OFF di Intensità calcolato sperimentalmente su WT o Controlli (aspecifici) Identifica la superfice coperta dal dye Analisi quantitativa delle immagini Le misure di intensità Una delle possibili soluzioni consiste nel legare la misura di interesse con un riferimento che possa esprimere le eventuali variazioni dovute alle condizioni esterne al campione. •Livello del fondo •Auto fluorescenza dei tessuti circostanti •Segnali provenienti da strutture non influenzate dalle condizioni sperimentali (aspecifico) Linea cellulare nota inserita nel processo di analisi Misure raziometriche (Ca2+) Cellule non caricate e caricate a saturazione Caso reale Intensità dei telomeri normalizzata con intensità centromero prima del loro confronto. Entrambi marcati utilizzando lo stesso dye. Analisi quantitativa delle immagini 3D: il mondo reale Analisi quantitativa delle immagini Quale è la nostra base di partenza? 3 Dimensioni Immagine Ottica campione Sensore (CCD, PMT) Fotoni convertiti in una grandezza fisica proporzionale (ma non uguale) al numero dei fotoni rilevati. Matrice tridimensionale di voxel ognuno dei quali rappresenta uno specifico volume del campione . I livelli di grigio espressi dai singoli voxel rappresentano il numero di fotoni presenti nella corrispondente volume del campione . Analisi quantitativa delle immagini Semplificare per identificare ? Binarizzazione Iso Superficie Analisi quantitativa delle immagini Identificazione delle strutture Manipolazione dell’immagine Preservare il contenuto informativo Metodi strettamente dipendenti dalle caratteristiche delle strutture da identificare Semplificazione delle strutture Iso Superfici Analisi quantitativa delle immagini Costruzione delle Iso Superfici 1. Selezione dell‟intervallo di intensità del segnale (livelli di grigio) da descrivere attraverso la Iso Superficie. 3. Trasformazione visiva della struttura complessa attraverso il loro riempimento. 2. Creazione matematica di una struttura complessa di forme geometriche (triangoli) che descrivono la superficie esterna del volume. Analisi quantitativa delle immagini Costruzione delle Iso Superfici Il livello di precisione nella ricostruzione della superficie è gestito attraverso il grado di interpolazione matematica con la quale vengono create le forme geometriche. Tanto più piccoli sono i triangoli tanto più dettagliata è la superficie. Di contro un grado di interpolazione troppo elevato tende, in presenza di interconnessione spaziale dei voxels bassa, a frammentare il volume più del necessario. Analisi quantitativa delle immagini Quali informazioni di base possiamo estrarre? Qualsiasi grandezza fisica diretta descrivente : Dimensioni Volume Spostamento Superficie Diametri Distanze tra comparti Forma Segnale Sfericità Intensità Distanze tra strutture Posizione Baricentro X Y Z Altro . . Analisi quantitativa delle immagini Le misure di intensità di segnale. Le iso superfici costituiscono il “guscio” che racchiude le nostre strutture dandogli forma e confini precisi. Struttura su canale n°3 Segnale canale n°1 Segnale canale n°2 Analisi quantitativa delle immagini Misure dimensionali, di forma e di intensità Analisi quantitativa delle immagini Conteggio e misure dimensionali, di forma e di intensità Definizione delle Iso Superfici Divisione degli oggetti Classificazione delle strutture Selezione degli oggetti di interesse Analisi quantitativa delle immagini Studio della interazione tra comparti cellulari Distanza vescicole – Nuclei Colocalizzazione delle Vescicole (Intensità di un canale all‟interno del volume vescicolare) Distanza Vescicole–Membrana Numero di Vescicole per nucleo Densità delle vescicole per nucleo Numero di vescicole per cellula Densità delle vescicole per cellule Volume delle vescicole per cellula Nuclei per Cellula Volume del Nucleo / Volume del Citoplasma Distanza media vescicole Nuclei e vescicole vs Membrana Intensità delle vescicole per cellula Analisi quantitativa delle immagini Studio Sinapsi posizionate sulla membrana cellulare Trasformazione delle cellule in Isosurface Trasformazione delle sinapsi in Isosurface sferiche (Spot) Selezione delle sinapsi (Spot) in contatto con membrana (Isosurface) . Analisi quantitativa delle immagini Colocalizzazione di oggetti Iterazione proteina – proteina. Associazione spaziale di segnali Oggetti che risultano parzialmente in contatto o totalmente inseriti in altri oggetti. Analisi quantitativa delle immagini Iterazione proteina – proteina Definizione della intensità del segnale utilizzata per costruire le Iso Superfici . Divisione degli oggetti tramite „region growing“ Analisi quantitativa delle immagini Iterazione proteina – proteina Estrazione dei dati di intensità di fluorescenza della proteina “B” (canale giallo) localizzata dentro i siti relativi alla proteina “A” (canale rosso). Classificazione per livello di intensità espresso. Analisi quantitativa delle immagini Informazioni in movimento Valutazione del movimento delle strutture (variazione della posizione) rispetto al tempo ed allo spazio. Determinazione della direzione, velocità, accelerazione e tipologia del moto di ogni singolo oggetto. Quantificazione delle modifiche strutturali (Dimensioni) e chimiche (intensità del segnale) in relazione al tempo. Analisi quantitativa delle immagini Informazioni in movimento Browniano Connesso Autoregressivo ta r r tb r ta tc td te te tb tc E‟ importante conoscere la natura del moto degli oggetti per poter selezionare l‟algoritmo adeguato alla loro identificazione . r‘ Analisi quantitativa delle immagini Informazioni in movimento Selezione (filtro) Statistica Rappresentazione Analisi quantitativa delle immagini Analisi di filamenti •Misurazione dell‟albero dendritico •Identificazione delle spine e calcolo delle loro caratteristiche strutturali (volume, ect) •Diametro dei filamenti. Stack 3D •Statistica distribuzione spine •Orientamento dendriti •Analisi dei livelli dei branches (generazioni) •Classificazione spine Definizione punto inizio Definizione punti massima intensità locale Analisi quantitativa delle immagini Analisi di filamenti Soglia intensità di fluorescenza Calcolo diametro filamenti (proporzionale al segnale) Identificazione spine Analisi quantitativa delle immagini Analisi di filamenti Estrazione misure Classificazione morfologica spine Analisi quantitativa delle immagini Analisi di filamenti Analisi quantitativa delle immagini Colocalizzazione di segnale Valutazione del livello di sovrapposizione spaziale di due segnali fluorescenti aventi caratteristiche spettrali (lunghezze d‟onda) di emissione differenti. Originale Isosurface struttura Mascheratura Colocalizzazione Isosurface Qualsiasi quantificazione morfometrica, morfologica, di intensità su segnali statici o dinamici Analisi quantitativa delle immagini Colocalizzazione di segnale L’analisi della colocalizzazione richiede: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Basso livello di rumore Segnali non saturati Nessuna sovrapposizione tra gli spettri di emissione dei fluorocromi (bleed through) Funzione PSF dei singoli canali molto simile (richiede verifica PSF con bead multicolore) Registrazione XYZ perfetta tra i due fluorocromi (shifting ottico) Rimozione del fuori fuoco Obiettivo Calcolo di coefficienti statistici atti a valutare il grado di sovrapposizione dei segnali Coefficiente di Pearson - Misura la sovrapposizione tra i pixel Coefficienti di Manders - Misura il contributo di sovrapposizione di un canale rispetto all‟altro Coefficiente di correlazione -Misura il grado di correlazione tra i due canali si considerano inoltre : Numero di voxel colocalizzati, volume sopra soglia colocalizzato, materiale sopra soglia materializzato.. Analisi quantitativa delle immagini Colocalizzazione di segnale Punto critico : definizione della soglia di colocalizzazione dei singoli canali • L„algoritmo proposto da Costes e Lockett (NCI/NIH) si basa sulla esclusione delle coppie di intensitàche non mostrano correlazione (coefficientedi Pearson =< 0). • Partendo dalla coppia di valori di intensità più alti, l‟algoritmo procede verso il basso della scala di intensità lungo la linea di interpolazione calcolata. Il coefficiente di Pearson viene calcolato per tutti i valori al di sotto della soglia corrente . L‟algoritmo procede fino a quando il coefficiente di Pearson raggiunge il valore 0 (o diventa negativo). Canale A Interpolazione lineare dei valori Coefficiente di Pearson = 0 per valori di soglia inferiori a quelli impostati CanaleB Analisi quantitativa delle immagini Colocalizzazione di segnale Canale A Interpolazione lineare dei valori Coefficiente di Pearson = 0 per valori di soglia inferiori a quelli impostati CanaleB Analisi quantitativa delle immagini Colocalizzazione di segnale Punto critico : valutazione della probabilità di colocalizzazione casuale 17 pixel su 40 presenti sono colocalizzati. Dato significativo o casuale? La risposta attraverso il calcolo del coefficiente di probabilità Analisi quantitativa delle immagini Colocalizzazione di segnale Punto critico : valutazione della probabilità di colocalizzazione casuale • • • • • P = 0.97% P = 0.55% Il coefficiente di correlazione di Pearson viene calcolato su uno dei due canali (PCC 1). Il secondo canale viene sottoposto ad un processo di smoothing (PSF size). Successivamente i pixel che compongono il secondo canale vengono riposizionati nella matrice in tutte le combinazioni possibili ed i rispettivi coefficienti di Pearson calcolati. Il coefficiente di Pearson del primo canale viene confrontato con la distribuzione dei coefficientidi Pearson calcolati sul secondo canale. Se il coefficiente di Pearson del primo canale non è superiore al 95% della distribuzione ottenuta sul secondo canale la probabilità che la colocalizzazione sia casuale è reale. L‟immagine deve essere scartata. Analisi quantitativa delle immagini Apertura al mondo esterno Programma IMARIS Piattaforme di analisi e calcolo Immagini & Computer Snc Via Don Carlo Riva 4 Bareggio (Mi) GRAZIE PER LA VOSTRA ATTENZIONE ! La piattaforma di visualizzazione ed analisi 3D/4D IMARIS Analisi quantitativa delle immagini Colocalizzazione di segnale Valutazione del livello di sovrapposizione spaziale di due segnali fluorescenti aventi caratteristiche spettrali (lunghezze d‟onda) di emissione differenti. L’analisi della colocalizzazione richiede: 1. Basso livello di rumore 2. Segnali non saturati 3. Nessuna sovrapposizione tra gli spettri di emissione dei fluorocromi (bleed through) 4. Funzione PSF dei singoli canali molto simile (richiede verifica PSF con bead multicolore) 5. Registrazione XYZ perfetta tra i due fluorocromi (shifting ottico) 6. Rimozione del fuori fuoco
