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Fondazione Filarete per le Bioscienze e l’Innovazione.
Analisi quantitativa delle immagini
30 Aprile 2010
Immagini & Computer S.n.c.
Via Don Carlo Riva 4
20010 Bareggio (Mi)
Analisi quantitativa delle immagini
“L’analisi quantitativa delle immagini rappresenta l’arte di trasformare
una sensazione visiva irrazionale nella sua forma schematica e discreta
consentendone la descrizione, la classificazione e l’interpretazione
matematica e logica univoca delle sue componenti spaziali e temporali.”
Analisi quantitativa delle immagini
Il microscopio moderno è uno strumento di imaging multidimensionale in grado di
visualizzare le strutture biologiche nel loro contesto spaziale naturale.
2D
3D
Si è passati da una visione 2D fissa (dall‟alto – perpendicolare al piano del campione) ad
una visione 3D libera nello spazio dove l‟osservatore può posizionarsi in qualsiasi punto
della scena (oppure ruotare la scena rispetto alla propria posizione).
Analisi quantitativa delle immagini
Oltre alla reale rappresentazione del campione nello spazio, siamo oggi in grado di
studiare altri parametri indispensabili per la comprensione dei comportamenti e dei
processi biologici.
Chimica
Cinetica
(fluorescenza, lifetime)
(time-lapse)
Microscopio
ottico
Fisica
(Fase, Polarizzazione)
Sistemi
Dinamici
Biologia
moderna
Analisi
quantitativa
Sistemi
Complessi
Struttura
(spazio 3D)
Risultati
High
Throughput
High Contest
Analisi quantitativa delle immagini
Dimensioni spaziali:
Molteplici fattori quali la morfologia 3D, la localizzazione, l‟orientamento, le
microstruttura e la connettività, influenzano il comportamento cellulare.
Dimensioni chimiche:
Sonde fluorescenti possono essere coniugate con elementi biochimici presenti in tessuti
e cellule con una elevata specificità.
Lo studio dei processi biologici a livello sub cellulare, delle interazioni proteina /
proteina, e delle dinamiche intracellulari consente di monitorare attività biofisiche e
biochimiche specifiche.
Dimensioni temporali:
Il comportamento cellulare e le dinamiche ad esso associate possono essere studiate nel
tempo.
Analisi quantitativa delle immagini
L‟esplorazione del campione attraverso la visualizzazione del volume.
BLEND
Visualizza tutti i punti lungo
l‟asse di osservazione
(trasparenza)
SHADING
MIP
Visualizza punti più
luminosi lungo l‟asse
di osservazione
Utilizza sorgenti di
illuminazione artificiali
Molti metodi unico obiettivo :
vedere bene per interpretare e
comprendere l‟evento.
ISOSURFACE
PROJECTION
Utilizza sorgenti di
illuminazione artificiali
(genera ombre)
Analisi quantitativa delle immagini
Il volume quale sorgente di informazioni
Analisi statistica dei singoli canali (fluorocromi)
Analisi quantitativa delle immagini
Il volume rappresenta le strutture come esse sono nella realtà.
Possiamo ruotarlo, tagliarlo e nasconderne parti alla vista rivelando od evidenziando
particolari d‟interesse.
Volume intero
Tutte le informazioni a
sinistra del piano di clipping
sono nascoste
Solo le informazioni relative al
singolo canale a sinistra del piano
di clipping sono nascoste
Analisi quantitativa delle immagini
La serie di piani focali che compongono il volume possono essere visualizzati sia
ortogonalmente che obliquamente dando origine a nuove viste del nostro campione.
Sezioni ortogonali
Sezioni oblique
Misura della distanza tra punti o
strutture giacenti su piani
ortogonali diversi
Visualizzazione e valutazione di
strutture ricostruite secondo un
piano prospettico non originale.
Analisi quantitativa delle immagini
Uno dei metodi di rappresentazione del volume è basato sulla creazione delle Isosuperfici.
Analisi quantitativa delle immagini
Le isosuperfici (Isosurface) sono generate attraverso la creazione matematica di una
struttura complessa di forme geometriche (triangoli) che descrivono la superficie del
volume.
Creazione della struttura
„wire frame“
Creazione della isosuperficie
Analisi quantitativa delle immagini
Le isosuperfici non hanno solo una valenza estetica ma risultano essenziali per la
quantificazione del volume.
Esse costituiscono il “guscio” che racchiude le nostre strutture dandogli forma e confini
precisi.
Intensità media, totale di
fluorescenza
Volume, superficie, diametri,
descrittori di forma, etc.
La struttura descritta dalle isosuperfici può essere misurata in dimensioni e forma.
Il segnale in essa confinato può essere quantificato.
Analisi quantitativa delle immagini
La documentazione del campione attraverso la rappresentazione del volume.
Creazione di filmati
Esportazione dei filmati in formati standard.
(AVI, MOV, QTVR)
Analisi quantitativa delle immagini
Misurare il volume e le sue componenti
Volume ricostruito
Misure di distanza lineari e non tra
punti nello spazio reale appartenenti
al volume.
Sezioni ortogonali
Analisi quantitativa delle immagini
Misure di distanza
Isosuperfici
Distanza tra oggetti calcolata tra 2 punti localizzati sulla superfici esterne.
Distanza tra oggetti calcolata tra i due centri dei volumi di interesse.
Analisi quantitativa delle immagini
Il profilo di intensità
Profilo di distribuzione della intensità di fluorescenza (singolo fluorocromo)
Analisi quantitativa delle immagini
Definizione delle strutture che compongono il volume
La isosuperficie costituisce il “guscio” che racchiude le nostra
struttura dandogli forma e confini precisi e rendendola misurabile in
dimensioni, forma e contenuto.
Definizione dell‟intervallo di intensità che
contiene gli oggetti (volume).
Analisi quantitativa delle immagini
Ottimizzazione dell‟immagine
Ripristino delle caratteristiche
originali delle immagini.
Rimozione del rumore
Deconvolulzione
Correzione degli artefatti
Decadimento (Photobleaching,ect)
Correzione Background
Disomogeneità illuminazione
Registrazione
Mosaicatura
Identificazione delle strutture
Segmentazione
Distinzione da altre strutture
Codifica dei confini e misura
Classificazione
Analisi quantitativa delle immagini
Definizione delle strutture che compongono il volume
Problemi di disomogeneità del segnale
E
D
C
F
A
Intensity
B
Position
A
B
C
D
E
F
Position
Intensity
Algoritmo di compensazione
del background
Analisi quantitativa delle immagini
La valutazione del campione.
Divisione delle strutture (volume splitting)
Separazione strutture non
riuscita in fase di definizione
delle Isosurface
Region Volume – Il raggio del singolo spot
è determinato sulla base del volume della
regione a cui esso appartiene.
Region Border– Il raggio dell„oggetto è
calcolato come la distanza minore dal
centro verso il bordo
Es. convesità o concavità
della struttura, variazioni
di intensità, ect.
Analisi quantitativa delle immagini
La valutazione del campione.
Estrazione dei parametri
Calcolo del volume, della superfice, della
Intensità media ed integrata e della
posizione di ogni oggetto
Analisi quantitativa delle immagini
La valutazione del campione.
Filtraggio e classificazione delle strutture in base a parametri dimensionali e di intensità
Filtraggio delle strutture
Insieme delle strutture definite
(isosuperfici)
Classificazione delle strutture
Analisi quantitativa delle immagini
La valutazione del campione.
Rappresentazione grafica e statistica delle misure
Esportazione dei risultati in
Excel o su file Ascii.
Analisi quantitativa delle immagini
La valutazione del campione.
Analisi cinetica
Valutazione del movimento delle strutture (variazione della
posizione) rispetto al tempo ed allo spazio.
Determinazione della direzione, velocità, accelerazione e
tipologia del moto di ogni singolo oggetto.
Quantificazione delle modifiche strutturali
(Dimensioni) e chimiche (intensità del
segnale) in relazione al tempo.
La valutazione delle variazioni di intensità
del segnale in oggetti fermi non è considerata
analisi cinetica.
Analisi quantitativa delle immagini
La valutazione del campione.
Analisi cinetica – tecniche di identificazione delle traccie
Browniano
Connesso
Autoregressivo
ta
r
r
tb
r
ta
tc
td
te
te
tb
tc
E‟ importante conoscere la natura del moto degli oggetti per poter selezionare l‟algoritmo adeguato alla loro
identificazione e monitoraggio.
r‘
Analisi quantitativa delle immagini
La valutazione del campione.
Analisi cinetica – analisi dei risultati
Statistica
Selezione (filtro)
Rappresentazione
Analisi quantitativa delle immagini
La valutazione del campione.
Analisi delle interazioni tra comparti cellulari

Distanza vescicole – Nuclei

Colocalizatione delle Vescicole (Intensità di un canale all‟interno
del volume vescicolare)

Distanza Vescicole–Membrana (più vicina)

Numero di Vescicole per nucleo

Densità delle vescicole per nucleo

Associazione Nucleo – Cellula

Numero di vescicole per cellula, Densità delle vescicole per
cellule, , Volume delle vescicole per cellula

Nuclei per Cellula

Volume del Nucleo / Volume del Citoplasma

Distanza media vescicole – Nuclei e vescicole vs Membrana (più
vicina)

Intensità delle vescicole per cellula
Analisi quantitativa delle immagini
La valutazione del campione.
Analisi delle interazioni tra comparti cellulari
Statistica
Rappresentazione
Analisi quantitativa delle immagini
La valutazione del campione.
Colocalizzazione
Colocalizzazione di oggetti
Oggetti che risultano parzialmente in
contatto o totalmente inseriti in altri
oggetti.
Colocalizzazione di segnale
Parti di strutture che mostrano una parziale o
totale sovrapposizione con altre strutture
differentemente marcate.
Analisi quantitativa delle immagini
La valutazione del campione.
Colocalizzazione
L’analisi della colocalizzazione richiede:
1. Basso livello di rumore
2. Segnale non saturato
3. Nessuna sovrapposizione tra gli spettri di emissione dei fluorocromi (bleedthrough)
4. Funzione PSF dei singoli canali molto simile (richiede verifica PSF con bead multicolore)
5. Registrazione perfetta tra i canali (verifica shifting ottico)
Calcolo automatico della soglia di intensità per
singolo canale.
Channel A
Fitted line along
which algorithm
proceeds
PC=0 for voxels below
thresholds
Channel B
Analisi quantitativa delle immagini
La valutazione del campione.
Analisi di filamenti
•Misurazione dell‟albero dendritico
•Identificazione delle spine e calcolo delle loro caratteristiche
strutturali (volume, ect)
•Diametro dei filamenti.
•Statistica distribuzione spine
•Orientamento dendriti
•Analisi dei livelli dei branches (generazioni)
•Classificazione spine
Analisi quantitativa delle immagini
La valutazione del campione.
Analisi di filamenti
Analisi quantitativa delle immagini
Chi offre tutte queste potenzialità ?
La piattaforma di visualizzazione ed analisi 3D/4D
IMARIS
Immagini & Computer Snc
Via Don Carlo Riva 4
Bareggio (Mi)
GRAZIE PER LA VOSTRA ATTENZIONE !
Analisi quantitativa delle immagini
La valutazione del campione.
Analisi cinetica – tecniche di identificazione delle traccie
E‟ altresi importante la capacità del programma di prevedere l‟evoluzione del moto degli oggetti nel tempo a
venire per poter mantenere la traccia identificata.