gennaio–marzo 2015

AreaPediatrica | Vol. 16 | n. 1 | gennaio–marzo 2015
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Caso clinico Titolo articolo anche lungo
[ tutto
su
]
Whole Exome Sequencing (WES)
nei Disturbi dello Spettro Autistico
L’identificazione delle vie patogenetiche alle quali appartengono i geni implicati
potrà avere implicazioni diagnostiche e terapeutiche.
Introduzione
I
l metodo si basa sul sequenziamento delle porzioni codificanti del genoma in uno o più soggetti
affetti dalla patologia.4 Nella Tabella 1 è schematizzata
la procedura metodologica della tecnica utilizzata per
l’identificazione di geni-malattia. Il sequenziamento
dell’esoma con le moderne metodiche permette di ottener circa il 95% delle sequenze codificanti di un individuo e di rilevare con elevata accuratezza migliaia di
variazioni di basi nucleotidiche. Tali variazioni vengono
denominate polimorfismi a singolo nucleotide (SNP,
Tabella 1.
Metodologia per l’identificazione di geni-malattia
con Whole-Exome-Sequencing (WES)
1.
Reclutamento di pazienti affetti dalla patologia in oggetto
2.
Esecuzione di prelievo ematico e estrazione del DNA
3.
Sequenziamento dell’esoma
4.
Identificazione di varianti codificanti
5.
Analisi bioinformatica, confronto delle variazioni riscontrate
con quelle riportate nei databases
6.
Esclusioni delle varianti comuni non patogenetiche
7.
Selezione di geni candidati
8.
Validazione funzionale delle mutazioni diagnosticate
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Cos’è il Whole Exome Sequencing (WES)?
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I
Disturbi dello Spettro Autistico
single nucleotide polymorphism) quando si
Caterina D’Ardia
Marina Digilio
(Autism Spectrum Disorders, ASD) sono
verificano con una certa frequenza all’interno
Gabriel Levi
definiti dalla presenza di deficit nell’intedi una popolazione e varianti a singolo nucleDipartimento di Pediatria
razione sociale e nella comunicazione sociale, e Neuropsichiatria
otide (SNV, single nucleotide variant) quando
Infantile
“Sapienza”
–
insieme alla presenza di pattern di comportasono identificate sporadicamente. Al fine di
Università di Roma
mento, interessi o attività ristretti e ripetitivi.
restringere il numero di variazioni tra le quali
Il quadro sintomatologico è variabile a seconda del livello può essere inclusa quella patogenetica, si utilizzano opdi sviluppo e dell’età. La prevalenza è di circa 60/10000 portuni filtri. L’operazione di filtro è basata sul confronto
(0,6%, rapporto maschi:femmine di 3:1)1. L’eziologia degli delle variazioni riscontrate nello studio con quelle riporASD è prevalentemente non nota, ma numerose evidenze tate nei database dbSNP, progetto HapMap, 1000 Gesono indicative per una patologia “multifattoriale” con una nome project ‒ disponibili online ‒ e con risultati otteforte base di predisposizione genetica2,3. L’identificazione nuti nelle casistiche di individui sani analizzati mediante
di nuovi geni-malattia si è rivoluzionata grazie alla dispo- la stessa tecnica. Nel momento in cui sono identificate
nibilità di tecniche molecolari di ultima generazione che in soggetti affetti dalla patologia in studio specifiche
consentono il sequenziamento dell’intero genoma (WGS, varianti ritenute potenzialmente patogenetiche perché
“Whole Genome Sequencing”). Il sequenziamento dell’e- in interessanti specifici “geni candidati”, queste vengono
soma (WES, “Whole Exome Sequencing”) studia invece successivamente ricercate su altri soggetti affetti dalla
le sole porzioni codificanti del genoma e costituisce un stessa malattia appartenenti ad altre famiglie. Mediante
approccio più semplice rispetto al sequenziamento dell’in- studi funzionali viene tentata a questo punto la validatero genoma, in quanto le regioni codificanti rappresentano zione patogenetica delle mutazioni diagnosticate. Dal
l’1% del genoma umano4 e contengono circa l’85% delle lato pratico è da considerare che in alcuni casi può essere
mutazioni patologiche note.
difficile giungere a conclusioni dopo aver effettuato un
solo WES, per cui possono venire utilizzati in modo
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Tabella 2.
Revisione degli studi di WES effettuati in pazienti con DSA e geni nei quali sono state identificate mutazioni
Autori
(voce bibliografica)
Numero
pazienti studiati
Geni candidati
O’Roak et al., 2011 (5)
20
FOXP1, GRIN2B, SCN1A, LAMC3, CNTNAP2
Sanders et al., 2012 (6)
238
SCN2A, CHD8 e NTNG1
Neale et al., 2012 (8)
175
CHD8, KATNL2
Iossifov et al., 2012 (9)
343
CTTNBP2, AUTS1, RIMS1, DYRK1A, ZFYVE26, DST, ANK2, FMRP-associated genes
Bi et al., 2012 (10)
20
ANK3
Charour et al., 2012 (11)
16
UBE3B, CTCK1, NCKAP5L, ZNF18
integrato i metodi classici di mappatura (la mappatura
per omozigosità e l’analisi di linkage).
WES, autismo e primi studi
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I
l WES viene applicato per la prima volta allo
studio delle cause genetiche dell’autismo nel 2011, dal
gruppo di O’Roak et al 5, seguito da numerosi altri studi6‑11
(vedi Tabella 2). O’Roak et al 5 hanno utilizzato la tecnica di WES al fine di identificare e verificare mutazioni
de novo (ovvero insorte nelle linee germinali parentali o
nell’embrione) che conferiscano un aumentato rischio
di sviluppare un ASD. Sono state individuate varianti
de novo all’interno di porzioni del genoma codificanti
per quattro diversi geni (FOXP1, GRIN2B, SCN1A e
LAMC3): tali geni sono coinvolti nello sviluppo di ritardo mentale isolato e ritardo mentale con presenza di
tratti autistici ed epilessia, dato che supporta l’ipotesi
dell’esistenza di un’architettura genetica comune tra le
diverse patologie del neurosviluppo.
Sanders et al 6 hanno mostrato un’aumentata incidenza
del tasso delle SNV de novo negli individui con autismo
rispetto ai loro fratelli non affetti e mutazioni de novo
in geni che svolgono il loro ruolo a livello cerebrale. In
particolare, il gene SCN2A già descritto in passato come eziologicamente correlato ad alcune forme di epilessia è risultato essere un gene di suscettibilità anche per
gli ASD, così come altri due geni candidati (CHD8 e
NTNG1). O’Roak et al 7 hanno inoltre evidenziato che
le mutazioni de novo in geni candidati per gli ASD originano nella maggior parte dei casi dalla linea germinale
paterna e risultano correlate positivamente all’età paterna.
Neale et al 8, sempre attraverso la tecnica del WES, hanno
rilevato che il tasso di mutazione nelle famiglie con ASD
è lievemente più alto rispetto a quello previsto. Tuttavia,
data la penetranza incompleta, una mutazione da sola
può costituire un fattore di rischio ma può non essere
sufficiente a causare la patologia. Anche Iossifov et al 9
hanno effettuato il sequenziamento esomico, proponendosi di comprendere meglio se le diverse mutazioni de
novo abbiano incidenza diversa negli affetti rispetto ai non
affetti. Il sequenziamento esomico ha infine permesso loro
di affermare, relativamente ai risultati, che le mutazioni
de novo missense (codificanti per differenti aminoacidi)
non sembrano apparire in maggior numero negli affetti
rispetto ai non affetti, e quindi non sembrano contribuire in maniera significativa allo sviluppo di autismo.
Le mutazioni gene-disrupting (mutazioni di stop o che
determinino perdita o acquisto di funzione o interessino
un sito di splicing), invece, appaiono essere due volte più
frequenti negli affetti rispetto ai non affetti.
Lo studio di Bi et al 10 ha identificato una nuova mutazione de novo missense in ANK3, gene codificante per
una proteina appartenente alla famiglia delle anchirine e
quindi mediatrice dell’interazione tra proteine integrali
di membrana e citoscheletro. ANK3 è maggiormente
presente a livello del sistema nervoso centrale ed è stato
L’esistenza di una predisposizione genetica ai Disturbi dello Spettro
Autistico è stata ormai dimostrata, così come la presenza
di una ricca eterogeneità dal punto di vista dell’eziologia genetica.
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Attraverso l’adozione del WES
sono stati identificati
alcuni geni eziologicamente
correlati con l’autismo
e in futuro questa tecnica
potrà contribuire
alla caratterizzazione
delle complesse basi genetiche
degli ASD.
Bibliografia
Conclusioni
I
n conclusione, gli studi finora effettuati hanno identificato probabilmente solo alcuni dei geni implicati negli ASD (FOXP1, GRIN2B, SCN1A, LAMC3,
CNTNAP2, SCN2A, NTNG1, CHD8, KATNL2,
ANK3, UBE3B, CTCK1, NCKAP5L, ZNF18,
DYRK1A, TBR1, PTEN, TBL1XR1). La disponibilità
di database più esaustivi e completi rispetto a quelli disponibili oggi renderà questo approccio più rapido e più idoneo ad identificare geni-malattia. L’identificazione delle
vie patogenetiche alle quali appartengono i geni implicati
potrà avere implicazioni diagnostiche e terapeutiche
.
Gli autori dichiarano
di non avere nessun
conflitto di interesse.
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inoltre associato ad altri disturbi come il disturbo bipolare
e la schizofrenia11. Gli autori propongono un suo ruolo
nel determinare un’aumentata suscettibilità nei confronti
dell’autismo. Charour et al 12 utilizzano il WES al fine di
individuare la presenza di mutazioni recessive in omozigosi candidate a svolgere un ruolo nel determinare lo
sviluppo dell’autismo. Essi individuano la presenza di
mutazioni recessive in omozigosi coinvolgenti quattro geni candidati (UBE3B, CTCK1, NCKAP5L e ZNF18).
Molto recentemente O’Roak et al 13 hanno considerato
che il WES ha consentito l’identificazione di numerose
mutazioni geniche de novo, ma in realtà sono pochi i geni
ricorrenti mutati nei pazienti con ASD. Dallo studio è
emerso che mutazioni ricorrenti in 6 geni (CHD8, DYRK1A, GRIN2B, TBR1, PTEN, e TBL1XR1) possono
essere eziologicamente correlate con l’1% circa degli ASD
di tipo sporadico.
1. Fombonne E. Epidemiology of pervasive developmental
disorders. Pediatr Res 2009;65:591-8.
2. Geschwind DH. Genetics of autism spectrum disorders.
Trends Cogn Sci 2011;15:409-16.
3. Hallmayer J, Cleveland S, Torres A et al. Genetic
heritability and shared environmental factors among twin
pairs with autism. Arch Gen Psychiatry 2011;68:1095-102.
4. Ng SB, Buckingham KJ, Lee C et al. Exome sequencing
identifies the cause of a mendelian disorder. Nat Genet
2010;42:30-5.
5. O’Roak BJ, Deriziotis P, Lee C et al. Exome sequencing
in sporadic autism spectrum disorders identifies severe de
novo mutations. Nat Genet 2011;43:585-9.
6. Sanders SJ, Murtha MT, Gupta AR et al. De novo
mutations revealed by whole-exome sequencing are
strongly associated with autism. Nature 2012;485:237-41.
7. O’Roak BJ, Vives L, Girirajan S et al. Sporadic autism
exomes reveal a highly interconnected protein network of
de novo mutations. Nature 2012;85:246-50.
8. Neale BM, Kou Y, Liu L et al. Patterns and rates of exonic
de novo mutations in autism spectrum disorders. Nature
2012;485:242-5.
9. Iossifov I, Ronemus M, Levy D et al. De novo gene
disruptions in children on the autistic spectrum. Neuron
2012;74:285-99.
10. Bi C, Wu J, Jiang T et al. Mutations of ANK3 identified
by exome sequencing are associated with autism
susceptibility. Hum Mutat 2012;33:1635-8.
11. Chahrour MH, Yu TW, Lim ET et al. Whole-exome
sequencing and homozygosity analysis implicate
depolarization-regulated neuronal genes in autism. PLoS
Genet 2012;8:e1002635.
12. O’Dushlaine C, Kenny E, Heron E et al. Molecular
pathways involved in neuronal cell adhesion and
membrane scaffolding contribute to schizophrenia
and bipolar disorder susceptibility. Mol Psychiatry
2011;16:286-92.
13. O’Roack BJ, Vives L, Fu W et al. Multiplex Targeted
Sequencing Identifies Recurrently Mutated Genes in
Autism Spectrum Disorders. Science 2012;338:1619-22.