Esemplare certificato conforme Parigi, il 15 giugno 2007 Il

RISOLUZIONE ENO 5/2007
CODEX - GLUCOSIDASI
L’ASSEMBLEA GENERALE
Visto l’articolo 2, paragrafo 2 iv dell’accordo del 3 aprile 2001 che istituisce la
creazione dell’Organizzazione Internazionale della vigna e del vino,
Su proposta della Sottocommissione dei “metodi d’analisi” , e del gruppo d’esperti
“specificazioni dei prodotti eonologici”
DECIDE di completare il Codex Enologico internazionale con la seguente monografia:
GLUCOSIDASI
(attività ß-D-glucosidasi)
(EC 3.2.1.21 – CAS n° 9001-22-3)
Specifiche generali
Questi enzimi non sono stati trovati allo stato puro, ma sono presenti all’interno di un
complesso enzimatico. Salvo indicazioni contrarie, le specifiche devono essere conformi alla
risoluzione œno 14/2003 relativa alle specifiche generali per le preparazioni enzimatiche
che figurano nel Codice Enologico internazionale.
1.
Origine e applicazione enologica
Gli enzimi di tipo glucosidasi sono utilizzati per lo sviluppo degli aromi dei mosti e dei
vini a partire dai loro precursori glicosilati.
I preparati enzimatici contenenti queste attività provengono da fermentazioni dirette da
Aspergillus niger.
Attività secondarie: proteasi, cinnamil esterasi (quest’ultima deve essere la più limitata
possibile). Il metodo di misura dell’attività cinnamil esterasi è descritto altrove. In questo
caso si può applicare la clausola dei 50% (risoluzione Eno 14/2003 4.1)
2.
Campo d’applicazione
Il metodo di dosaggio è stato messo a punto con l’aiuto di una ß-D-glucosidasi
reperibile in commercio (5.5.). Le condizioni ed il metodo sono stati sviluppati per
l’applicazione ai preparati enzimatici commerciali reperibili sul mercato enologico.
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3.
Principio
L’idrolisi enzimatica del ß-D-Glucopiranoside di p-nitrofenile che è incolore, libera glucosio e
para-Nitrofenolo (p-Np); quest’ultimo assume una colorazione gialla in presenza di
carbonato di sodio e se ne misura l’assorbanza a 400 nm.
4.
Attrezzatura
4.1 agitatore magnetico
4.2 bagno d’acqua a 30°C
4.3 bagno d’acqua a 100°C
4.4 cuvette monouso da 1 cm di cammino ottico, per misure spettrofotometriche nel
visibile
4.5 ghiaccio tritato
4.6 siringhe di precisione 500 – 5000 µL
4.7 siringhe di precisione 100 µL
4.8 siringhe di precisione 1000 µL
4.9 spettrofotometro
4.10 provette eppendorf
4.11 matracci tarati da 100
mL
4.12 pH-metro
4.13 camera fredda a 4°C
4.14 supporto metallico per provette eppendorf
4.15 cotone cardato
4.16 carta Kraft
4.17 agitatore di tipo vortex
4.18 cronometro
4.19 provette in vetro da 15 mL
5.
Prodotti
5.1 Carbonato di sodio (Na2CO3 puro al 99,5% - PM : 105,99 g/mole)
5.2 Acetato di sodio (CH3COONa puro al 99% - PM : 82 g/mole)
5.3 Acido acetico (CH3COOH puro al 96% - PM : 60 g/mole)
5.4 ß-D-Glucopiranoside di p-nitrofenile (Fluka, rif.73676) a titolo di esempio
5.5 ß-D-glucosidasi (Fluka; 250 mg; 6,3 U/mg, rif. 49290) a titolo di esempio. Una unità
corrisponde alla quantità di enzima necessaria per liberare 1 µmole di glucosio al minuto a
pH 5 e 35 °C.
5.6 p-nitrofenolo (p-Np) (C6H5NO3 puro al 99,5% - PM : 139,11 g/mole)
5.7 Acqua distillata
5.8 Preparazione enzimatica reperibile in commercio da analizzare
6.
Soluzioni
6.1 Tampone acetato di sodio (100 mM, pH 4,2)
È costituito dalle soluzioni A e B.
6.1.1 Soluzione A: introdurre 0,5 g d’acetato di sodio (5.2) in 60 mL d’acqua distillata (5.7)
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6.1.2 Soluzione B: introdurre 1 mL d’acido acetico (5.3) in 175 mL d’acqua distillata (5.7)
6.1.3 Preparazione del tampone acetato di sodio: Miscelare 47,8 mL di soluzione A (6.1.1) +
152 mL di soluzione B (6.1.2).
Verificare il pH del tampone mediante un pH-metro (4.12).
Conservare a 4°C .
6.2 Soluzione di ß-D-Glucopiranoside di p-nitrofenile 4mM
Mettere 0,096 g di ß-D-Glucopiranoside di p-nitrofenile (5.4) in 80 mL di tampone acetato di
sodio (6.1.).
6.3 Soluzione di carbonato di sodio 1M
Nel matraccio tarato da 100 mL (4.11) sciogliere 10,6 g di carbonato di sodio (5.1) in acqua
distillata (5.7) e portare a volume sempre con acqua distillata (5.7) La soluzione può essere
conservata a 4°C (4.13).
6.4 Soluzione madre di p-nitrofenolo (p-Np) a 125 µg/mL
Sciogliere 0,01 g di p-Np (5.6) in 80 mL d’acqua distillata (5.7).
La soluzione madre deve essere preparata al momento.
7.
Preparazione delle soluzioni standard di p-nitrofenolo(p-Np) da 0 a 50
µg/mL
Le soluzioni sono ottenute a partire dalla soluzione madre di p-nitrofenolo (p-Np) (6.4.)
come indicato nella Tabella 1.
Tabella1 : Soluzioni standard di para-Nitrofenolo
Quantità di p-NP (µg)
Concentrazione in p-NP (µg/mL)
0
0
Concentrazione in p-NP µmol/mL)
0
Volume di soluzione madre a (6.4) (µL) 0
Acqua distillata (5.7) (µL)
200
2
10
4
20
6
30
8
40
10
50
0,072
0,14
0,22
0,29
0,36
16
184
32
168
48
152
64
136
80
120
8.
Preparazione del campione
E’ importante omogeneizzare la preparazione enzimatica prima del prelievo del campione,
per esempio tramite il capovolgimento del recipiente. La soluzione enzimatica ed i bianchi
devono essere preparati al momento.
8.1 Soluzione enzimatica a 10 g/l
Mettere 1g di preparato commerciale (5.8) in un matraccio tarato da 100 mL (4.11), portare
a volume con acqua distillata (5.7), agitare (4.1) al fine di ottenere una miscela omogenea.
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8.2 Bianco denaturato tramite riscaldamento
Mettere 10 mL della soluzione enzimatica a 2 g/l (8.1) in una provetta da 15 mL (4.19),
tappare con cotone cardato (4.15) ricoperto da carta Kraft (4.16) ed immergere la provetta
per 5 minuti nel bagno d’acqua a 100°C (4.3).
9.
Modo di operare
9.1 Reazione enzimatica: Le provette sono realizzate almeno in doppio.
Nelle 5 provette eppendorf (4.10) numerate da 1 a 5, sistemate in un supporto (4.14) nel
ghiaccio tritato (4.5) introdurre
100 µL della soluzione di ß-D-Glucopiranoside di p-nitrofenile (6.2), con l’aiuto di una siringa
di precisione (4.7),
100 µL della soluzione enzimatica a 2 g/l (8.1), azionare il cronometro (4.18)
Dopo averle agitate (4.17), mettere le provette eppendorf nel bagno d’acqua a 30 °C (4.2)
Per la durata di 1 min per la provetta n° 1
Per la durata di 2 min per la provetta n° 2
Per la durata di 5 min per la provetta n° 3
Per la durata di 10 min per la provetta n° 4
Per la durata di 15 min per la provetta n° 5
La reazione si blocca mettendo ogni provetta numerata da 1 a 5 in una vasca di ghiaccio
tritato (4.5) immediatamente dopo averla tolta dal bagno d’acqua a 30°C.
9.2 Dosaggio del p-nitrofenolo liberato
Nelle provette eppendorf contenenti le diverse soluzioni di reazione (9.1)
aggiungere 600 µL di soluzione di carbonato di sodio (6.3), mediante una siringa di precisione
(4.8),
1,7 mL d’acqua distillata (5.7), mediante di una siringa di precisione (4.6),
mettere la miscela ottenuta in una cuvetta (4.4).
Misurare subito l’assorbanza a 400 nm, mediante uno spettrofotometro (4.9)
9.3 Bianchi
Procedere come descritto al punto 9.1 sostituendo la soluzione enzimatica a 2 g/l (8.1) con il
bianco denaturato tramite calore (8.2). L’ideale è realizzare la reazione enzimatica dei
bianchi contemporaneamente a quella della soluzione enzimatica.
9.4 Campione
Procedere come descritto al punto 9.2 sostituendo la soluzione di reazione (9.1) con le
soluzioni standard di p-nitrofenolo da 0 a 50 µg/mL (7).
10.
Calcoli
10.1 Realizzazione di una cinetica
In generale, il calcolo dell’attività enzimatica può essere effettuato solo se il substrato e
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l’enzima non sono in quantità limitanti. Ci si posiziona allora nella parte ascendente della
curva, in questa fase l’attività enzimatica è lineare nel tempo. In caso contrario, l’attività
sarebbe sottostimata. (Figura 1).
cinetica della reazione enzimatica
assorbanza
plateau
fase ascendente
tempo (min)
Figura 1 : Cinetica della reazione enzimatica
Si realizza una cinetica su 12 minuti. L’attività relativa è misurata a T=1 min T=2 min, T=4
min, T=6 min T=8 min T=10 min, T=12 min.
Dopo aver realizzato la cinetica di reazione enzimatica, ottenere la curva di variazione
dell’assorbanza in funzione del tempo di reazione. L’assorbanza corrisponde alla differenza
tra l’assorbanza della preparazione enzimatica e quella del bianco corrispondente ad un
tempo T.
Calcolare poi l’equazione (1) della retta di regressione tenendo conto solamente dei punti
della fase ascendente. (vedi figura 1)
10.2 Realizzazione della retta di calibrazione
La retta di calibrazione corrisponde ad un grafico avente per ascissa le differenti
concentrazioni delle soluzioni standard di p.nitrofenolo (da 0 a 0,36 µmoli/mL) e per ordinata
i valori di densità ottiche corrispondenti, ottenuti al punto 9.4. Calcolare poi la pendenza
(Q/T) della retta di regressione (2) che risulta dalla linearità dei dati del grafico.
10.3 Calcolo dell’attività enzimatica
A partire dalla retta di regressione (1) calcolare l’assorbanza per un tempo medio T (per
esempio 4 min nel caso della figura 1) ricavare la quantità Q di p.nitrofenolo liberato (in
µmoli) per questo tempo intermedio con l’aiuto dell’equazione (2).
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La formula per calcolare l’attività enzimatica in U/g di preparato è la seguente :
U/g = 1000 × (Q T ) (V × C)
Dove Q: quantità di p.nitrofenolo formato in µmole durante un tempo T (min)
V: quantità di soluzione enzimatica introdotta (mL) in questo caso 0,1 mL
C: concentrazione della soluzione enzimatica (g/l) in questo caso 2 g/l
Si può poi esprimere l’attività enzimatica in nanokatal. Questa unità corrisponde al numero di
nanomoli di prodotto formato al secondo nelle condizioni definite dai protocolli di dosaggio e
quindi :
Attività in nkat/g = (attività in U /g) * (1000/60)
11. Caratteristiche
La ripetibilità del metodo è stimata tramite la deviazione standard dei valori di assorbanza
ottenuti da uno stesso prelievo della preparazione enzimatica, dosato 5 volte. Così, per il
dosaggio della ß-D-Glucosidasi la media deviazione standard dei valori è di 0,01 con una
percentuale di errore dell’8,43. La % d’errore corrisponde a:
(deviazione standard dei valori x 100)
media dei valori delle prove
In questo modo il metodo di dosaggio presentato è giudicato ripetibile.
Le prove di riproducibilità sono state effettuate mediante di 2 preparazioni enzimatiche e 5
prelievi di campioni per ognuna.
Sono state utilizzate 2 prove che hanno permesso di determinare la buona riproducibilità
del metodo :
- l’analisi della varianza (studio della probabilità di comparsa degli scarti tra i
prelievi di campione). L’analisi di varianza è un metodo statistico che permette di
testare l’ipotesi di omogeneità di un insieme di k medie. Effettuare l’analisi di
varianza vuol dire verificare se l’effetto « trattamento » è « significativo o no »
- l’efficacia del test al rischio α di prima specie (5%) - Il rischio α di prima specie è
il rischio di decidere che trattamenti effettivamente identici, sono diversi.
Se l’efficacia è debole (≅ 20%), vuol dire che non è stata scoperta alcuna
differenza tra i trattamenti, ma esistono poche probabilità di vedere una differenza
qualora ne fosse realmente esistita una.
Se l’efficacia è elevata (≅ 80%), vuol dire che non è stata scoperta alcuna
differenza tra i trattamenti, ma, qualora ne fosse esistita una, avevamo i mezzi
per vederla.
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I risultati sono riportati nella tabella 2.
Dosaggi
Ipotesi
dell’analisi di
varianza
ß-Dglucosidasi
Rispettate
Probabilità Efficacia della
Test
Test
prova (α = 5%) Newman- Bonferroni
Keuls (*)
(**)
Non
Non
0,0285
42%
significativo significativo
Tabella 2 : Analisi della varianza – studio dell’effetto del prelievo di campione
* Test Newmann-Keuls: questo test di confronto delle medie permette di costituire gruppi omogenei di
trattamenti: quelli appartenenti a un medesimo gruppo sono considerati non differenti al rischio α di prima
specie scelto
** Test di Bonferroni: chiamato anche « test del t corretto », il test di Bonferroni permette di realizzare
tutti i confronti di medie 2 a 2, cioè (t (t-1) )/2 confronti prima dei trattamenti, rispettando il rischio α di
prima specie scelto.
In questo modo, le prove attuate permettono di vedere una differenza se realmente ne
esiste una (efficacia della prova forte); il metodo di dosaggio presenta inoltre una
probabilità di comparsa di scarto d’attività (tra le prese di campione) inferiore al 5%,
rafforzata da una appartenenza a uno stesso gruppo (Test Newmann-Keuls non
(Test
significativo) e considerata come non diversa al rischio α di prima specie.
Bonferroni non significativo).
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