Linee guida per la diagnosi molecolare

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LINEE GUIDA PER LA DIAGNOSI MOLECOLARE DELL’ATROFIA MUSCOLARE
SPINALE (SMA)
Annalisa Botta (Università di Roma Tor Vergata)
Marta Bertoli (Università di Roma Tor Vergata)
Laura Vallo (Università di Roma Tor Vergata)
Giuseppe Novelli (Università di Roma Tor Vergata)
Christina Brahe (Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma)
Francesco Danilo Tiziano (Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma)
Enrico Bertini (Ospedale Bambino Gesù Roma)
Franco Taroni (Fondazione IRCCS Istituto Neurologico “Carlo Besta”, Milano)
Cinzia Gellera (Fondazione IRCCS Istituto Neurologico “Carlo Besta”, Milano)
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Indice
- Definizione e classificazione
- Clinica
- Diagnosi differenziale
- Genetica molecolare
- Test genetico per SMA: strategia generale
- Indicazioni al test genetico per SMA
Conferma della diagnosi clinica
Considerazioni generali
Protocolli molecolari
Identificazione dei soggetti eterozigoti per la delezione di SMN1
Considerazioni generali
Protocolli molecolari
Diagnosi prenatale
Considerazioni generali
Protocolli molecolari
- Elenco siti internet consultabili
- Elenco centri di riferimento per la diagnosi molecolare della SMA
- Bibliografia
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Definizione e classificazione
L'Atrofia Muscolare Spinale (SMA) è una della più comuni malattie autosomiche recessive. È
caratterizzata da debolezza muscolare progressiva prossimale e simmetrica, causata dalla
degenerazione del secondo motoneurone nel corno anteriore del midollo spinale. Non si osservano
segni di coinvolgimento del sistema sensitivo e del tratto piramidale (primo motoneurone). La sua
incidenza è di circa 1/10000 nati vivi [Thieme A. et al. 1993; Pearn J 1978; Pearn JH 1973; Czeizel
A. 1991; Burd L. et al. 1991]; la frequenza dei portatori è di 1/40-1/60 nella popolazione generale
[Pearn et al. 1980; Melki et al. 1994].
La classificazione clinica, è basata sull’età d’insorgenza, la gravità della forma stabilita sulla
migliore acquisizione motoria raggiunta e l’età dell’exitus (Tabella 1) [Munsat TL and Davies KE.
International SMA consortium meeting Neuromuscul Disord. 1992]. Tale classificazione risulta
utile per un corretto inquadramento diagnostico, per la prognosi e il follow-up della malattia.
Vengono distinte tre diverse forme:
La SMA di tipo I (OMIM #253300, forma infantile acuta o malattia di Werdnig-Hoffmann)
rappresenta la principale causa di morte per malattie genetiche nei primi due anni di vita. La
malattia esordisce entro i primi 6 mesi di vita, ma sono descritti numerosi casi in cui la madre o il
medico che esegue l’ecografia riferiscono una riduzione dei movimenti fetali. Il bambino si presenta
ipotonico, con postura “a rana”, con tendenza a giacere con braccia e gambe addotte, incapace di
cambiare posizione o di sostenere il capo. Un segno tipico della malattia è la respirazione
diaframmatica, resa evidente dalla distensione dell’addome durante l’inspirazione. Il pianto è flebile
e la suzione è debole. L’elettromiografia (EMG) evidenzia i segni di una grave denervazione con
potenziali di fibrillazione ad alta intensità e bassa frequenza, mentre la biopsia muscolare,
considerata attualmente obsoleta dopo la possibilita’ di una diagnosi molecolare, rivela la presenza
di piccoli gruppi di fibre ipertrofiche associati ad estesi raggruppamenti di piccole fibre atrofiche
scarsamente differenziate.
La SMA di tipo II (OMIM #253550, forma infantile cronica o SMA di tipo intermedio), esordisce
solitamente intorno tra i 6 e i 18 mesi di vita. Il paziente acquista la capacità di reggere il capo e di
sedersi, ma non riesce mai ad alzarsi o a reggersi in piedi in maniera autonoma. Analogamente a
quanto avviene nella forma di tipo I, la debolezza muscolare è simmetrica e riguarda soprattutto gli
arti inferiori. Il paziente può presentare fascicolazioni della lingua, e in alcuni casi, anche tremore
delle mani. Conseguentemente al danno muscolare si osserva in questi pazienti, come in quelli con
SMA III, un aumento moderato dei livelli della creatinchinasi nel siero. Dopo l’iniziale sviluppo
dell’atrofia, il deterioramento delle condizioni del malato può risultare lento o episodico. Le misure
da adottare fanno dunque riferimento alla prevenzione delle infezioni respiratorie (dalle quali
3
dipende la prognosi), e della scoliosi che sopravviene nella quasi totalita’ dei pazienti e può
diventare fortemente invalidante se non è trattata precocemente [Dubowitz V, 1995].
La SMA di tipo III (OMIM #253400, forma giovanile o malattia di Kugelberg-Welander ),
esordisce dopo il diciottesimo mese di vita, quando diventa evidente una debolezza dei muscoli
della coscia e dell’anca. L’andatura anserina e i piedi piatti, atteggiati in valgismo, sono
caratteristici rispetto alla postura dei malati distrofici. Due segni tipici completano il quadro clinico,
la marcata lordosi lombare posturale per l’atrofia dei muscoli del cingolo pelvico, e la manovra di
Gower alla quale il bambino ricorre per sollevarsi da terra. La prognosi è buona poiché nella
maggior parte dei casi la capacità di camminare viene mantenuta per molti anni, e a volte si assiste
ad un parziale recupero funzionale per reinnervazione compensatoria. La fisioterapia, come il
contenimento del peso con una dieta opportuna, migliorano sensibilmente la qualità della vita e
ritardano il declino funzionale [Dubowitz V, 1995].
Esiste inoltre una rara forma ad esordio in età adulta (SMA IV; OMIM #), geneticamente
eterogenea, che può presentare lo stesso difetto genetico responsabile delle SMA I, II e III [Brahe et
al., 1995].
4
OMIM
SMA di
Età di
Tappe dello
Aspettativa di
insorgenza
sviluppo motorio
vita
Posizione seduta
Morte entro i
autonoma: no
due anni di vita articolazioni
#253300 0-6 mesi
tipo 1
Altro
Lievi contratture delle
in più del 95%
Debolezza dei muscoli
Stazione eretta e/o
dei casi
facciali minima o
deambulazione
(età media alla
assente
autonoma: no
morte=8 mesi)
Difficoltà di suzione e
deglutizione variabili
SMA di
tipo 2
#253550 Entro i 18
mesi
Posizione seduta
Morte dopo i
autonoma: si
due anni di vita delle dita
(età media di
SMA di
tipo 3
Tremore intenzionale
(75% di
Scoliosi e contratture
nei pazienti in sedia a
esordio: 8
Stazione eretta e/o
probabilità di
mesi)
deambulazione
sopravvivenza a rotelle
autonoma: no
20 anni)
Stazione eretta e/o
Normale
#253400 Dopo i 18
mesi
deambulazione
autonoma: si
Tabella 1: Classificazione dell'atrofia muscolare spinale [Munsat TL and Davies KE. International
SMA consortium meeting Neuromuscul Disord. 1992]
5
Clinica
Il sintomo principale delle SMA è la debolezza muscolare simmetrica del tronco e degli arti, più
evidente negli arti inferiori e nella muscolatura prossimale, associata a ipo-areflessia. Il
coinvolgimento della muscolatura estrinseca degli occhi, della muscolatura del viso, del diaframma
e del miocardio possono essere considerati criteri di esclusione [Munsat et al. 1992]. Nella SMA di
tipo I l'atrofia spesso non è evidente, perchè compensata da grasso sottocutaneo. Un criterio di
inclusione è la presenza di fascicolazioni e tremore: le fascicolazioni della lingua non sono di
frequente osservazione nella SMA di tipo I, ma si riscontrano nel 70% dei pazienti con SMA di tipo
II. Nella SMA di tipo III sono presenti fascicolazioni della muscolatura degli arti in circa la metà
dei casi. Nelle forme di tipo II e III si osserva frequentemente tremore delle mani. Nella SMA I si
possono occasionalmente riscontrare delle importanti limitazioni nei movimenti, in particolare per
quanto riguarda l'adduzione dell'anca o l'estensione del ginocchio o del gomito. Alterazioni del
sistema nervoso centrale non sono mai presenti, così come alterazioni della sensibilità o
coinvolgimento oculare o uditivo. Le analisi biochimiche mostrano un'attività della creatinchinasi
(CK) nella norma nella SMA I e II o solo leggermente aumentata nella SMA III: livelli di CK >5
volte più grandi del limite superiore della norma orientano la diagnosi verso una malattia primaria
del muscolo (miopatia). In presenza di valori di CK elevati, oppure in assenza di una indagine
molecolare che conferma una mutazione nel gene SMN, e’ consigliabile eseguire una biopsia
muscolare, ed eventualmente un dosaggio dell'esoaminidasi per escludere la possibilità di trovarsi
di fronte a un quadro diverso dall'atrofia muscolare spinale.
L'elettromiografia (EMG) mostra denervazione recente e denervazione-reinnervazione ed un ridotto
reclutamento dei potenziali d'azione motori. Il tracciato mostra attività spontanea di denervazione,
che e’ un elemento suggestivo nella SMA I. Queste caratteristiche sono comuni nella SMA I, meno
frequenti nella SMA II e non si osservano nella SMA III [Buchthal & Olsen 1970 , HausmanowaPetrusewicz and Karwanska, 1986]. In tutti i pazienti si osservano onde polifasiche, onde positive di
grande ampiezza, fibrillazioni e ampiezza e durata dei potenziali di azione motori aumentati. Le
velocità di conduzione nervosa sensitive e motorie sono normali. Nelle forme più gravi di SMA I,
tuttavia, si può osservare una riduzione delle velocità sensitive e motoria causata dalla perdita di
fibre nervose di grandi dimensioni.
La biopsia mostra gruppi di fibre atrofiche di entrambi i tipi (1, 2a e 2b) e fibre ipertrofiche di tipo
1. Se l’analisi molecolare del gene SMN non conferma la mutazione responsabile, allora e’
importante richiedere una seconda biopsia muscolare per tentare di ottenere una diagnosi
alternativa. Diagnosi differenziale
6
L'atrofia muscolare spinale di tipo I (SMA I) quando si manifesta alla nascita si presenta con il
quadro clinico del floppy infant. Questa condizione può essere determinata da molte altre patologie,
che vanno considerate nella diagnosi differenziale. L'ipotonia, nel neonato come nell'adulto, può
essere di origine centrale, periferica o muscolare. Nell'ipotonia centrale i riflessi osteotendinei sono
conservati o accentuati e il segno di Babinski può essere positivo. La causa più frequente è un
danno ipossico perinatale, ma se l'ipotonia si associa a facies caratteristica o malformazioni a carico
di organi interni, è verosimile che possa trattarsi di una condizione sindromica o di una malattia
metabolica.
L'ipotonia periferica, dovuta ad alterazioni del motoneurone, è in genere un sintomo isolato ed i
riflessi osteotendinei sono assenti; fascicolazioni della lingua e fini tremori alle mani sono
caratteristici della SMA, ma non sempre di facile osservazione. L'atrofia muscolare spino-bulbare
X-legata, SBMA o malattia di Kennedy, è dovuta a degenerazione del secondo motoneurone, come
la SMA, ma si manifesta più tardivamente, in soggetti maschi, e spesso in associazione ad altri
sintomi causati da insensibilità agli androgeni (ginecomastia, atrofia testicolare e infertilità) [La
Spada et al, 1991]. La sclerosi laterale amiotrofica (ALS o SLA) si differenzia dalla SMA per il
coinvolgimento sia del primo sia del secondo motoneurone, presentando quindi, oltre all'ipotonia e
all'iporeflessia, anche sintomi di origine piramidale come l’ipertonia, l’iperreflessia e la spasticità
[Rowland et al, 2001].
L'atrofia muscolare spinale distale è una malattia geneticamente eterogenea, si differenzia dalla
SMA prossimale per l'interessamento di distretti muscolari diversi: si manifesta inizialmente con
atrofia della muscolatura distale, e solo successivamente possono essere interessati altri distretti
[Passamonti L. et al. 2004]. Le ipotonie da malattia primitiva del muscolo, come la distrofia
muscolare di Duchenne, inizialmente si manifestano con un ritardo dello sviuppo motorio, in
seguito si rendono evidenti per difficoltà nella deambulazione (andatura anserina o steppante), nel
salire e scendere le scale o nel rialzarsi da terra. I riflessi osteontedinei sono ridotti o assenti, come
nella SMA, ma i livelli di CK sono marcatamente aumentati e generalmente è presente una
debolezza della muscolatura facciale che non si osserva nell'atrofia muscolare spinale cronica.
Anche nelle forme a insorgenza giovanile o adulta la diagnosi differenziale con la SMA (di tipo II o
III) è possibile sulla base dei livelli di CK, dei dati della biopsia muscolare e di quelli
dell'elettromiografia che non mostra il quadro tipico da denervazione osservato nella SMA.
7
Debolezza muscolare
Caratteristiche associate
Creatinchinasi (CK)
(dosaggi da
considerare
solo se CK ha
valori elevati)
Distrofina ed
altre proteine
muscolari
Esosaminidasi
Elettromiografia
Criterio di inclusione
Tronco e arti (più evidente agli
arti prossimali e agli arti
inferiori)
Criterio di esclusione
Debolezza dei muscoli
estrinseci dell’occhio, del
diaframma, del miocardio
Simmetrica
Marcata debolezza dei muscoli
del viso
Alterazioni della sensibilità*
Fascicolazioni
● della lingua in 70%
delle SMAII
● degli arti 50% delle
SMAIII
Tremore delle mani (SMA II e
III)
Nella norma o leggermente
aumentata
Nella norma
Nella norma
Attività spontanea anormale
Alterazioni del sistema
nervoso centrale
Artrogriposi
Coinvolgimento di altri organi
di senso
CK aumentata >5 volte rispetto
ai valori normali superiori
Inferiore alla norma
Inferiore alla norma
Riduzione della velocità di
conduzione nervosa <70%
rispetto alla norma*
Potenziali sensitivi anomali
Biopsia muscolare
Gruppi di fibre atrofiche di
entrambe i tipi
Fibre ipertrofiche, in genere di
tipo I

Non si osservano clinicamente deficit delle sensibilità. Tuttavia, una riduzione delle velocità di
conduzione motoria e sensitiva può essere osservata in forme gravi di SMA I come effetto
dell’importante deplezione delle fibre di grande diametro [Rudnik-Schoneborn et al. Neurology 60: 983987, 2003].
Tabella 2: Criteri diagnostici per l'atrofia muscolare spinale.
8
Genetica molecolare
Nel 1990, il locus per tutte le forme di SMA è stato mappato sul cromosoma 5q13, in una regione
caratterizzata da una elevata instabilità genomica con sequenze ripetute, pseudogeni, delezioni e
duplicazioni invertite [Bussaglia E. et al 1995; Parsons DW et al 1996]. Il gene responsabile della
SMA, SMN (Survival Motor Neuron) è presente infatti in due copie altamente omologhe: una
telomerica, SMN1, e una centromerica, SMN2 [Lefebvre et al., 1995]. E' stato ormai
definitivamente chiarito che la patogenesi della malattia è riconducibile alla perdita in omozigosi
della copia telomerica del gene SMN (SMN1, OMIM #601627), deleto in maniera specifica nel
95% dei soggetti con SMA a prescindere dal fenotipo clinico. Inoltre, in soggetti affetti e non deleti
in omozigosi, sono state identificate diverse mutazioni puntiformi nel gene SMN1, a conferma del
suo ruolo di gene malattia [Hahnen E. et al 1997; Lefebvre S. et al. 1995, ; Brahe C. et al 1996;].
SMN2 differisce da SMN1 solo per otto nucleotidi, cinque intronici e tre localizzati sugli esoni 7 ed
8 [Burglen L. et al 1996; Lefebvre S. et al 1995]. La differenza critica tra i due geni SMN è il
cambiamento di base CT in una sequenza exonic splicing enhancer (ESE) che regola l’inclusione
dell’esone 7 nei trascritti : la maggior parte dei trascritti di SMN1 contiene infatti i 9 esoni del gene,
mentre SMN2 produce per l’80% circa diverse isoforme non funzionali mancanti degli esoni 5 o 7
[Gennarelli M. et al 1995; Feldkotter M. et al 2002] (Fig. 1). La proteina SMN è un polipeptide di
38 kDa espresso in maniera ubiquitaria, in particolare ad elevati livelli nei motoneuroni spinali
[Lefebvre et al. 1997; Coovert et al. 1997]. Studi di immuno-citochimica hanno dimostrato che
SMN è uno dei costituenti delle “gems”, una nuova classe di organelli sub-nucleari coinvolti nel
metabolismo degli RNA messaggeri [Liu and Dreyfuss, 1996].
La delezione in omozigosi del gene SMN2, in presenza di almeno una copia di SMN1, non
determina il fenotipo dell'atrofia muscolare spinale ed è presente infatti in circa il 5-10% della
popolazione generale. E’ stato tuttavia dimostrato che i pazienti SMA presentano un numero
variabile di copie di geni SMN2 (nella maggioranza dei casi 2-4 copie) e che esiste una correlazione
inversa, sebbene non assoluta, tra il numero di copie e la gravità fenotipica [Feldkotter et al., 2002].
Il numero di copie di SMN2 non influenza però la variabilità clinica in coppie di fratelli con
fenotipo discordante, supportando l'ipotesi della presenza di altri geni che modificano il fenotipo
dell'atrofia muscolare spinale [Helmken C. et al, 2003].
.
Il gene NAIP (Proteina Inibitrice dell’Apoptosi Neuronale) è presente in più copie nella regione
SMA, ma una sola di esse è funzionale : le altre sono pseudogeni, presenti in un numero di copie
che varia da individuo a individuo. NAIP è assente in circa la metà dei pazienti SMA, ma la
frequenza di delezione è significativamente più elevata nei soggetti affetti dalla forma acuta della
9
malattia [Roy et al, 1995]. Il prodotto proteico di NAIP presenta omologia con la proteina di
baculovirus che inibisce l'apoptosi neuronale. Inoltre, diversi esperimenti hanno confermato che
NAIP sopprime l’apoptosi nelle cellule dei mammiferi [Liston et al., 1996].
Dalla regione SMA, è stato successivamente isolato un terzo gene duplicato, p44, [Carter et al.,
1997]. P44 codifica per una subunità del fattore di trascrizione TFIIH e la sua copia telomerica è
deleta in circa il 15% dei pazienti SMA. Il ruolo di questo gene nella patogenesi delle SMA è
ancora controverso, e saranno necessari ulteriori studi per chiarire la sua influenza sulle
manifestazioni cliniche della malattia.
1
0
SMN2
8
7
6
5
4
3
SMN1
2b
2a
1
1
2a
2b
3
4
5
6
7
mRNA SMN1
mRNA SMN2
ex 7
 20% proteina SMN completa
 80% proteina SMN incompleta e
> 90% proteina SMN completa
non funzionante
Figura 1: Struttura genomica ed mRNAs trascritti dai geni SMN1 ed SMN2. L’esone 8 (in grigio)
non contiene sequenze codificanti.
1
1
8
Test genetico per SMA: strategia generale
1) Appropriata selezione su base clinica dei pazienti per l’analisi molecolare.
2) Conferma della diagnosi clinica attraverso la rilevazione della delezione in omozigosi degli
esoni 7 ed eventualmente 8 del gene SMN1 (screening di I livello).
3) Nei casi in cui non è presente la delezione in omozigosi del gene SMN1 vengono richieste
ulteriori indagini cliniche, compresa biopsia muscolare, a conferma del sospetto di SMA
secondo i criteri riportati in Tabella 2.
4) Se il sospetto clinico di SMA persiste si passa ad uno screening di II livello che consiste
dapprima nell’analisi della delezione in eterozigosi del gene SMN1 attraverso saggi
semiquantitativi. Se un paziente presenta una sola copia del gene SMN1, c’è una probabilità
del 95% che sia un eterozigote composto delezione/mutazione per il gene SMN1.
5) Ricerca di mutazioni nel gene SMN1. In presenza di un fenotipo caratteristico, se ci si trova
di fronte ad una variante non descritta in letteratura, una volta esclusa la possibilità di un
polimorfismo (testando 200 cromosomi di controllo) si può ragionevolmente ritenere che si
tratti di una mutazione patogenetica.
6) Test di identificazione dei portatori sani della delezione del gene SMN1 da effettuare
mediante dosaggio semiquantitativo oppure analisi di linkage nei consanguinei del probando
con delezione in omozigosi del gene SMN1.
7) Test di identificazione dei portatori sani della delezione del gene SMN1 nei partners di
soggetti eterozigoti certi o tali dopo dosaggio semiquantitativo; Valutazione del rischio
riproduttivo per SMA.
8) Diagnosi prenatale attraverso l’analisi della delezione e/o mutazione del gene SMN1 (test
diretto) in combinazione con analisi di linkage utilizzando marcatori microsatelliti della
regione cromosomica 5q13. L’esclusione di contaminazioni di cellule materne nei tessuti
fetali che si analizzano (villi coriali o amniociti) è obbligatoria.
1
2
Probando con sospetto
clinico di SMA
Test molecolare per delezione esone 7 gene SMN1
No delezione gene SMN1
Delezione gene SMN1
Rivalutazione del quadro clinico
Conferma diagnosi clinica
Dosaggio semiquantitativo del
gene SMN1
2 copie SMN1
Diagnosi
differenziale
1 copia SMN1
Ricerca mutazioni nella
copia non deleta del gene
SMN1
Test del portatore sui consanguinei del
probando mediante dosaggio
semiquantitativo o analisi di linkage
Test del portatore sui partners di
eterozigoti certi e valutazione del
rischio riproduttivo
DIAGNOSI PRENATALE
Analisi indiretta di
segregazione con marcatori
della regione 5q13
Test diretto per la
delezione /mutazione del
gene SMN1
Figura 2: Schema riassuntivo del protocollo molecolare per la diagnosi genetica della SMA.
1
3
Indicazioni al test genetico per SMA
La principali indicazioni al test genetico per SMA sono:

conferma della diagnosi clinica

test del portatore

diagnosi prenatale
Conferma della diagnosi clinica
Considerazioni generali
La diagnosi di SMA si basa sull'evidenza clinica, dei test di laboratorio e strumentali, e sulla
conferma diagnostica molecolare. Il test molecolare per confermare dal punto di vista genetico una
diagnosi clinica di SMA si basa sulla rilevazione dell’assenza in omozigosi del gene SMN1,
osservata nel 95% circa dei pazienti .La perdita del gene SMN1 avviene nella maggior parte dei casi
per delezione (generalmente eventi che coinvolgono l’intero gene) oppure per fenomeni di
conversione genica SMN1-SMN2. I protocolli molecolari descritti in letteratura e riportati di
seguito si basano sull’analisi delle sostituzioni nucleotidiche negli esoni 7 ed 8, che consentono di
distinguere il gene SMN1 dal gene SMN2. Si tratta di metodiche che appartengono alla routine del
laboratorio di biologia molecolare e vengono considerate come screening di primo livello. La
presenza della delezione in omozigosi dell’esone 7 del gene SMN1 in un soggetto con sintomi
clinici ha infatti una specificità diagnostica superiore al 99%. L’assenza di tale delezione allo stato
omozigote tuttavia non esclude una diagnosi di SMA poiché circa il 2-5% dei pazienti sono
eterozigoti composti per la delezione/mutazione del gene SMN1 (solo in rarissimi casi è stata
descritta una mutazione allo stato omozigote). Se non si rileva la delezione in omozigosi del gene
SMN1, è necessario richiedere un approfondimento clinico a supporto del sospetto di SMA prima di
procedere ad uno screening più laborioso di secondo livello, che deve essere eseguito in laboratori
specializzati. Questo consiste dapprima nella determinazione del numero di copie del gene SMN1
attraverso saggi semiquantitivi. La presenza della delezione in eterozigosi del gene SMN1 in
soggetti sintomatici, supporta fortemente la diagnosi clinica di SMA. Va considerato inoltre che,
virtualmente, tutti i pazienti con SMA associata al locus 5q13 sono portatori della delezione in
forma omozigote (94%) o eterozigote. In ogni caso la conferma del sospetto clinico si ha solo dopo
aver identificato anche la mutazione puntiforme nell’allele non deleto del gene SMN1. Occorre
sottolineare che lo screening di mutazioni del gene SMN1 è un’indagine complessa che deve tenere
conto della presenza di un numero variabile di copie del gene SMN2, le cui sequenze possono
mascherare eventuali varianti patologiche. Ad oggi sono state descritte più di 20 mutazioni del gene
SMN1 che, in associazione con la delezione del gene in eterozigosi, determinano il fenotipo SMA
Ogino S, Wilson RB, 2004; Sun Y et al 2005]. Le più frequenti mutazioni intrageniche descritte
1
4
sono
la
mutazione
missenso
Y272C
(815A>G)
e
le
mutazioni
frameshift
768_778dupTGCTGATGCTT e 399_402delAGAG [Ogino S, Wilson RB, 2004; Wirth B, 2000].
Il sottotipo clinico della SMA sembra essere in parte determinato dalla natura della mutazione del
gene SMN1. In generale la SMA I è associata con la delezione in entrambi gli alleli, la SMAII con
la delezione di SMN1 su un allele e la conversione genica di SMN1 in SMN2 sull’altro, mentre la
SMA III con una conversione genica SMN1->SMN2 in tutti e due gli alleli oppure
dall’associazione delezione/mutazione. La rilevazione dell’assenza in omozigosi dell’esone 7
assieme alla presenza dell’esone 8 del gene SMN1 è indicativa di una conversione genica
SMN1/SMN2, osservato in circa l’ 8% dei soggetti con SMA. In ogni caso la mancanza dell’esone
7 del gene SMN1 è sufficiente per causare una ridotta espressione della proteina SMN e la
conseguente insorgenza del fenotipo clinico. Almeno uno dei fattori che spiegano il fenotipo
variabile della SMA è il numero di copie del gene SMN2 [Vitali et al., 1999; Wirth B. et al, 2006;
Harada Y et al 2002; Cusco I et al 2006; Monani UR et al 2002] . Soggetti con SMA III hanno in
media, un numero di copie di SMN2 superiore rispetto agli individui con SMA I e II, e questo è
correlato con una espressione maggiore di trascritto “full length” del gene SMN. Tuttavia,
l’osservazione di fenotipi discordanti in fratelli aploidentici al locus SMA, non permette tuttavia di
attribuire a questo parametro genetico un chiaro ed inequivocabile valore prognostico. Geni
modificatori aggiuntivi a SMN2 potrebbero avere un ruolo determinante nell’evoluzione del
decorso clinico della SMA, non è quindi consigliabile fornire questo tipo di informazione alla
famiglia del probando.
Protocolli molecolari
Analisi della delezione in omozigosi del gene SMN1
La delezione in omozigosi degli esoni 7 ed 8 del gene SMN1 può essere rilevata attraverso i
seguenti metodi:
1) Analisi PCR/RFLP. Per distinguere l'esone 7 dei geni SMN1/SMN2 possono essere usati
indifferentemente gli enzimi DraI o HinfI dopo amplificazione con primer specifici [van der
Steege et al., 1995; Xu R et ql 2003; Ogino S, Wilson RB.2004], per l'esone 8 viene
utilizzato l'enzima DdeI. L'enzima di restrizione DraI digerisce solo l'esone 7 del gene
SMN2, poichè nella reazione di PCR viene utilizzato un primer reverse con un mismatch
che genera un sito di riconoscimento per questo enzima quando si lega alla copia
centromerica del gene SMN. Nel caso della digestione con enzima Hinf I, siti di restrizione
interni vengono generati per entrambi i prodotti di PCR relativi ai geni SMN1/SMN2 per
1
5
monitorare la completezza della reazione di digestione. Si tratta di un test semplice e
relativamente rapido con un'elevata specificità diagnostica.
2) SSCP su gel di poliacrilammide. L'analisi di SSCP ha il vantaggio di rilevare sia le
delezioni del gene SMN1 che eventuali mutazioni puntiformi a carico del'esone 7 del gene.
Un potenziale svantaggio è che il metodo non permette di distinguere i polimorfismi ed in
letteratura ne è stato descritto uno relativamente frequente (4% dei membri familiari
asintomatici) che risulta in un pattern di migrazione simile a quella della delezione in
omozigosi [Wang CH et al 1996]. Questo metodo è stato perciò quasi completamente
sostituito dal metodo PCR/RFLP.
3) DHPLC. L’analisi del prodotto di amplificazione dell’esone 7 del gene SMN attraverso
cromatografia liquida denaturante ad alta pressione permette di distinguere chiaramente tre
picchi di eluizione corrispondenti agli omoduplici dei geni SMN1, SMN2 ed agli
eteroduplici SMN1/SMN2. La comparazione del cromatogramma relativo al soggetto in
esame con opportuni soggetti di controllo con 1 o 0 copie del gene SMN1, permette di
rilevare la presenza di una delezione in omozigosi del gene SMN1 [Sutomo R. et al 2002;
Mazzei R. et al, 2003]. Come nella metodica precedente, il limite è costituito dalla presenza
di polimorfismi all’interno della regione amplificata che potrebbero risultare in un profilo di
eluizione ambiguo del campione da testare.
I metodi fin qui descritti non permettono di identificare in maniera chiara i fenomeni di conversione
genica, per i quali esistono test specifici [Hahnen et al 1996; Cusco I, et al 2001]. Il metodo
PCR/RFLP non discrimina tra un fenomeno di delezione ed uno di conversione genica, tuttavia
determina in maniera affidabile l'assenza dell'esone 7 ed 8 del gene SMN1 dalla loro posizione
genomica corretta. Il test per la delezione dell'esone 7 è di per sé sufficiente per determinare
l'assenza del gene SMN1, tuttavia è raccomandabile accompagnare questa analisi con un secondo
test indipendente che è quello relativo all'esone 8 a conferma del risultato ottenuto. L'analisi del
solo esone 8 può invece portare a risultati falsamente negativi poiché questo esone risulta non
deleto in circa l’ 8% dei soggetti con SMA associata a delezione dell'esone 7 [Ogino S, Wilson
RB.2004]. E' opportuno inserire nella reazione di restrizione un controllo positivo ed un controllo
con almeno una copia del gene SMN1 per monitorare l'avvenuta reazione enzimatica, che è critica
in questo protocollo molecolare. La reazione di PCR deve invece includere un campione in cui non
viene aggiunto templato come controllo negativo per escludere eventuali contaminazioni da DNA
esterno.
1
6
Screening di mutazioni del gene SMN1
Sono stati descritti diversi metodi per la caratterizzazione di mutazioni puntiformi del gene SMN1
[Ogino S, Wilson RB. 2002; Ogino S, Wilson RB. 2004] L’unico metodo che consente di
determinare in maniera inequivocabile se la mutazione individuata si trovi su SMN1 o su SMN2,
consiste nel sequenziamento
dei trascritti corrispondenti ai due geni in reazioni separate. Il
protocollo prevede l’estrazione di RNA, la sua restrotrascrizione in cDNA, la co-amplificazione dei
trascritti SMN1/SMN2 e la loro separazione attraverso clonaggio in batteri. Dopo aver selezionato i
cloni SMN1-specifici, viene amplificata la sequenza del cDNA e analizzata attraverso
sequenziamento diretto [Sun Y et al.,2005]. Questo metodo, sebbene laborioso, ha il vantaggio di
analizzare selettivamente la regione codificante del gene SMN1, evitando che sequenze del gene
SMN2 possano mascherare eventuali varianti nucletodiche. Nel caso di mutazioni non descritte in
letteratura, si può procedere ad analisi funzionali più approfondite come la valutazione del livello e
della localizzazione della proteina SMN. Questo complesso screening di II livello deve essere
eseguito in centri qualificati, con una documentata esperienza nel campo della diagnostica
molecolare della SMA. Si raccomanda di procedere a questa analisi solo dopo aver richiesto
ulteriore indagini cliniche (compresa la biopsia muscolare) sul probando ed aver accertato lo stato
di eterozigosi per il gene SMN1.
Identificazione dei soggetti eterozigoti per la delezione di SMN1
Considerazioni generali
Il test di identificazione degli eterozigoti viene utilizzato nelle seguenti situazioni:
1) In pazienti con sospetta SMA in assenza della delezione in omozigosi del gene SMN1. Se la
malattia è associata al locus 5q13 la delezione di SMN1 deve trovarsi infatti almeno nello
stato di eterozigosi (ad eccezione dei casi di dimostrata consanguineità dei genitori del
probando). L’individuazione di soggetti di questo tipo implica un’alta probabilità di trovare
una mutazione puntiforme nell’altro cromosoma.
2) In genitori di pazienti deceduti per sospetta SMA non confermata con analisi molecolare.
3) Parenti di primo o secondo grado di genitori di pazienti SMA.
4) Partners di portatori sani accertati
Una problematica relativa a questo test è l'esistenza di portatori con due copie di SMN1 sullo
stesso cromosoma e l’assenza di SMN1 sull'altro cromosoma 5 (cosiddetti 0,2 circa il 4% dei
portatori. [McAndrew PE et al, 1997, Feldkotter M et al 2002, Wirth et al., 1999]. Ciò comporta
una perdita di sensibilità del test dal momento che individui con un genotipo [1,1] per SMN1 (non-
1
7
portatori) non sono distinguibili da soggetti con genotipo [0,2] che hanno le due copie di SMN1
sullo stesso cromosoma (portatori).
Bisogna inoltre considerare la frequenza delle mutazioni intrageniche del gene SMN1 (circa 3-5%
degli alleli mutati) che sfuggono all’analisi quantitativa dell’esone 7 di SMN1 e riducono
ulteriormente la sensibilità della metodica che non può essere superiore al 93-94%.
Dal punto di vista sperimentale , la situazione è ulteriormente complicata dall’elevata omologia di
sequenza tra i geni SMN1-SMN2, che rende assai difficile l’amplificazione specifica mediante PCR
dell’uno o dell’altro gene. Inoltre, SMN2 è presente in un numero variabile di copie compreso tra 0
e 4 e quindi il numero il gene SMN1 non può essere dosato in maniera accurata relativamente alla
sua copia centromerica (ad esempio, se il rapporto SMN1/SMN2 è uguale a 1 potrebbe indicare un
genotipo 1T/1C ma anche 2T/2C). Quindi oltre che calcolare il rapporto SMN1/SMN2, è necessario
conoscere il numero totale di copie dei geni SMN rispetto a geni di controlli al di fuori del locus
SMA. L’analisi di segregazione di marcatori polimorfici al locus 5q13, permette la valutazione
dello stato di portatore sano di SMA se non è possibile effettuare il saggio semiquantitivo diretto.
Sono disponibili oggi numerosi marcatori molecolari intragenici ed extragenici che consentono con
correttezza di stabilire le fasi degli aplotipi a rischio con una probabilità superiore al 99% [Scheffer H et al
2001].
Protocolli molecolari
Sono stati descritti diversi metodi per l'identificazione molecolare di soggetti portatori sani di SMA,
basati su protocolli di PCR semiquantitativa in cui il gene SMN viene comparato ad uno o più geni
di controllo presenti in duplice copia nel genoma. Ne riportiamo di seguito solo alcuni:
PCR quantitativa. [McAndrew PE et al, 1997]. Il metodo si basa su PCR-RFLP competitiva dove
il gene CFTR (esone 4), presente in duplice copia nel genoma umano, rappresenta il gene di
riferimento. Per correggere le eventuali variazioni nell’efficienza di amplificazione, il saggio
prevede l’inclusione di standard interni sia del gene SMN che del gene CFTR. Ogni standard
interno presenta gli stessi siti di legame per i primers della corrispondente sequenza genomica e
inoltre porta al suo interno una piccola delezione che consente la separazione e la quantificazione
dei prodotti di PCR rispettivamente degli standards e del DNA genomico. Il numero di copie di
SMN1 è determinato dalla co-amplificazione di SMN1, di SMN2 e dello standard interno SMN, di
CFTR e del suo standard; la digestione enzimatica con DraI taglia selettivamente la copia SMN2.
Scheffer H. [2000] ha migliorato tale metodica apportando alcune modifiche : 1) sostituzione del
gene di riferimento CFTR con un gene RB (esone 13) contenente un sito di restrizione DraI
consentendo di monitorare la completa digestione enzimatica; 2) aggiunta di una terminazione
1
8
fluorescente ad un primer di ciascun amplicone, permettendo così l’utilizzo di un sequenziatore
automatico per la separazione dei frammenti e la loro quantificazione.
Tuttavia il metodi quantitativi sopra descritti mostrano una sovrapposizione dei risultati relativi a
soggetti con una e due copie di SMN1; è stato infatti dimostrato che nel 6% dei casi non è possibile
escludere lo stato di portatore [Wirth et al., 1999].
PCR competitiva con primer extension. Il saggio messo a punto da Gèrard B. [2000] permette di
determinare il rapporto fra i geni SMN (RT/C) tramite allungamento dei primers (minisequencing); la
quantità totale di SMN presente nel genoma viene stabilita utilizzando PBGD (porphobilinogen
deaminase) come gene di controllo. I controlli interni per SMN e PBGD portano una delezione o
inserzione e quindi la separazione dei prodotti di PCR avviene direttamente tramite sequenziatore
automatico senza l’utilizzo di enzimi di restrizione. Il limite di questo test è rappresentato dai
risultati border-line che possono indurre ad inesatte interpretazioni.
DHPLC. Di recente è stato descritto un metodo innovativo, rapido, sensibile e specifico per
l’individuazione di variazioni del DNA che si basa su DHPLC [Sun Y. et al., 2005]. Il test consente
il dosaggio di SMN1/SMN2 tramite la combinazione dell’analisi degli eteroduplex e di una PCR
multiplex.
Real-time PCR. Il test descritto da Feldkötter [2002] si basa su real-time PCR, è rapido e
affidabile, in grado di discriminare tra SMN1 e SMN2 e di quantificare il prodotto di PCR nel corso
della reazione attraverso l’uso del SYBR Green I. Per distinguere SMN1 da SMN2 vengono
utilizzati primers che terminano vicino o proprio a livello dei nucleotidi che differenziano SMN1 da
SMN2 (esone 7, posizione 6 e introne 7, posizione +214). Tuttavia un approccio quantitativo senza
l’uso di un controllo interno o esterno richiede l’utilizzo di uno stesso metodo di estrazione e
quantificazione del DNA, che è spesso un problema quando il DNA proviene da un laboratorio
diverso da quello che effettua il test. Anhuf [2003] ha cercato di risolvere, almeno in parte, alcuni di
questi problemi: per prima cosa si è passati all’uso di sonde MGB che hanno una più alta
temperatura di melting e sono quindi più sensibili al mismatch di una singola base. Il saggio
prevede l’amplificazione anche di un locus di riferimento con un numero noto di copie; tale gene
dovrebbe risolvere il problema di eventuali deviazioni dovute alla concentrazione del DNA e alla
diversa efficienza di amplificazione. I vantaggi sono numerosi e tra questi la capacità di analizzare
contemporaneamente un elevato numero di campioni.
Anche se oggi il test basato su QRT-PCR è quello più utilizzato, si raccomanda di validare la
sensibilità del dosaggio quantitativo prima di utilizzarlo di routine. E' critica la qualità e la purezza
1
9
del DNA estratto (si consigliano metodi come il salting out che preservano il DNA integro). Il
dosaggio dei campioni deve essere molto accurato e ciascuno di essi deve essere diluito in maniera
seriale per disciogliere eventuali impurità. Ogni reazione inoltre, deve essere ripetuta almeno in
triplicato per annullare eventuali errori dell’operatore. Tuttavia l’uso di probes fluorescenti e il loro
costo elevato rappresentano uno svantaggio insito nella metodica stessa.
Multiplex Ligation-Probe Dependent Amplification (MLPA) [Scarciolla O. et al., 2006].
L’analisi MLPA permette di stabilire in modo accurato il numero di copie di SMN1 e quindi di
individuare soggetti portatori-sani della malattia. Il metodo si basa sull’amplificazione
contemporanea di 37 differenti tratti genici di cui 16 interni alla regione critica SMA e 21 esterni
che mappano su altri autonomi. I prodotti di PCR sono fatti correre su ABI PRISM 310 e analizzati
usando il software Gene Mapper 3.5. L’area relativa di ciascun picco viene quindi rapportata ai
picchi corrispondenti ai geni di controllo e, contemporaneamente, i campioni da testare vengono
messi a confronto con dei campioni a genotipo noto attraverso il software Coffalyzer 2 (MRCHolland). Il metodo consente di estendere lo studio della delezione all’intera regione SMA.
L’analisi MLPA è caratterizzata da un’alta riproducibilità, semplicità di esecuzione e basso costo.
Tra gli svantaggi bisogna sottolineare l’incapacità del metodo nell’individuare mutazioni puntiformi
del gene SMN1 e l’impossibilità di evidenziare la presenza di due copie si SMN1 sullo stesso allele.
Linkage
Il tradizionale metodo di analisi familiare basato sulla segregazione è certamente da preferire
quando possibile. La disponibilità di marcatori polimorfi ad elevata informatività rendono
praticamente sempre applicabile questo metodo quando naturalmente si dispone di più componenti
del nucleo familiare, probando compreso.
Diagnosi prenatale
Considerazioni generali
La diagnosi prenatale di SMA va effettuata solo nelle coppie con accertata familiarità per SMA,
documentata dalla presenza nella famiglia di almeno un soggetto affetto confermato e caratterizzato
dal punto di vista molecolare. Per quanto riguarda le coppie che hanno già avuto un figlio affetto da
SMA, il rischio di ricorrenza è di 25 %, e viene consigliato il monitoraggio della gravidanza alla XXII settimana mediante villocentesi. Quando il rischio è inferiore, per esempio per una gravidanza
di una coppia di cui uno dei due è fratello di un affetto, quindi con un rischio di circa 1/300, viene
proposta l'analisi su liquido amniotico che presenta minori rischi relativi al prelievo (circa 0.5%).
In ogni caso è indispensabile che a ciascuna coppia che richiede DP sia fornita una adeguata
consulenza genetica nella quale vengano fornite in maniera semplice le seguenti informazioni:
2
0
valutazione del rischio riproduttivo per SMA, attendibilità e limiti del test molecolare, tempi,
modalità e rischi relativi al prelievo di villi coriali e di liquido amniotico [Linee Guida Ministero
della Salute Test Genetici]. Qualora la coppia decida di sottoporsi a DP per SMA è necessario un
consenso informato scritto che deve essere discusso con personale qualificato e con adeguato
anticipo rispetto alla data fissata per il prelievo. Nel consenso va anche specificato il rischio di
contaminazione materna dei tessuti fetali che può portare all’impossibilità di giungere ad un
risultato molecolare certo.
La diagnosi molecolare prenatale è effettuata principalmente attraverso il test della delezione in
omozigosi del gene SMN1. Si sottolinea che il requisito fondamentale è l’identificazione di questo
difetto genetico nel caso indice della famiglia. In letteratura sono stati descritti rari casi di fratelli
asintomatici aploidentici a pazienti SMA deleti in omozigosi. Tuttavia, questa condizione è stata
riscontrata soltanto in famiglie con SMA di tipo II o III. E’ difficile in questi casi predire il
potenziale patogenetico di questi alleli deleti se trasmessi al feto. L’analisi indiretta di segregazione
dei marcatori microsatelliti della regione 5q13 è indispensabile nelle famiglie con un paziente
clinicamente affetto da SMA che presenti la delezione del gene SMN1 in eterozigosi. Un’eccezione
può essere costituita dai casi di un probando nella famiglia con un forte sospetto clinico di SMA e
consanguineità dei genitori, questi due fattori infatti rendono più probabile lo stato di omozigosi per
un allele raro non deleto per SMN1. L’analisi di linkage con marcatori intragenici e/o
fiancheggianti SMN1, è tuttavia raccomandata SEMPRE per confermare il risultato del test diretto
di delezione e per escludere contaminazioni di cellule materne nel tessuto fetale. Lo studio di
segregazione degli aplotipi a rischio nel nucleo familiare permette anche in alcuni
casi di
determinare l’eventuale stato di portatore del feto. E’ opportuno tuttavia che le famiglie alle quali
viene somministrato un test prenatale di SMA, ricevano una consulenza genetica pre- e post-test [si
veda Linee Guida per le Attività di Genetica Medica, 2004].
Protocolli molecolari
Test diretto attraverso l’analisi della delezione in omozigosi del gene SMN1
Il test viene eseguito come nel caso di conferma diagnostica del sospetto clinico di SMA (vedi
apposita sezione). Consigliamo di inserire come controllo positivo per la delezione di SMN1, il
caso indice della famiglia in analisi, per confermarne il difetto molecolare (ad es. delezione del solo
esone 7 del gene SMN1).
Test diretto attraverso l’analisi di segregazione dei cromosomi a rischio nella famiglia (analisi
di linkage)
E' possibile utilizzare una vasta gamma di marcatori microsatelliti fiancheggianti il gene SMN
riportati in tabella (Tabella 3). Questo permette nella maggior parte dei casi di trovare almeno un
2
1
marcatore informativo centromerico ed uno telomerico per ottenere una probabilità di errore dovuta
a ricombinazione inferiore all'1%. Esistono inoltre due marcatori multicopia intragenici localizzati
nel promotore dei geni SMN1/SMN2 che possono essere utilizzati in combinazione con l'analisi di
marcatori extragenici, in quanto la loro corretta interpretazione è resa difficile dall'elevato numero
di alleli presenti. L’utilizzo della elettroforesi capillare per questo tipo di analisi con l’accorgimento
di scegliere marcatori microsatelliti di diversa grandezza amplificati attraverso primer marcati con
fluorofori distinti, permette di effettuare la lettura in maniera rapida ed affidabile [Botta et al 2005].
La comparazione dei cromatogrammi relativi al DNA fetale e a quello materno permette di
escludere eventuali contaminazioni materno-fetali.
2
2
Markers della regione di SMN1 (5q11.2-q13.3)
Locus
Localizzazione
% di
Rispetto ad SMN
Ricombinazione
PIC
Dimensione
D5S679
Prossimale
3
0.63
180-222
D5S680
Prossimale
3
0.57
141-173
D5S125
Prossimale
2
0.38
143 e 147
D5S681
Prossimale
2
0.68
142-156
D5S435
Prossimale
1
0.68
128-144
D5S629
Prossimale
1
0.81
233-253
D5S823
Prossimale
1
0.54
128-150
0
0.98
90-122
0
0.99
166-203
D5S1556/D5F150 Intragenico/SMN1
promoter region
D5S149
Intragenico/SMN1
promoter region
D5S557
Distale
1
0.46
148-172
D5S610
Distale
1
0.80
106-124
D5S351
Distale
1
0.74
196-234
5’-MAP1B
Distale
1
0.76
100
3’MAP1B
Distale
1
0.72
212-226
D5S112
Distale
1
0.74
94-120
D5S127
Distale
3
0.84
96-114
D5S539
Distale
5
0.74
212-220
Tabella 3. Marcatori microsatelliti dalla regione SMA (5q11.2-q13.3). [da Scheffer H et al 2001].
2
3
Elenco Siti internet consultabili
http://www.famigliesma.org/chi.htm
http://www.fsma.org/
http://www.genetests.org/
Elenco centri di riferimento per la diagnosi molecolare della SMA
Cattedra di Genetica Medica
Università di Roma “Tor Vergata”
Via Montpellier, 1- 00133 Roma
Prof. Giuseppe Novelli
Dott.ssa Annalisa Botta
Istituto di Genetica Medica
Università Cattolica del S. Cuore
Largo F. Vito, 1 - 00168 Roma
Prof. Christina Brahe
Dr. Francesco Danilo Tiziano
Fondazione IRCCS Istituto Neurologico “Carlo Besta”
Via Celoria, 11- 20133 Milano
Prof. Franco Taroni
Dott.ssa Cinzia Gellera
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