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RISOLUZIONE OIV/ENO 313/2009
CODEX – EMICELLULASI
L’ASSEMBLEA GENERALE
Visto l’articolo 2, paragrafo 2 iv dell’accordo del 3 aprile 2001 che istituisce la
creazione dell’Organizzazione internazionale della vigna e del vino,
Su proposta della Sottocommissione dei metodi d’analisi e del gruppo
d’esperti « Specificazione dei prodotti enologici »,
DECIDE di completare il Codice enologico internazionale con la seguente monografia:
EMICELLULASI
(attività galattanasi)
(EC 3.2.1.89 – CAS n° 58182-40-4)
Specifiche generali
Questi enzimi non sono stati trovati allo stato puro ma sono presenti all’interno di un
complesso enzimatico. Salvo indicazioni contrarie, le specifiche devono essere conformi alla
risoluzione relativa alle specifiche generali per le preparazioni enzimatiche che figurano nel
Codice enologico internazionale
1. Origine e campo d’ applicazione
Le emicellulasi catalizzano la degradazione delle emicellulose (galactani, xiloglucani,
arabinoxilani, glucurono-arabino-xilani mannani glucomannani). Esse sono utilizzate al
momento della macerazione dell’uva. Questa attività può essere stimata attraverso l’idrolisi
di galactani di patata.
I preparati enzimatici contenenti queste attività provengono dalle fermentazioni dirette
dell’Aspergillus niger e/o della miscela di Aspergillus niger – Trichoderma reesei.
Attività principali che accompagnano le attività Emicellulasi (arabanasi, galattanasi,
xilanasi, ramnosidasi) :
 Poligalatturonasi
 Pectina / pectato-liasi
 Pectina metilesterasi
Attività secondarie : proteasi, cellulasi, beta-glucosidasi. A queste attività è applicabile
la clausola dei 50 % (monografia sulle “Preparazioni enzimatiche” 4.1)
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2. Campo d’applicazione
Il metodo di dosaggio è stato messo a punto con l’aiuto di una galattanasi reperibile in
commercio. Le condizioni ed il metodo sono stati sviluppati per l’applicazione ai preparati
enzimatici commerciali reperibili sul mercato enologico.
3. Principio
Le galattanasi catalizzano l’idrolisi delle catene di arabinogalattano e liberano così le estremità
riducenti degli zuccheri costitutivi. La misura dell’attività galattanasi si basa sul dosaggio del
galattosio secondo il metodo NELSON (1944). In ambiente alcalino, il gruppo pseudoaldeidico
degli zuccheri riduce gli ioni rameici Cu2+. Questi ultimi reagiscono con il reagente
arseniomolibdico producendo una colorazione blu la cui assorbanza, misurata a 520 nm, varia
in modo lineare con la concentrazione in zuccheri riducenti (tra 0 e 400 µg/mL).
4. Attrezzatura
4.1 Agitatore magnetico
riscaldante 4.2 bagno d’acqua a
40°C
4.3 bagno d’acqua a 100°C
4.4 becker da 100 mL
4.5 centrifuga adatta a contenere provette di vetro da 15 mL
4.6 cronometro
4.7 matracci tarati da 100 mL
4.7.1 matracci tarati da 500 mL
4.8 Siringa di precisione da 200 µL
4.8.1 siringa di precisione da 1 mL
4.9 pipetta da 10 mL graduata a 1/10 di mL
4.10 spettrofotometro
4.11 provette in vetro da 15 mL
4.12 agitatore di tipo vortex
4.13 matraccio in vetro scuro da 500 mL
4.14 camera fredda a 4°C
4.15 stufa a 37°C
4.16 cotone cardato
4.17 carta Kraft
4.18 pH-metro
4.19 supporto metallico per provette da 15 mL
4.20 cuvette monouso da 1 cm di cammino ottico, per misure spettrofotometriche nel
visibile.
5. Prodotti
5.1 Acetato di sodio (CH3COONa puro al 99 % - PM = 82 g/mol)
5.2 acido acetico (CH3COOH puro al 96 % - PM = 60 g/mol, densità = 1,058)
5.3 galattano di patata (Megazyma, lotto 71201) a titolo di esempio. Se tale substrato non
fosse disponibile, il substrato alternativo dovrà essere verificato e validato per questo metodo.
5.4 solfato di sodio anidro (Na2SO4 puro al 99,5 % - PM = 142 g/mol)
5.5 carbonato di sodio anidro (Na2CO3 puro al 99,5 % - PM = 105,99 g/mol)
5.6 tartrato di potassio e di sodio (KNaC4H4O6.4H2O puro a 99 % - PM = 282,2 g/mol)
5.7 idrogenocarbonato di sodio anidro (NaHCO3 puro al 98 % - PM = 84,01 g/mol)
5.8 solfato di rame pentaidrato (CuSO4 ·5H2O puro al 99 % - PM = 249,68 g/mol)
5.9 acido solforico (H2SO4 puro al 98 %) concentrato
5.10 eptamolibdato d’ammonio ((NH4) 6MO7O24.4H2O puro al 99 % - PM = 1235,86 g/mol )
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5.11 idrogenoarseniato di sodio (Na2HAsO4.7H2O puro al 98,5 % - PM = 312,02 g/mol). Data la
tossicità di questo prodotto, particolare attenzione dovrà essere posta durante l’utilizzo. I
materiali di scarto dovranno essere trattati in modo adeguato.
5.12 D-galattosio (C6H12O6 puro al 99 % - PM = 180,16 g/mol)
5.13 acqua distillata
5.14 preparato enzimatico commerciale da analizzare.
6. Soluzioni
6.1 Reagenti della soluzione ossidante
Questi reagenti dovranno essere preparati per primi, tenuto conto del termine di 24 ore
per la soluzione D.
6.1.1 Soluzione A:
mettere in un becker da 100 mL (4.4) in successione
20 g di solfato di sodio anidro (5.4)
2,5 g di carbonato di sodio anidro (5.5)
2,5 g di tartrato di potassio e di sodio (5.6)
2 g di idrogenocarbonato di sodio anidro (5.7)
sciogliere in 80 mL d’acqua distillata (5.13). Scaldare (4.1) fino alla dissoluzione e travasare
in un matraccio tarato da 100 mL (4.7). Portare a volume con acqua distillata (5.13).
Conservare a 37 °C (4.15); se si forma un deposito: filtrare.
6.1.2 Soluzione B:
sciogliere 15 g di solfato di rame pentaidrato (5.8) in 100 mL d’acqua distillata (5.13) e
aggiungere una goccia d’acido solforico concentrato (5.9).
6.1.3 Soluzione C:
questa soluzione è preparata al momento per ottenere una buona proporzionalità tra la
densità di colore e la quantità di glucosio mescolando 1 mL di soluzione B (6.1.2) con 24 mL
di soluzione A (6.1.1).
6.1.4 Soluzione D:
In un matraccio tarato da 500 mL (4.7.1), sciogliere 25 g di eptamolibdato d’ammonio (5.10)
in 400 mL d’acqua (5.13). Aggiungere 25 mL d’acido solforico concentrato (5.9) (raffreddato
sotto acqua corrente fredda).
In un becker da 100 mL (4.4) sciogliere 3 g d’idrogenoarseniato di sodio (5.11) in 25 mL
d’acqua (5.13) e travasare quantitativamente nel matraccio graduato da 500 mL (4.7.1)
contenente il molibdato d’ammonio (5.10).
Portare a volume con acqua distillata (5.13) .
Tenere a 37°C (4.15) per 24 ore poi conservare a 4°C (4.14) in un matraccio in vetro scuro
da 500 mL (4.13).
6.2 Tampone acetato di sodio (pH 4,2, 100 mmol/L)
È costituito dalle soluzioni A e B.
6.2.1 Soluzione A- acetato di sodio 0,1 M: sciogliere 0,5 g d’acetato di sodio (5.1) in 60 mL
d’acqua distillata (5.13)
6.2.2 Soluzione B- acido acetico 0,1 M: allungare 1 mL d’acido acetico (5.2) con 175 mL
d’acqua distillata (5.13)
6.2.3 Preparazione del tampone acetato di sodio: miscelare 23,9 mL di soluzione A (6.2.1)
+ 76,1 mL di soluzione B (6.2.2).
Verificare il pH del tampone con l’aiuto di un pH-metro (4.18).
La soluzione deve essere conservata a 4°C (4.14).
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6.3 Soluzione di galattano di patata a 1 % (p/v)
In un matraccio tarato da 100 mL (4.7) sciogliere 1 g di galattano di patata (5.3) e portare a
volume con tampone acetato di sodio (6.2).
6.4 Soluzione madre di Galattosio a 400 µg/mL
In un matraccio tarato da 100 mL (4.7) sciogliere 0,040 g di galattasio (5.12) e portare a
volume con acqua distillata (5.13).
7. Preparazione delle soluzioni standard di galattosio
Le soluzioni standard vengono ottenute a partire dalla soluzione madre di galattosio (da 0 a
400 µg/mL) (6.4) come indicato nella tabella 1.
Tabella 1: Soluzioni standard di galattosio
Galattosio (µg/mL)
Galattosio (µmole/mL)
Vol soluzione madre (µL) (6.4)
Vol acqua distillata (µL) (5.13)
0
50
0
0,278
0
125
1000 875
100 150
0,555 0,833
250 375
750 625
200
1,110
500
500
250
1,388
625
375
300
1,665
750
250
400
2,220
1000
0
8. Preparazione del campione
È importante omogeneizzare la preparazione enzimatica prima del prelievo del campione, per
esempio tramite il capovolgimento del recipiente. La soluzione enzimatica ed i campioni di
riferimento (bianco) devono essere preparati al momento.
8.1 Soluzione enzimatica a 2 g/L
Mettere 200 mg di preparazione commerciale (5.14) in un matraccio tarato da 100 mL (4.7),
portare a volume con acqua distillata (5.13), agitare al fine di ottenere una miscela
omogenea.
8.2 Bianco denaturato tramite riscaldamento
Mettere 10 mL della soluzione enzimatica a 2 g/L (8.1) nella provetta da 15 mL (4.11), tappare
con cotone cardato (4.16) ricoperto da carta Kraft (4.17) ed immergere la provetta per 5 minuti
nel bagno d’acqua a 100° C (4.3).
9. Modo di operare
9.1 Reazione enzimatica: Le provette sono realizzate almeno in doppio.
Nelle 5 provette da 15 mL (4.11) numerate da 1 a 5, sistemate in un supporto (4.19)
introdurre
200 µL di soluzione enzimatica a 2 g/L (8.1), mediante la siringa di precisione (4.8),
400 µL di tampone acetato di sodio (6.2), mediante la siringa di precisione (4.8.1),
600 µL di galattano di patata (6.3), azionare il cronometro (4.6)
Dopo averle agitate (4.12), le provette tappate con cotone cardato (4.16) e carta Kraft
(4.17) sono sistemate nel bagno d’acqua a 40 °C (4.2)
Per la durata di 1 min per la provetta n° 1 Per
la durata di 2 min per la provetta n° 2 Per la
durata di 5 min per la provetta n° 3 Per la
durata di 10 min per la provetta n° 4 Per la
durata di 15 min per la provetta n° 5
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La reazione si blocca mettendo ogni provetta numerata da 1 a 5 nel bagno d’acqua a 100°C
(4.3) per 10 min immediatamente dopo averla tolta dal bagno d’acqua a 40°C,
Le provette sono in seguito raffreddate sotto acqua corrente fredda.
9.2 Dosaggio delle sostanze riducenti liberate (in questo caso galattosio)
In una provetta da 15 mL (4.11)
mettere 1 mL di soluzione di reazione (9.1)
aggiungere 1 mL di soluzione C (6.1.3)
dopo aver agitato (4.12), la provetta è messa in bagno d’acqua a 100°C (4.3) per 10
min. La provetta è successivamente raffreddata sotto acqua corrente fredda.
Aggiungere 1 mL di soluzione D (6.1.4)
aggiungere 9,5 mL d’acqua (5.14) mediante la pipetta da 10 mL (4.9)
attendere 10 min per la stabilizzazione del colore.
Centrifugare (4.5) ogni provetta a 5000 giri/min per 10 min.
Mettere il surnatante in una cuvetta (4.20).
Misurare subito l’assorbanza a 520 nm, mediante uno spettrofotometro (4.10).
9.3 Soluzioni di riferimento (bianco)
Procedere come descritto al punto 9.1 sostituendo la soluzione enzimatica a 2 g/L (8.1) con il
bianco denaturato tramite riscaldamento (8.2). L’ideale è realizzare la reazione enzimatica dei
campioni di bianco contemporaneamente a quella della soluzione enzimatica.
9.4 Campione
Procedere come descritto al punto 9.2 sostituendo la soluzione di reazione (9.1) con le diverse
soluzioni standard di galattosio da 0 a 400 µg/mL (7).
10. Calcoli
10.1 Realizzazione di una cinetica
In generale, il calcolo dell’attività enzimatica può essere effettuato solo se il substrato e
l’enzima non sono in quantità limitanti. Ci si posiziona allora nella parte ascendente della
curva: in questa fase l’attività enzimatica è lineare nel tempo. In caso contrario, l’attività
sarebbe sottostimata (Figura 1).
cinetica
reazione
enzimatica
cinétiquedella
de réaction
enzymatique
0,7
absorbance
assorbanza
0,6
0,5
plateau
0,4
0,3
0,2
phaseascendente
ascendante
fase
0,1
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
temps
(min)
tempo
(min)
Figura 1. Cinetica della reazione enzimatica
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Si realizza una cinetica su 15 minuti. L’attività relativa è misurata a T=1 min T=2 min, T=5
min, T=10 min, T=15 min.
Dopo aver realizzato la cinetica di reazione enzimatica, ottenere la curva di variazione
dell’assorbanza in funzione del tempo di reazione. Il fattore di assorbanza corrisponde alla
differenza tra l’assorbanza del preparato enzimatico e del bianco corrispondente ad un tempo
T. Calcolare poi l’equazione (1) della retta di regressione tenendo conto solamente dei punti
della fase ascendente (vedi figura 1).
10.2 Realizzazione della retta di calibrazione
La retta di calibrazione corrisponde ad un grafico avente in ascissa le differenti concentrazioni
di campione di galattosio (da 0 a 2,220 µmol/mL) e in ordinata i valori delle densità ottiche
corrispondenti, ottenuti al punto 9.4. Calcolare poi la pendenza (Q/T) della retta di
regressione (2) che risulta dalla linearità dei dati del grafico.
10.3 Calcolo dell’attività enzimatica
A partire dalla retta di regressione (1) calcolare l’assorbanza per un tempo medio T (per
esempio 4 min nel caso della figura 1) ricavare la quantità Q di galattosio liberato (in µmol)
per questo tempo intermedio con l’aiuto dell’equazione (2).
La formula per calcolare l’attività enzimatica in U/g di preparato è la seguente :
Attività en U/g = 1000 x (Q/T)/(VxC)
Dove Q: quantità di galattosio formatasi in µmoli durante un tempo T (min)
V : quantità di soluzione enzimatica introdotta (mL) in questo caso 0,2 mL
C: concentrazione della soluzione enzimatica (g/L) in questo caso 2 g/L
Si può poi esprimere l’attività enzimatica in nanokatal. Questa unità corrisponde al numero di
nanomoli di prodotto formato al secondo nelle condizioni definite dai protocolli di dosaggio e
quindi :
Attività in nkat/g = attività in U /g x 1000/60
11. Caratteristiche
r= 0,056
R= 0,056
Sr= 0,02
SR= 0,02
La ripetibilità del metodo è stimata tramite la deviazione standard dei valori di assorbanza
risultanti da uno stesso prelievo della preparazione enzimatica, dosato 5 volte. Così, per il
dosaggio della galattanasi la deviazione standard dei valori è di 0,02 con una percentuale di
errore del 9,7 %. La % di errore corrisponde a:
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(deviazione standard x 100)
media dei valori delle prove
In questo modo il metodo di dosaggio così presentato è giudicato ripetibile.
Le prove di riproducibilità sono state effettuate mediante 2 preparazioni enzimatiche e 5
prelievi di campioni per ognuna.
Sono state utilizzate 2 prove che hanno permesso di determinare la buona riproducibilità
del metodo :
- l’analisi della varianza (studio della probabilità di comparsa degli scarti tra i
campionamenti). L’analisi della varianza è un metodo statistico che permette di
testare l’ipotesi di omogeneità di un insieme di k medie. Compiere l’analisi di
varianza vuol dire verificare se l’effetto « trattamento » è « significativo o no »
- l’efficacia del test al rischio  di prima specie (5 %) - Il rischio  di prima specie è il
rischio di decidere che trattamenti effettivamente identici, sono diversi.
Se l’efficacia è debole ( 20 %), vuol dire che non è stata scoperta alcuna
differenza tra i trattamenti, ma esistono poche probabilità di vedere una differenza
qualora ne fosse realmente esistita una.
Se l’efficacia è elevata ( 80 %), vuol dire che non è stata scoperta alcuna
differenza tra i trattamenti, ma, qualora ne fosse esistita una, si possiedono i mezzi
per vederla.
I risultati sono riportati nella tabella seguente.
Dosaggi
Ipotesi
dell’analisi di
varianza
Galattanasi
Rispettata
Probabilità Efficacia della
Test
Test
prova ( = 5%) Newman- Bonferroni
(**)
Keuls (*)
0,00087
93%
Significativa Significativa
Tabella 1. Analisi di varianza – studio dell’effetto presa di campione
* Test Newmann-Keuls: questo test di confronto delle medie permette di costituire gruppi
omogenei di trattamenti: quelli appartenenti a un medesimo gruppo sono considerati non differenti
al rischio  di prima specie scelto
** Test di Bonferroni: chiamato anche « test del t corretto », il test di Bonferroni permette di
realizzare tutti i confronti di medie 2 a 2, cioè (t (t-1) )/2 confronti prima dei trattamenti,
rispettando il rischio  di prima specie scelto.
In questo modo, le prove attuate permettono di vedere una differenza se realmente ne
esiste una (elevata efficacia del test); il metodo di dosaggio presenta inoltre una
probabilità di comparsa di scarto d’attività (tra i campionamenti) inferiore al 5 %
rafforzata da un’appartenenza a uno stesso gruppo (Test Newmann-Deuls non
significativo) e considerata come non differente al rischio  di prima specie (Test Bonferroni
non significativo)
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12. Bibliografia
NELSON N., A photometric adaptation of the SOMOGYI method for the determination of
glucose. The may Institute for medical research of the Jewish hospital, 1944. p 375-380.
Thierry Doco, et al., Polysaccharides from grape berry cell walls. Part II. Structural
characterization of the xyloglucan polysaccharides, Carbohydrate Polymers, Volume 53, Issue
3, 15 August 2003, Pages 253-261,
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