UNIVERSITA’ DEGLI STUDI” LA SAPIENZA” ROMA
DOTTORATO DI RICERCA:
“TECNOLOGIE BIOMEDICHE IN MEDICINA CLINICA”
Studio genetico del Diabete MODY (Maturity Onset
Diabetes of the Young): approcci diagnostici in
fenotipi diversi
DIPARTIMENTO SCIENZE CLINICHE UNIVERSITA’ DI ROMA LA SAPIENZA
DIPARTIMENTO SCIENZE MEDICHE INTERNISTICHE UNIVERSITA’ DI CAGLIARI
DOTTORANDA: Michela Incani
TUTOR: Prof. Marco Giorgio Baroni
1
INDICE
1. INTRODUZIONE
2. Il MODY
2.1 Definizione
2.2 Classificazione e prevalenza
2.3 Caratteristiche fenotipiche
2.4 Genetica e meccanismo d’azione enzimatico
2.4.1 Difetti nel gene glucochinasi
2.4.2 Difetti in geni che codificano per fattori di trascrizione
2.5 Caratteristiche cliniche e terapia
2.6 Altre forme di diabete monogenico
2.6.1Diabete associato a disfunzioni del pancreas esocrino
2.6.2 MIDD
2.6.3 PNDM
2.6.4 Sindrome di Wolfram
2.6.5 Anomalie genetiche nel diabete familiare a insorgenza tardiva
2.7 Nuova classificazione del diabete monogenico e criteri di inclusione
2.7.1 Analisi del gene GCK in pazienti con lieve iperglicemia a digiuno
2.7.2 Analisi del gene GCK in pazienti con diabete gestazionale
2.7.3 Analisi del gene HNF-1α
2.7.4 Analisi del gene HNF-4α
2.8 Significato dello screening per il diabete monogenico
3. OBIETTIVI DELLO STUDIO
4. CASISTICA
4.1 Bambini e adolescenti sovrappeso/obesi.
4.1.1 Studi correlati
4.2 Diabete Gestazionale
4.3 Pazienti diabetici
2
5. MATERIALI E METODI
5.1 Genetica
5.1.1 Estrazione del DNA
5.1.2 Disegno dei primers
5.1.3 Amplificazione tramite Polimerasi Chain Reaction (PCR)
5.1.4 Elettroforesi su gel di agarosio
5.1.5 Purificazione dei prodotti PCR
5.1.6 Reazione di sequenziamento ed analisi delle sequenze
5.2 Immunologia
5.2.1 Metodi radioimmunologici (RIA) per determinazione degli autoanticorpi
5.3 Analisi Statistica
6. RISULTATI
6.1 Bambini sovrappeso/obesi
6.1.1 Valutazione delle iperglicemie
6.1.2 Analisi Immunologica
6.1.3 Analisi Genetica: GCK, HNF-1α, HNF-1α
6.1.4 Identificazione di geni responsabili nelle forme non classificabili come MODY:
determinazione delle mutazioni nei geni SLC30A8 e KNCJ11
6.1.5 Studi correlati
6.2 Diabete Gestazionale
6.3 Pazienti diabeti
7. CONCLUSIONI
7.1 Bambini obesi sovrappeso
7.1.1 Assetto genetico della popolazione sarda
7.2 Diabete Gestazionale
7.3 Pazienti diabetici
8. BIBLIOGRAFIA
APPENDICE I: Elenco Papers
APPENDICE II: Elenco Abstract
3
1. Introduzione
Il Diabete Mellito rappresenta una patologia di grande significato con una prevalenza
crescente e un peso considerevole nella macroeconomia sia dei paesi sviluppati che di quelli
in via di sviluppo [1,2]. Con il termine Diabete Mellito si intende un gruppo eterogeneo di
malattie ad eziologia multipla, caratterizzato da disturbi nel metabolismo dei carboidrati, delle
proteine e dei grassi. Questa patologia può essere considerata come il risultato
dell’alterazione nella secrezione e/o nell’azione insulinica con conseguente incremento dei
livelli glicemici [3,4].
Le forme principali di diabete comprendono il Diabete Mellito di tipo 1 (T1DM) e di tipo 2
(T2DM). Il T1DM rappresenta un difetto primario della funzione β cellulare mentre il T2DM
può essere descritto come una combinazione tra disfunzioni delle β cellule e diminuzione
della sensibilità all’insulina (insulino-resistenza). In condizioni fisiologiche normali, esiste una
relazione inversa tra la secrezione insulinica e la sensibilità all’insulina; questa relazione
identifica l’indice di predisposizione il quale si ritiene diminuisca nella patogenesi del T2DM
[5]. In un modello tipico di T1DM invece il diabete rappresenta il punto finale di un
determinato processo patofisiologico con la diminuzione della massa funzionale delle β
cellule pancreatiche [6] e lo sviluppo di uno stato di insufficienza endocrino-pancreatica.
Esiste comunque una chiara fase preclinica con perdita di risposta all’insulina antecedente
allo sviluppo delle alterazioni glucidiche [6,7]. Un insufficiente secrezione delle isole di
Langerhans rappresenta quindi il punto determinante della patogenesi del diabete di tipo 1 e
del tipo 2, che si riflette in termini di deficienza insulinica assoluta o relativa [4]. Inoltre tra gli
altri specifici tipi di diabete, due gruppi sono direttamente collegati a disturbi o disfunzioni
pancreatiche: i difetti monogenici della funzione β cellulare e le malattie del pancreas
esocrino di cui verrà discusso in seguito. Studi su modelli animali, mostrano come il grado di
riduzione della massa β cellulare, per necessario ad indurre iperglicemie, varia tra specie
diverse. E’ necessaria una pancreatectomia del 90% per indurre iperglicemie nei roditori [8]
mentre una riduzione del 50% nella massa delle β cellule, indotta dalla streptozocina, è in
4
grado di produrre iperglicemie nei babbuini [9].
Nei soggetti con T2DM è presente una riduzione della popolazione cellulare stimata tra 0 e
30%, accompagnata da amiloidosi [10] mentre in soggetti con cancro del pancreas la
disfunzione endocrina è rappresentata da una minore riduzione della massa cellulare [11]. Il
deterioramento funzionale delle cellule e quindi non solo un’assoluta riduzione della massa β
cellulare, sembra contribuire allo sviluppo della patologia diabetica [12] rendendo difficile
valutare quanta massa β cellulare sia necessaria a contrastare l’iperglicemia.
Il diabete di tipo 1 è suddiviso in T1DM immunomediato I.A. e T1DM idiopatico I.B. (ADA
2009). Il primo tipo è caratterizzato da una distruzione autoimmune delle β cellule mentre il
secondo non mostra alcuna forma di autoimmunità [13]. In particolare varianti nella regione
HLA [14] ma anche varianti nel gene INS che codifica per l’insulina [15], il locus CTLA4 [16],
il gene PTPN22 [17], regione del gene IL2RA [18], la regione del gene IFIH1 [19] e
probabilmente il gene EIF2AK3 [20] conferiscono suscettibilità genetica al diabete tipo I.A.
Un recente lavoro inoltre, mette in evidenza il ruolo importante dell’ambiente nell’evoluzione
del diabete tipo I.A [21]. Anche per il diabete di tipo 2 [22,23] la suscettibilità di alcuni geni è
stata messa in relazione con la funzione β cellulare e l’azione dell’insulina, evidenziando
probabili cause genetiche oltre che ambientali [24]. La lista dei geni le cui varianti potrebbero
essere coinvolte nella patogenesi del T2DM è lunga, ma solo pochi tra questi sono stati
confermati in coorti numerose. Varianti nei geni PPAR-γ, KCNJ11 [25], IRS1 [26], ADIPOQ
[27] sono state riportate come probabile causa di aumentato rischio per T2DM in grado di
causare insulino-resistenza e relativo deficit di secrezione insulinica. Studi di questo genere
potrebbero portare all’individuazione di geni candidati per le forme poligeniche di diabete di
tipo 2, ma anche alla scoperta di altre forme monogeniche di diabete ad esordio precoce
EOD (early−onset diabetes) diverse da quelle fino ad oggi descritte, mettendo sempre più in
evidenza l’eterogeneità alla base della patogenesi del diabete mellito.
Nell’arco degli ultimi anni sono state studiate le cause di molte forme monogeniche di
diabete ad esordio precoce EOD (early−onset diabetes). In questo quadro clinico possono
essere inseriti il MODY (Maturity Onset Diabetes of the Young), il MIDD (Maternally Inherited
5
Diabetes and Deafness) e il diabete neonatale. Di queste tre forme monogeniche si discuterà
successivamente, portando particolare attenzione alle varie forme del Diabete MODY che
rappresenta l’argomento cardine di questo studio.
6
2. Il MODY
2.1 Definizione
Il MODY (Maturity Onset Diabetes of the Young) descritto per la prima volta nel 1974-1975
da Tattersall [28, 29] è la più comune forma di diabete monogenico, clinicamente e
geneticamente eterogeneo, con trasmissione autosomica dominante, penetranza completa
ed interessamento di almeno 3 generazioni all’interno dello stesso nucleo familiare,
tipicamente diagnosticato prima dei 25 anni o comunque in età giovanile, non autoimmune e
non insulino-dipendente [30].
2.2 Classificazione e prevalenza
Si stima che il MODY sia responsabile del 2-5% dei casi di diabete [31 ,32, 33] anche se
sovente viene impropriamente classificato come diabete di tipo 1 o di tipo 2.
Studi di genetica molecolare hanno dimostrato che questa condizione non è riconducibile ad
una singola entità eziologica, bensì a una patologia particolarmente eterogenea dal punto di
vista clinico e genetico.
Seguendo le ultime linee di classificazione ADA 2009 [34] il MODY viene suddiviso in 6
diversi tipi, che interessano 6 geni differenti, tutti espressi nelle β cellule pancreatiche. Sono
state descritte mutazioni nonsense, missense, frameshift e di sito di splicing, distribuite lungo
tutti gli esoni dei geni causa di MODY. I geni responsabili di questa forma di diabete
monogenico codificano:
a) per l’enzima glucochinasi (GCK-MODY2) [35]
b) per fattori di trascrizione:
hepatocyte nuclear factor-4 α (HNF-4α - MODY1) [36]
hepatocyte nuclear factor-1 α (HNF-1α/TCF1 - MODY3) [37, 38]
insulin promoter factor 1 (IPF1/PDX1 - MODY4) [39]
hepatocyte nuclear factor-1β (HNF-1β/TCF2- MODY5) [40]
neurogenic differentiation factor 1 (NeuroD1/2β- MODY6) [41]
7
Non tutte le basi genetiche del diabete MODY sono state individuate: molti sono infatti i casi
di famiglie in cui è stato dimostrato che i geni responsabili di malattia si trovano al di fuori
dei loci MODY attualmente conosciuti e identificati [42,43].
I dati epidemiologici presenti in letteratura mettono in evidenza l’estrema variabilità della
distribuzione dei vari sottotipi di MODY, in base a diversi fattori come l’etnia, la regione
geografica, l’età dei pazienti studiati, ed il metodo di reclutamento del campione.
Studi di coorte hanno evidenziato una differente prevalenza dei vari sottotipi di MODY in
popolazioni diverse [44, 45, 46]. Il MODY 2 è stato riscontrato in percentuali variabili dal
10% al 60% di tutti i casi di MODY con prevalenza maggiore in famiglie francesi e italiane.
Il MODY 3 presenta una prevalenza variabile dal 20% al 65% dei casi (prevalente nelle
famiglie inglesi). La penetranza del MODY 3 a seconda dell’età è piuttosto significativa: si
attesta al 63% nei soggetti fino a 25 anni; sale al 93,6% nei soggetti da 25 a 50 anni, fino ad
arrivare ad un 98,7% nei soggetti da 50 a 75 anni [47]; ciò indica come la disfunzione β
cellulare si instauri progressivamente in questa forma di diabete monogenico.
Le altre forme di MODY sono più rare in tutti gli studi di coorte, mentre i sottotipi con loci
MODY non ancora identificati (MODY-X) potrebbero rappresentare dal 20% al 50% dei casi,
con maggiore prevalenza nelle famiglie tedesche e spagnole [44,45].
8
TIPO
Difetto
primitivo
Fenotipo clinico
Fattore di
trascrizione
(recettore
nucleare)
Pancreas/altro
Iperinsulinemia
neonatale,Diabete
(giovane età adulta)
GCK
Esochinasi IV
Pancreas/fegato
Iperglicemia
moderata (giovane
età adulta)
HNF1A
Fattore di
trascrizione
(homeodomain)
Pancreas/rene
Diabete
(giovane età adulta)
Pancreas
Diabete
(nell’omozigote
agenesia
pancreatica)
Locus
Gene
MODY1
20q
HNF4A
(TCF1)
MODY2
7p
MODY3
12q
Funzione
proteina
MODY4
13q
IPF2
Fattore di
trascrizione
(homeodomain)
MODY5
17q
HNF1β
(TCF2)
Fattore di
trascrizione
(homeodomain)
Rene/pancreas
Diabete, RCAD,
ipoplasia pancreatica
MODY6
2q
NEUROD1
Fattore di
trascrizione
(Bhlh)
Pancreas
Diabete (infanzia e
giovane età adulta)
Tabella 1: Classificazione clinica e fenotipo dei sottotipi di MODY. [modificata da: Vaxillaire M et al.,
Monogenic diabetes in the young, pharmacogenetics and relevance to multifactorial forms of type 2
diabetes, Endocrine Reviews, 2008].
2.3 Caratteristiche fenotipiche
In generale sono consigliati i test genetici necessari per una corretta diagnosi di MODY
ogni qual volta sia presente un simile quadro clinico [48] :
Iperglicemia abitualmente diagnosticata prima dei 30 anni di età in almeno uno,
meglio se due, componenti della stessa famiglia. La progressiva riduzione dell’età
alla diagnosi nelle casistiche è probabilmente riconducibile ad un’aumentata
attenzione verso queste forme di diabete e conseguentemente all’anticipazione dei
test utili per la diagnosi.
Ereditarietà di tipo autosomico dominante a trasmissione verticale, attraverso
almeno tre generazioni.
Indipendenza dalla terapia insulinica per almeno cinque anni dopo la diagnosi o
9
livelli di C-peptide significativi anche in pazienti in terapia insulinica.
Livelli di insulinemia che rientrano nel range di normalità, benché insufficienti a
correggere l’iperglicemia presente, in considerazione del primitivo difetto nella
funzione β- cellulare.
Assenza di sovrappeso o di obesità.
Type1 DM
Type2 DM
MODY
Frequency
Common
Increasing
2-5%of non– insulin
dependent Diabetics
Genetics
Polygenic
Polygenic
Autosomal Dominant
Family History
<15%
>50%
100%
Ethnicity
Different races
Asians,Polynesians,
Indigenous,Australians
Different races
Age of onset
Throughout Childhood
Post-Puberty
<25 yrs
Severity of onset
Acute and severe
Mild
Mild/Asymptomatic
Ketosis / DKA
Common
Uncommon
Rare
Obesity
+/-
>90%
+/-
Acanthosis Nigricans
Absent
Common
Absent
Metabolic Syndrome
Absent
Common
Absent
Auto-immunity
Positive
Negative
Negative
Pathophysiology
Β Cell destruction
Insulin resistance and relative
insulinopaenia
β Cell dysfunction
Tabella 2: Caratteristiche cliniche per la diagnosi differenziale dei diabete tipo 1, tipo 2, MODY
10
2.4 Genetica e meccanismo d’azione enzimatico
2.4.1 Difetti nel gene glucochinasi
Il MODY 2 è causato da mutazioni del gene GCK localizzato sul cromosoma 7, che codifica
per l’enzima glucochinasi, uno dei quattro membri della famiglia delle esochinasi, anche
chiamata esochinasi IV o D. La glucochinasi (465 residui amminoacidici, 52.191 dalton) è
l’enzima chiave per la fosforilazione del glucosio a glucosio-6-fosfato in grado di catalizzare
il trasferimento di fosfato da ATP al glucosio nelle cellule del parenchima epatico e nelle
isole pancreatiche con conseguente variazione della concentrazione di glucosio [49].
Figura 1: Modello di β-cellula pancreatica e proteine implicate nel MODY [Figura tratta da: Nyunt O
et al., Investigating maturity onset diabetes of the young, Clin Biochem Rev, 2009].
Dato il ruolo centrale svolto dall’enzima glucochinasi nella regolazione dell’insulina è
facilmente deducibile che mutazioni nel gene che codifica per quest’enzima possano
causare alterazioni nel metabolismo glucidico e quindi causare iper o ipoglicemie. Le
mutazioni in eterozigosi inattivanti il gene GCK, presentano una diminuzione dell’attività
enzimatica e sono caratterizzate da una leggera forma di diabete, spesso presente fin dalla
nascita ma riscontrata successivamente [50,51]. Le mutazioni in omozigosi, che inattivano
11
le funzioni del gene GCK, provocano un fenotipo più severo con insorgenza, fin dalla
nascita, il PNDM (Permanent Neonatal Diabetes Mellitus) [52] di cui si discuterà più nel
dettaglio successivamente. Oltre le forme appena citate, sono state descritte come causa di
ipoglicemia mutazioni in eterozigosi attivanti il gene GCK [53,54,55]
Da un punto di vista strutturale il gene GCK è composto da 12 esoni (circa 45,168 bp) ed è
espresso nel fegato, nel pancreas e in alcune cellule del sistema nervoso. La presenza di
promotori tessuto specifici permettono la regolazione e la trascrizione differenziale di trascritti
che danno luogo a tre differenti versioni dell’esone 1 (a,b,c). Il promoter upstream è
funzionale principalmente nel pancreas ma anche in alcune popolazioni cellulari del sistema
nervoso, il promoter downstream è espresso unicamente nel fegato. Gli esoni 1b e 1c sono
espressi nel fegato mentre l’esone 1a è espresso nelle β cellule pancreatiche [56, 57]
Lo scopo di questo studio è stato quello di valutare gli effetti di mutazioni nel gene GCK
causa di MODY 2, analizzando l’isoforma 1a espressa specificatamente nelle β cellule
pancreatiche responsabili di un impatto maggiore nell’organismo rispetto a quello delle
cellule epatiche nel set point del glucosio [54]
I numerosi studi per la valutazione della GCK come gene candidato hanno portato all’
identificazione di oltre 190 mutazioni, tutte responsabili di insorgenza di MODY [58]. Studi
sulle caratteristiche cinetiche delle varianti mutate di GCK hanno dimostrato che l’attività
enzimatica è ridotta con un conseguente rallentamento del ciclo glicolitico all’interno della β
cellula pancreatica [49]. In vivo, tale rallentamento si traduce in un’alterazione della
sensibilità al glucosio, per cui sono necessarie concentrazioni elevate di glucosio per
raggiungere la soglia glicemica adeguata a stimolare la secrezione insulinica [59]. Ciò si
traduce in uno spostamento verso destra della curva dose-risposta della secrezione
insulinica indotta dal glucosio [60]. Nel fegato si osserva una riduzione della sintesi e del
deposito di glicogeno con un aumento della gluconeogenesi dopo i pasti. Questa
alterazione nel metabolismo epatico del glucosio è responsabile dell’iperglicemia postprandiale nei pazienti affetti da MODY 2 [61]. Nonostante le importanti alterazioni del
metabolismo del glucosio, l’iperglicemia associata a mutazioni della GCK è generalmente
12
moderata, usualmente responsiva alla sola dietoterapia; meno del 50% dei pazienti affetti
presentano un franco diabete. Paragonato agli altri sottotipi ed al diabete di tipo 2, il MODY
2 presenta una minor prevalenza di complicanze microvascolari (retinopatia e proteinuria)
[62], come prevedibile dal miglior grado di compenso glicemico raggiunto.
Nel feto, le mutazioni della GCK provocano basso peso alla nascita, probabilmente perché
la crescita fetale è in parte stimolata dall’insulina. D’altro canto, le mutazioni della GCK nella
madre inducono in modo indiretto un aumento del peso alla nascita a causa della
stimolazione della secrezione insulinica fetale da parte dell’iperglicemia materna [30, 63]
Più recentemente, alcuni studi hanno dimostrato che una variante comune della GCK,
localizzata nella regione promoter dell’isoforma 1a nelle β cellula (-30 G>A), influenza il
peso alla nascita ed i livelli di glicemia a digiuno con effetti persistenti lungo il corso della
vita ed è associata a diabete gestazionale [64], ad alterazioni della regolazione dei livelli
glicemici e ad una maggiore prevalenza di diabete di tipo 2 con malattia coronarica [65].
2.4.2 Difetti in geni che codificano per fattori di trascrizione
Numerosi studi svolti con l’approccio del gene candidato e la tecnica del positional cloning
(identificazione e clonazione di un gene attraverso la sua posizione) hanno portato
all’identificazione dei geni codificanti per i cinque fattori di trascrizione coinvolti nella
patogenesi di altrettante forme di MODY: HNF-1α, HNF-4α, HNF-1β, IPF1/PDX1 e
NeuroD1/ β2. Gli studi, svolti con la metodica del gene target sugli animali, hanno
dimostrato che questi geni rivestono un ruolo cruciale nello sviluppo e nella neogenesi del
pancreas fetale, così come nella funzione e differenziazione delle β cellule pancreatiche
[66]
HNF-1α
Le mutazioni che causano MODY 3 interessano il gene TCF1/HNF1α che codifica per il
fattore di trascrizione HNF1α sul cromosoma 12 (631 residui amminoacidici, 67.356 dalton).
Il gene HNF1α è caratterizzato dalla presenza di un omeodominio (l’homeobox comprende i
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residui amminoacidici 199-279) e come buona parte dei fattori di trascrizione che regolano
l’espressione dei geni degli eucarioti, è in grado di dimerizzare per poi legarsi al DNA,
specificatamente
alla
sequenza
palindroma
invertita
5’-GTTAATNATTAAC-3’.
La
dimerizzazione richiede l’intervento del cofattore DCoH (Dimerization Cofactor of HNF1α)
che non si lega al DNA, ma selettivamente stabilizza i dimeri HNF1α.
Più di 150 differenti mutazioni patogenetiche nelle porzioni codificanti del gene HNF-1α
sono state riscontrate nelle popolazioni studiate [49]. I pazienti con queste mutazioni
sviluppano la malattia usualmente dopo la prima decade di vita: l’insorgenza di un diabete
franco è preceduto da alterazioni della
secrezione insulinica glucosio-indotta [67]. La
penetranza di questa forma è elevata anche se dipendente dall’età: la probabilità che la
malattia venga diagnosticata aumenta infatti in modo rilevante fra i 10 e i 40 anni [44]. Non
è chiara la ragione per cui i soggetti sviluppino la malattia in età differenti o perché la gravità
della disfunzione β cellulare sia così variabile; il deficit di secrezione insulinica è riscontrato
anche in soggetti non diabetici portatori di mutazione a carico di HNF-1α in assenza di
insulino-resistenza [68]. Al contrario del MODY 2, caratterizzato da una iperglicemia
moderata, il fenotipo caratteristico dei pazienti affetti da MODY 3 è una forma differente e
più grave di diabete che sovente evolve verso l’insulino-dipendenza e tende a sviluppare
complicanze microvascolari, come il diabete a insorgenza più tardiva [60]. L’HNF-1α è
anche espresso a livello delle cellule tubulari renali e il MODY 3 è associato ad una ridotta
soglia per la glicosuria; ciò riflette un’alterata espressione del trasportatore per il glucosio e
una disfunzione a carico della componente tubulare renale [69]. Dati sperimentali hanno
mostrato che le mutazioni dell’HNF-1α localizzate a livello del dominio di trans-attivazione
della proteina potrebbero presentare un effetto negativo dominante sulla potenziale transattivazione dei dimeri di HNF-1α [68]. A differenza di ciò che si verifica negli uomini, nei topi
eterozigoti per la mutazione non si osservano effetti evidenti sul fenotipo. Negli omozigoti
invece, benché il topo non sia un modello ideale di patologia umana, si osservano
importanti alterazioni negli epatociti, nelle cellule tubulari renali e nelle β cellule, con
conseguente diabete. Studi più approfonditi nei topi hanno evidenziato una rilevante
14
riduzione della secrezione insulinica glucosio-indotta [70], prova del ruolo chiave svolto dal
HNF-1α nel mantenere la normale funzione β cellulare. Tale deficit può essere spiegato
dalla riduzione del flusso glicolitico all’interno delle isole pancreatiche ed è associato a una
ridotta espressione dei geni che codificano per il trasportatore del glucosio GLUT2 e per la
piruvato chinasi di tipo L [70, 71].
HNF-4α
Le mutazioni in eterozigosi nel gene, situato sul cromosoma 20, che codifica per il fattore di
trascrizione HNF-4α (474 residui amminoacidici, 52.785 dalton) sono causa di MODY 1.
Mutazioni all’interno di questo gene sono molto più rare rispetto a quelle di GCK per il
MODY 2 e di HNF-1α per il MODY 3 [49, 72]. HNF-4α contiene una regione con due
potenziali dita di zinco tra i residui amminoacidici 60/80 e 96/120 e omodimerizza per legarsi
al suo sito di riconoscimento sul DNA. Numerose isoforme di HNF-4α risultanti da splicing
alternativo di due differenti promotori rispettivamente denominati P1 (prossimale) e P2
(distale) sono state identificate. Il promotore P1 è attivo nei tessuti extrapancreatici, mentre
P2 è strettamente correlato all’espressione nelle β cellule di tre varianti da splicing, con
differenze nella regione 3’- terminale. Dopo la traduzione l’attività di HNF-4α è regolata dalla
fosforilazione di alcuni suoi residui di tirosina (12 dei 13 residui di tirosina sono otenziali siti
di fosforilazione). La fosforilazione è importante sia per l’attività del legame che HNF-4α
stabilisce con il DNA sia per la sua distribuzione subnucleare. Fondamentale funzione di
HNF-4α, è quella di regolare il trasporto del glucosio e la glicolisi contribuendo a mantenere
l’omeostasi del glucosio. La perdita di funzione di tale proteina, a seguito di mutazione,
determina la perdita dell’attività necessaria alla transattivazione trascrizionale, l’impossibilità
di dimerizzazione e il mancato legame al DNA. E’, inoltre, importante ricordare che HNF-4α
esplica anche un’importante funzione nella regolazione dell’espressione di molti geni
essenziali per il normale funzionamento del fegato, dell’intestino, del rene.
Dal punto di vista clinico, il fenotipo MODY 1 è indistinguibile da quello MODY 3 causato da
mutazioni nel gene HNF-1α [72]. Questa concordanza di fenotipo rivela una stretta
15
interdipendenza fra HNF-1α e HNF-4α: essi infatti fanno parte di un comune network di
regolazione della β cellula [73, 74].
L’HNF-4α appartiene a una superfamiglia di recettori per ormoni steroidei e tiroidei. E’ stato
dimostrato che gli acidi grassi a catena lunga modulano l’attività trascrizionale dell’HNF4α
legandosi, come i tioesteri dell’acil-CoA, al ligando associato al dominio dell’HNF-4α [75];
questa caratteristica può spiegare il ruolo dei grassi provenienti dalla dieta nel controllo
della secrezione insulinica. I geni target dell’HNF-4α nella β cellula, che potrebbero essere
responsabili del fenotipo MODY 1, sono stati parzialmente identificati nel pathway della
secrezione insulinica e nel trasporto e metabolismo del glucosio [76, 77]
Come precedentemente detto l’HNF-4α svolge un ruolo di regolazione nell’espressione di
alcuni geni
come HNF-1α nell’endoderma embrionale, nel fegato, nelle cellule
pancreatiche, mentre il controllo dell’HNF-1α sull’HNF-4α si limita alla cellule pancreatiche e
in parte alle cellule intestinali.
L’interdipendenza fra i due fattori con una regolazione
positiva specifica all’interno della β cellula è essenziale per la funzione delle β cellule stesse
e contribuisce a spiegare come la perdita di un allele funzionante provochi una insufficiente
concentrazione dell’attivatore, necessario per esplicare le risposte dei geni bersaglio nelle
isole pancreatiche [73].
Uno studio sul peso alla nascita e l’incidenza di ipoglicemia nelle mutazioni a carico di HNF1α e HNF-4α ha mostrato che le mutazioni di HNF-4α sono associate ad un aumentato
peso alla nascita e macrosomia e possono essere considerate come una insolita causa di
ipoglicemia neonatale [78]. Tale studio ha dimostrato il ruolo chiave dell’HNF-4α nella
regolazione della secrezione insulinica nella vita intra-uterina: tale secrezione determina il
peso fetale alla nascita. E’ noto che l’iperinsulinemia in utero e durante il periodo neonatale
può evolvere tardivamente verso un deficit di secrezione insulinica e diabete. Poiché questo
fenomeno non è stato osservato nei portatori della mutazione per HNF-1α [78], si desume
che nelle fasi iniziali HNF-4α svolga un ruolo indipendente da HNF-1α.
16
TCF2/HNF-1β
Il MODY 5 è causato da mutazioni del gene che codifica per il fattore di trascrizione HNF-1β,
noto anche come TCF2 (Tracription Factor 2) localizzato sul cromosoma 17 e costituito da
557 residui amminoacidici 61.324 dalton. Questo fattore di trascrizione contiene un
omeodominio
(residui
amminoacidici
231-311)
che
è
strutturalmente
correlato
all’omeodominio (residui amminoacidici 199-279) di HNF-1α e presenta un dominio di
dimerizzazione (residui amminoacidici 1-31), omologo a quello di HNF-1α (residui
amminoacidici 1-31), che consente sia la omodimerizzazione sia la formazione di un
eterodimero con HNF-1α. Questi dimeri sono stabilizzati dalla proteina DCoH che si lega ai
domini di dimerizzazione sia di HNF-1α che di HNF-1β formando un complesso
eterotetramerico in grado di accrescere l’attività trascrizionale. Le mutazioni a carico del
TCF2 sono responsabili di una forma rara di diabete MODY a insorgenza precoce e di una
grave forma di patologia renale, che può anche rendersi evidente prima dell’intolleranza al
glucosio. Il più comune fenotipo dei pazienti MODY 5 è caratterizzato da cisti renali
associate o meno a particolari anomalie istologiche come meganefroni [79]; questo quadro
è stato riassunto in una sindrome, chiamata RCAD (Renal Cysts and Diabetes Syndrome)
[79, 80]. Sono state inoltre descritte anomalie dell’apparato genitale interno nelle donne
portatrici di mutazioni nel gene TCF2 [77]. Il TCF2 svolge un ruolo fondamentale nello
sviluppo renale e nella differenziazione dei nefroni nonché come regolatore del network di
fattori di trascrizione che controllano crescita e differenziazione
l’embriogenesi
del pancreas durante
[81, 82]. Le mutazioni a carico del TCF2 sovente causano ipoplasia
pancreatica [80, 82] . Gli studi più recenti hanno dimostrato che mutazioni puntiformi, quali
piccole delezioni/inserzioni e grandi riarrangiamenti genomici del TCF2 sono responsabili
della maggior parte dei fenotipi classificati come MODY 5 [83].
IPF1/PDX1
Il fattore pancreatico-duodenale PDX1 (Pancreatic Duodenum Homeobox 1), 283 residui
17
amminoacidici, 30.771 dalton) contiene un omeodominio proteico la cui espressione è
necessaria per lo sviluppo del pancreas. Mutazioni nel gene, localizzato nel cromosoma 13,
che codifica per il fattore di trascrizione PDX1 anche chiamato IPF1 (Insulin Promoter
Factor 1) sono causa di MODY4.
Il fattore PDX1 è stato identificato per la prima volta nei topi con 8,5 giorni di vita embrionale
e la sua espressione è inibita durante lo sviluppo per poi riapparire più tardivamente. PDX1
è indispensabile insieme all’insulina per indurre lo sviluppo e per mantenere il fenotipo
differenziato della β cellula. Benché non sia necessario nell’endoderma per il
differenziamento pancreatico è cruciale per lo sviluppo delle cellule endocrine ed esocrine.
Nei topi, l’inattivazione di questo gene porta all’agenesia del pancreas, arrestando lo
sviluppo dell’organo in fasi precoci; inoltre si ha una distruzione selettiva delle β cellule che
conduce allo sviluppo di diabete con l’aumentare dell’età [73]. PDX1 è un regolatore
trascrizionale dei geni specifici per il pancreas endocrino negli adulti, quali la preproinsulina, il trasportatore del glucosio di tipo 2, i geni per la GCK nella β cellula e il gene
della somatostatina nelle cellule δ.
Nell’uomo, una delezione a carico della sequenza codificante per il gene PDX1 è stata
associata a MODY in soggetti consanguinei [39]. Nei portatori eterozigoti i fenotipi variano
da una semplice intolleranza al glucosio (IGT) al diabete conclamato non insulinodipendente. E’ riportato in letteratura il caso di un neonato omozigote per la mutazione nato
con agenesia del pancreas il quale manifestava sia diabete sia insufficienza esocrina. Sono
stati tuttavia riconosciuti solo pochi casi con difetto del gene PDX1 associato ad agenesia
del pancreas [39].
NeuroD1/β2
Il fattore di trascrizione NeuroD1/β2 o NEUROD1 (Neurogenic Differentiation 1) 356 residui
amminoacidici, 39.890 dalton, posizionato sul cromosoma 2, fa parte di una famiglia di
fattori di trascrizione elica-ansa-elica e svolge un ruolo chiave nello sviluppo del pancreas e
del sistema nervoso centrale. Il gene NEUROD1 contiene due esoni. Di questi, il primo non
18
è tradotto, mentre il secondo codifica per la proteina NEUROD1, anche nota come BETA2,
la quale, a seguito di eterodimerizzazione con la proteina ubiquitaria E47, appartenente alla
famiglia b HLH (basic Helix-Loop-Helix), attiva l’espressione del gene INS (che codifica per
l’insulina) legandosi per mezzo del sito E sul promotore INS. La localizzazione nucleare di
questa proteina nelle β cellule si deve alla fosforilazione, stimolata dal glucosio, del residuo
di serina localizzato in posizione 274. Particolarmente studiate sono alcune mutazioni in
eterozigosi del gene NEUROD1 associate allo sviluppo del MODY 6, come quelle all’interno
del dominio di legame per il DNA (per cui è impedito il legame al sito E di NEUROD1) o
quelle nella regione C-terminale.
Nei topi con deficit di NEUROD1 la morfologia pancreatica è anomala e si sviluppa
iperglicemia dovuta in parte all’inadeguata espressione del gene dell’insulina. Le mutazioni
che coinvolgono il NEUROD1 sono state associate a fenotipo MODY in alcune famiglie [84].
Il quadro clinico dei pazienti con polipeptide NEUROD1 deleto è più grave rispetto a quello
dei soggetti con una sola mutazione puntiforme. Il NEUROD1 regola l’espressione del gene
dell’insulina legandosi alla regione promoter. Un legame alterato porta allo sviluppo di
questa forma di MODY.
2.5 Caratteristiche cliniche e terapia
MODY 2 e MODY 3 rispettivamente causati da mutazioni nei geni che codificano per GCK e
HNF-1α sono i due sottotipi prevalenti, responsabili di circa i due terzi di tutti i casi MODY.
Mutazioni in HNF-4α e TCF2/HNF-1β sono state identificate in poche famiglie e gli altri
difetti che causano mutazioni in IPF1 /PDX1 e NEUROD1 sono patologie ancora più rare
[49, 72]. Le differenti alterazioni a livello molecolare possono spiegare in parte la
sostanziale eterogeneità fenotipica dei vari sottotipi, sottesa alle grandi differenze nel
decorso clinico della malattia. In particolare, l’eterozigosi per la mutazione della GCK causa
in genere iperglicemia a digiuno, presente già dalla nascita, responsiva alla sola dieta e con
basso rischio di complicanze [45]. Al contrario, mutazioni del HNF-1α e del HNF-4α,
responsabili di MODY 3 e MODY 1, sono legate a una più grave alterazione dell’omeostasi
19
del glucosio che in genere richiede un trattamento con ipoglicemizzanti orali già in età non
troppo avanzata [67, 68, 72]. Studi fisiologici e metabolici hanno evidenziato che la
secrezione insulinica è mantenuta a normali livelli di glucosio ma progressivamente
diminuisce all’inizio dell’età adulta e aumenta solo in caso di incremento della glicemia. Per
queste ragioni appare evidente che i pazienti con MODY 1 e MODY 3 hanno un aumentato
rischio di sviluppare complicanze micro e macrovascolari. Da notare che i pazienti con
MODY 3 rispondono meglio all’effetto ipoglicemizzante delle sulfoniluree [85]. Tale effetto è
particolarmente evidente in caso di deficit di HNF-1α, perché il difetto β cellulare precede la
cascata di reazioni che inducono la secrezione insulinica dopo l’attivazione del recettore
delle sulfoniluree. La definizione delle basi genetiche che conducono all’iperglicemia può
quindi avere forti implicazioni nelle scelte terapeutiche. In termini di risposta alla terapia, i
pazienti con mutazione per il TCF2 sono più frequentemente trattati con insulina (67%)
rispetto a quelli con mutazione per la HNF-1α (31%) [46] e la maggioranza di pazienti
MODY 5 richiede un trattamento insulinico precoce, per la riduzione generalizzata della
massa β cellulare associata al deficit di TCF2. Questo sottolinea ancor di più l’importanza
nel riconoscere precocemente i differenti sottotipi di pazienti con diabete a insorgenza
precoce al fine di impiegare strategie terapeutiche individuali e migliorare la prognosi.
Altro dato emerso grazie a modelli strutturali e funzionali della GCK è che il sito di
attivazione allosterica può essere un potenziale sito d’azione dei farmaci contro il diabete di
tipo 2 [54]. Sono stati infatti studiati alcuni farmaci, denominati attivatori della GCK, in grado
di aumentare l’attività dell’enzima [86]. Il duplice sito d’azione di questi farmaci, a livello
epatico e delle cellule pancreatiche, suggerisce che queste molecole esercitino la loro
azione
nei
pazienti
affetti
da
diabete
di
tipo
2,
stimolando
la
β
cellula
e
contemporaneamente inibendo la produzione di glucosio da parte del fegato con un netto
decremento della glicemia a digiuno e un’aumentata tolleranza al glucosio. Sin dalla
scoperta di questi farmaci attivi per via orale, numerosi gruppi di ricerca hanno rivendicato
l’identificazione di nuovi e potenti attivatori della GCK [86]. Questo è un eccellente esempio
di ricerca traslazionale, in cui, partendo dallo studio della complessa regolazione della GCK,
20
si è giunti all’ identificazione di nuove classi di farmaci utili per il trattamento del T2DM.
2.6 Altre forme di diabete monogenico
Oltre ai geni MODY già identificati e precedentemente descritti, vi sono altri difetti genetici
responsabili di forme di diabete con distribuzione familiare, che presentano differenti fenotipi
e anomalie extrapancreatiche.
2.6.1 Diabete associato a disfunzioni del pancreas esocrino
Alcune famiglie con diabete, insufficienza β cellulare e alterazioni a carico del pancreas
esocrino sono state riconosciute come portatrici di delezioni a carico del gene che codifica
per la carbossil-esteril-lipasi (CEL), uno dei principali componenti del succo pancreatico,
coinvolto nell’idrolisi degli esteri del colesterolo a livello duodenale [87]. Studi di fisiologia
hanno dimostrato in questi soggetti una riduzione dell’attività enzimatica e della secrezione
della carbossil-esteril-lipasi.
2.6.2 MIDD: diabete associato a difetti del DNA mitocondriale
Il MIDD (Maternally Inherited Diabetes and Deafness) rappresenta una sindrome
caratterizzata da diabete ereditato per linea materna che si presenta con sordità
neurosensoriale seguita abitualmente nella seconda decade di vita da diabete [88]. Benchè
la descrizione originaria del MIDD identificasse il difetto genetico dovuto ad una delezione di
10.4 kb a carico del DNA mitocondriale, recenti studi hanno evidenziato un fenotipo identico
a quello descritto in una transizione A-G a carico del t-RNA, che si associa peraltro
frequentemente con la sindrome MELAS (Mitochondrial myopathy, Encephalopathy, Lactic
Acidosis and Stroke-like episodes) [88, 89]. Quest’ultima è una sindrome caratterizzata da
miopatia agenesi mitocondriale, encefalopatia, acidosi lattica, ed episodi di ictus,
frequentemente accompagnata da diabete e sordità [90]. Le differenti espressività
fenotipiche (MIDD o MELAS) potrebbero essere spiegate dalla eterogeneità delle mutazioni
mitocondriali in tessuti differenti.
21
Basandosi su studi di associazione, è stato stimato che 1,5% di casi di diabete mellito
potrebbe essere causato da mutazioni A3243G del DNA mitocondriale. Anomalie della
secrezione insulinica sono state riscontrate in tutti i soggetti con MIDD studiati, inclusi quelli
con una normale tolleranza al glucosio [61]. Un’alterata secrezione insulinica glucosio-indotta
potrebbe rappresentare il difetto primitivo e più precoce nei soggetti portatori della mutazione
[88].
Altri difetti mitocondriali associati a diabete sono correlati invece a mutazioni puntiformi,
delezioni o duplicazione del DNA mitocondriale e sono caratterizzati da una riduzione della
fosforilazione ossidativa.
2.6.3 PNDM
Il Diabete Mellito neonatale NDM (Neonatal Diabetes Mellitus) può essere definito come un
difetto della sensibilità all’insulina con conseguente iperglicemia, diagnosticato nei primi mesi
di vita.[91]. L’incidenza del NDM è di 1 soggetto su 400.000 nati. In circa la metà dei casi il
diabete è transitorio TNDM (Transient Neonatal Diabetes Mellitus) e solitamente si risolve
nel terzo mese di vita; nei casi in cui il quadro clinico perduri si parla di diabete neonatale
permanente PNDM (Permanent Neonatal Diabetes Mellitus).
La maggior parte dei casi di TNDM (70%) sono correlati ad anomalie della regione del
cromosoma 6q24 [92]. Il PNDM è stato associato a mutazioni in diversi geni. Mutazioni
dominanti in eterozigosi nei geni codificanti le due subunità del canale al potassio ATP
sensibile (KATP) della β-cellula KCNJ11 (potassium inwardly rectifying channel, sottofamiglia
J, gene 11) [93,94] e ABCC8 (ATP Binding Cassette, sottofamiglia C, gene 8) [95] e
mutazioni in omozigosi nei geni che codificano per GCK [96, 97] e per IPF1 [98] sono causa
di PNDM. Nella metà dei soggetti con PNDM sono presenti mutazioni a carico di KCNJ11 o
di ABCC8, che codificano rispettivamente le subunità Kir6.2 e SUR1. L’importanza
nell’identificare i pazienti con questo tipo di mutazioni risiede nell’efficacia della terapia con
sulfoniluree rispetto alla terapia insulinica [99]. Questi soggetti presentano una secrezione
insulinica bassa o nulla con C-peptide normalmente non dosabile [93], per cui si è sempre
22
pensato che dovessero essere trattati con terapia insulinica quoad vitam. Tuttavia, le
sulfoniluree legandosi alla subunità SUR1 del canale del potassio, chiudono tale canale in
modo indipendente dall’ATP e stimolano la secrezione di insulina. Grazie a questo
meccanismo, circa il 90% dei pazienti con mutazione del Kir6.2 possono passare
dall’insulina al trattamento ipoglicemizzante orale raggiungendo un adeguato compenso
glicemico [99, 100]. Un pattern simile è emerso anche per i soggetti con mutazione nel gene
che codifica per SUR1 [101, 102].
Alcune mutazioni di KCNJ11 o di ABCC8 possono anche causare TNDM [101, 103, 104]. Al
momento della diagnosi non è dunque possibile distinguere se il diabete nel neonato sarà
permanente o transiente. Sul piano clinico la maggioranza dei pazienti con diabete neonatale
causato dalla mutazione di Kir6.2 presenta diabete isolato, del tipo PNDM; nel 20% dei casi
si associano problemi neurologici. Talora tali alterazioni si traducono in una vera e propria
sindrome, denominata DEND, caratterizzata da ritardo nello sviluppo, epilessia e diabete
neonatale.
Nel TNDM invece i neonati possono presentare basso peso alla nascita; in un terzo dei casi
si associa macroglossia, talora ernia ombelicale.
Inoltre mutazioni nel gene KCNJ11 possono causare la sindrome HHF2 (Familial
Hyperisylinemic Hypoglicemia) anche nota come PPHI (Persistent
Hyperisylinemic
Hypoglicemia of infancy) dovuta ad un deficitario feedback negativo dei bassi livelli di
glucosio sulla secrezione insulinica
2.6.4 Sindrome di Wolfram
Questa sindrome viene anche conosciuta con il termine di DIDMOAD, acronimo per diabete
insipido, diabete mellito, atrofia ottica e sordità, le principali caratteristiche cliniche dei
pazienti affetti. E’ una patologia neurodegenerativa rara a carattere progressivo con
ereditarietà autosomico-recessiva.
Il diabete insulino-dipendente, che si presenta di solito nella prima decade di vita, e la
progressiva e bilaterale atrofia ottica sono criteri sufficienti per la diagnosi, anche se può
23
coesistere una grande varietà di anomalie a carico del sistema nervoso centrale.
Il gene WS1 è stato mappato sul cromosoma 4p16.1 attraverso la tecnica del positional
cloning. Codifica per un polipeptide di 890 amminoacidi chiamato wolframina, localizzato a
livello del reticolo endoplasmatico (ER) [105].
Il WS1 serve come canale del Calcio a livello del reticolo endoplasmatico, un ruolo
importante per l’omeostasi dell’ER. Il WS1 è normalmente attivato durante la secrezione
insulinica, mentre la sua inattivazione a livello β cellulare è causa di disfunzione secretoria.
Pertanto, l’alterazione della funzionalità della wolframina induce eventi apoptotici non
appropriati che conducono a neurodegenerazione e perdita della funzione β cellulare.
Nelle cellule dei soggetti affetti non stati riscontrati agglomerati di wolframina, suggerendo
che la patologia non è dovuta ad aggregazione di proteine quanto piuttosto a perdita di
funzione correlata a deplezione di wolframina a livello cellulare.
2.6.5 Anomalie genetiche nel diabete familiare a insorgenza tardiva
Una mutazione a carico di Islet Brain-1 (IB1), proteina omologa alla chinasi aminoterminale
c-jun, che svolge un ruolo centrale nel signaling cellulare e nei meccanismi regolatori per
l’apoptosi, è stata identificata e associata a diabete in una famiglia [106]. In vitro è stato
notato che la IB1 mutata non sarebbe in grado di prevenire l’apoptosi; pertanto una
disfunzione a carico di IB1 renderebbe la β cellula maggiormente suscettibile agli stimoli proapoptotici riducendo la massa β cellulare. IB1 è inoltre un attivatore del trasportatore di
glucosio a livello delle isole pancreatiche. Islet-1 (l’omologo pancreatico di IB-1) è uno dei
fattori di trascrizione che svolge una funzione importante durante la formazione delle isole
pancreatiche e una mutazione nonsense a carico del gene MAPK81P1, codificante per Islet1, è stata descritta in una famiglia giapponese come causa rara di diabete [107].
Kruppel-like factor 11 (KLF11) codifica per un fattore di trascrizione specifico per il pancreas
che è indotto dal TGFβ e regola la crescita cellulare nel pancreas esocrino. Sequenziando
KLF11 in famiglie con diabete di tipo 2 a insorgenza precoce sono state scoperte due
mutazioni missense associate a diabete in tre pedigree [108]. Un comune polimorfismo
24
(Q62R) è associato con diabete di tipo 2 a base poligenica e sviluppo in età adulta [108];
questo polimorfismo coinvolge la funzione di KLF11 in vitro e si associa a livelli inferiori di
insulina. Altri studi effettuati su popolazioni diverse hanno evidenziato un effetto modesto
della variante del Q62R nel rischio di sviluppare il diabete. Queste considerazioni hanno
suggerito un importante ruolo del TGFβ nel signaling cellulare nelle patologie pancreatiche
che colpiscono sia la componente endocrina (diabete) sia quella esocrina (tumori).
Una mutazione eterozigote missense del gene TGM2, localizzata nel sito attivo dell’enzima
transglutaminasi 2 (TG2), è stata identificata in una famiglia classificata clinicamente come
MODY [109]. Il TG2 è un enzima multifunzione che catalizza le reazioni di transamidazione o
si comporta come una proteina G utile per il signaling intracellulare. I topi con deficit di
questo enzima risultano essere intolleranti al glucosio e mostrano un deficit nella secrezione
insulinica, suggerendo pertanto un ruolo chiave del TG2 a livello della β cellula [109]. Altre
due nuove mutazioni a carico di TG2 sono state recentemente riportate come associate a
diabete di tipo 2 ad insorgenza precoce [110], evidenziando un ruolo del TG2 nella
fisiopatologia della malattia. In questo studio è stato notato che la TG2 è l’unica
transglutaminasi espressa in modo significativo nella β cellula umana insulino-secernente
[110]. Tali dati suggeriscono che una riduzione dell’attività del TG2 può contribuire allo
sviluppo di disordini del metabolismo del glucosio attraverso una riduzione dell’insulinosecrezione.
2.7 Nuova classificazione del diabete monogenico e criteri di inclusione per lo studio
genetico del MODY
La presenza di forme monogeniche di diabete appena descritte e nettamente distinte dal
MODY, unitamente all’estrema variabilità fenotipica dei vari sottotipi di MODY, differenti per
età di insorgenza, entità dell’iperglicemia, risposta al trattamento e manifestazioni
extrapancreatiche, hanno messo in luce l’esigenza di definire nuovi schemi per la
classificazione delle differenti forme di diabete monogenico.
I sempre più numerosi risultati in campo genetico e nella pratica clinica riguardo queste
25
forme di diabete ha inoltre permesso di definire alcuni criteri di inclusione specifici per lo
studio delle diverse forme genetiche [48].
E’ stata proposta una classificazione più ampia per il diabete monogenico basata
semplicemente sul tipo di presentazione clinica [111]:
Diabete diagnosticato prima dei 6 mesi di vita.
Diabete famigliare a insorgenza precoce che include le mutazioni a carico di HNF-1α
e HNF-4α, precedentemente analizzate.
Iperglicemia familiare moderata che comprende i soggetti con mutazione a carico
della GCK.
Diabete con manifestazioni extrapancreatiche associate. Sotto tale denominazione
sono inclusi sia i soggetti con mutazione del HNF1β sia i soggetti con MIDD (diabete
e sordità ereditati per linea materna) e Sindrome di Wolfram (Figura 2).
A
B
Retinopatia
pigmentaria
Sordità
Anomalie test di funz. epatica
Diabete, Atrofia pancreatica
Alterazioni
sviluppo
renale
Anomalie
urogenitali
Cardiomiopatia
Glomerulosclerosi
focale segmentaria
Diabete
Stipsi
Miopatia
Gotta
Figura 2: Fenotipi osservati nel diabete con alterazioni extrapancreatiche [figura modificata da:
Murphy R et al., Clinical implications of molecular genetic classification of monogenic beta cell
diabetes, Nature Clinical Practice Endocrinology and Metabolism, 2008]. (A) RCAD (Renal Cists and
Diabetes syndrome) causata dalla mutazione a livello di HNF-1β. (B) Diabete ereditato per linea
materna e sordità causati dalla mutazione a livello del DNA mitocondriale A3243G .
26
Recentemente alcuni ricercatori hanno proposto delle linee guida aventi lo scopo di
agevolare la selezione di pazienti, con determinate caratteristiche cliniche, in cui è
consigliata l’esecuzione dei test per diabete MODY: [S. Ellard & C. Bellanné-Chantelot & A.
T. Hattersley. Best practice guidelines for the molecular genetic diagnosis of maturity-onset
diabetes of the young. Diabetologia (2008) 51:546–553] I criteri clinici proposti per la ricerca
di mutazioni nei geni GCK, HNF-1α e HNF-4α sono i seguenti.
2.7.1 Analisi del gene GCK in pazienti con lieve iperglicemia a digiuno
- Iperglicemia a digiuno > 100 mg/dL, persistente in almeno 3 diverse misurazioni, e che
perdura da mesi od anni.
- HbA1c che eccede di poco i valori superiori del range di normalità, e raramente risulta >
7,5%.
- L'incremento della glicemia conseguente ad un OGTT è piuttosto lieve spesso < 54
mg/dL.
- I parenti di primo grado spesso hanno un DM2 o non sono diabetici, ma se testati
presentano una lieve iperglicemia a digiuno.
2.7.2 Analisi del gene GCK in pazienti con diabete gestazionale
Spesso la diagnosi di MODY viene realizzata in seguito ad alterazioni glicemiche riscontrate
durante la gravidanza, grazie ai test di screening per diabete gestazionale ed al
monitoraggio periodico della glicemia che queste pazienti realizzano dopo il parto. I criteri
clinici suggeriscono quando è opportuno eseguire questo tipo di test in pazienti con GDM:
- Persistente iperglicemia a digiuno compresa nel range 100-145 mg/dL (5,5-8 mmol/L)
prima, durante e dopo la gravidanza.
- Incremento della glicemia in almeno una
OGTT < 83 mg/dL (durante o dopo la
gravidanza).
- Uno dei genitori potrebbe presentare un DM di tipo 2, ma spesso questo è
misconosciuto, quindi l'assenza di familiarità nota non può escludere la diagnosi.
27
Visto che queste pazienti presentano costantemente dei valori di lieve iperglicemia a
digiuno, i neonati che non ereditano la mutazione possono diventare macrosomici. La
diagnosi della mutazione del gene della glucochinasi è molto importante per escludere, nei
bambini portatori della mutazione (che quindi avranno una lieve iperglicemia a digiuno), una
eventuale diagnosi per diabete di tipo 1.
2.7.3 Analisi del gene HNF-1α
- Storia familiare per diabete (almeno 2 generazioni)
- Esordio della patologia in giovane età solitamente prima dei 25 anni in almeno un
membro della famiglia
- Riscontro della produzione di insulina endogena al di fuori del periodo della cosiddetta
“luna di miele”, quindi dopo 3 anni dalla diagnosi
- In assenza di terapia insulinica non si verifica chetoacidosi e presentano valori testabili di
c-peptide.
- Spesso è presente glicosuria, molti pazienti mostrano una bassa soglia renale.
- Alcuni soggetti che presentano mutazioni in questo gene possono presentare livelli
glucidici normali al basale ma risultare diabetici o IGT dopo OGTT, soprattutto se i test
clinici sono eseguiti in una fase precoce.
2.7.4 Analisi del gene HNF-4α in bambini e giovani adulti con forte familiarità per diabete
Queste forme possono differenziarsi dalle forme di diabete monogenico dovute alla
mutazione del gene HNF-1α grazie ad alcune caratteristiche specifiche
- Età più tardiva alla diagnosi
- Assenza di una ridotta soglia renale per l’insorgenza della glicosuria (< 180 mg/dL).
Questo tipo di analisi genetica dovrà essere realizzata solo quando l’analisi della mutazione
del gene HNF-1α risulterà negativa, ma il sospetto clinico di diabete monogenico sarà molto
forte.
Questa particolare forma di MODY si associa frequentemente a macrosomia, con peso alla
28
nascita > 4,4 Kg. In presenza di questi quadri sarà opportuno considerare nel ventaglio delle
possibili cause, anche una mutazione del gene HNF-4α.
2.8 Significato dello screening per il diabete monogenico
Spesso, come già accennato, pazienti con diabete monogenico ricevono una diagnosi non
corretta. I soggetti con diabete neonatale o diabete diagnosticato prima dei 6 mesi di vita
non altrimenti specificato [112] vengono classificati come diabete di tipo 1; i soggetti con
diabete MODY vengono usualmente classificati come diabete di tipo 2 [113, 114].
La diagnosi corretta di diabete monogenico è importante non solo perchè aiuta a chiarire
l’eziologia alla base della patologia, ma anche per spiegare le caratteristiche cliniche
associate, inclusi gli aspetti prognostici, lo sviluppo di complicanze e la scelta del
trattamento più appropriato.
Ad esempio, alcuni pazienti non richiederanno alcun tipo di trattamento o potranno passare
da una terapia insulinica iniettiva ad un trattamento ipoglicemizzante orale con sulfoniluree
[98, 115].
La diagnosi corretta risulterà avere inoltre importanti implicazioni anche per i familiari del
soggetto affetto in quanto può fornire indicazioni utili ad una corretta diagnosi precoce e ad
un trattamento farmacologico appropriato.
29
Sottotipi clinici di
diabete
monogenico
Diabete
Familiare, lieve e
Familiare,
persistente
progressivo, ad
iperglicemia a
insorgenza
digiuno
precoce, diabete
Insorgenza alla nascita;
basso incremento della
glicemia all’OGTT tra
l’ora zero e le 2h;
complicanze rare
Insorgenza
nella’adolescenza; alto
incremento glicemico
all’OGTT tra le 0h e le
2h; complicanze
frequenti
diagnosticato
prima dei 6 mesi
Transitorio
Permanente
Test per
mutazione nel
Test per
Test di screening
Test di screening
mutazione del
per mutazione del
per mutazione del
gene KCNJ11 o
gene della
gene HNF1A e
ABCC8
glucochinasi
HNF4A
cromosoma 6q24
Transitorio
trattamento
insulinico ed
osservazione di una
recidiva
Test per
mutazione del
Nessun trattamento,
Sulfanilurea ad
alte dosi
però in gravidanza è
Sulfaniluree orali a
basse dosi
necessaria l’insulina
Glibenclamide se
manifestazioni
gene KCNJ11 o
ABCC8
neurologiche
Se negativi
considerare
mutazione gene
Figura 3. Nuovo schema classificativo del diabete monogenico
GCK
30
3. Obiettivi dello studio
Il lavoro svolto ha avuto, come obiettivo fondamentale la messa a punto e l’utilizzo di metodi
di biologia molecolare per lo studio di alcuni geni le cui mutazioni sono causa di EOD
(Early−Onset Diabetes). Durante il corso di dottorato il progetto si è articolato su linee
differenti costituendo tre distinti profili di ricerca ognuno con il seguente obiettivo principale:
- Determinare la prevalenza delle forme di MODY studiate e nelle forme non
classificabili come MODY, valutare la presenza di mutazioni nei geni KCNJ11 e
SLC30A8 tramite l’analisi dei determinanti genetici e la valutazione del contributo di
geni e loci di suscettibilità noti e non noti in una popolazione di bambini e adolescenti
sardi obesi/sovrappeso ben caratterizzati da un punto di vista metabolico e
immunologico.
- Valutazione della prevalenza di mutazioni del gene che codifica per l’enzima GCK,
responsabile della forma di diabete monogenico MODY2, in una coorte di donne con
diagnosi di GDM, aventi familiarità per diabete.
- Ricerca di mutazioni patogenetiche nel gene GCK in un piccolo gruppo di pazienti
ambulatoriali già diagnosticati come diabetici, con spiccata familiarità per diabete e
fenotipo verosimilmente sovrapponibile a quello proposto per la ricerca di mutazioni
causa di diabete MODY. In particolare la selezione è avvenuta tenendo conto delle
indicazioni proposte da recenti linee guida, riportate in precedenza, per lo studio
genetico del sottotipo MODY causato da mutazioni nel gene GCK.
31
4. Casistica
4.1 Bambini e adolescenti sovrappeso/obesi.
Per questo studio sono stati selezionati 736 (284 femmine e 251 maschi) di cui 535
sovrappeso od obesi e 201 normopeso, di età compresa tra i 4 e i 18 anni, afferenti all’unita
di Endocrinologia Pediatrica dell’Ospedale Microcitemico di Cagliari.
Tutti i soggetti reclutati sono stati sottoposti a visita clinica (peso corporeo, altezza, stadio
puberale) e sono stati raccolti i parametri metabolici (insulinemia, assetto lipidico, acido urico
etc.) sia per i bambini sovrappeso/obesi che per i controlli normopeso.
Nella coorte di bambini con alterazioni del peso corporeo è stata valutata la prevalenza delle
forme iperglicemiche tramite l’esecuzione di curva da carico orale di glucosio (OGTT
eseguita con 1,75 g kg fino ad un massimo di 75 g) in accordo con le raccomandazioni
cliniche proposte per pazienti in età pediatrica [116].
Successivamente all’esito del test, i pazienti sono stati classificati in accordo con gli ultimi
criteri diagnostici ADA in NGT (Normal Glucose Tolerance), IGT (Impaired Glucose
Tolerance), IFG (Impaired Fasting Glycemia) e affetti da DM. Con la sigla IGR (Impaired
Glucose Regulation) si definisce qualunque grado di alterazione a livello glucidico (IGT, IFG
e DM).
Per tutti i pazienti classificati come IGR, è stata eseguita la ricerca di autoanticorpi diretti
contro le β cellule pancreatiche per valutare l’eziologia delle iperglicemie. In particolare sono
stati studiati gli autoanticorpi associati al diabete di tipo 1, anti-GADA (decarbossilasi
dell’acido glutammico) anti-IA2 (tirosin-fosfatasi) e anti-IAA (insulina).
Lo studio genetico tramite sequenziamento dei geni candidati è stato effettuato su tutti i
bambini, dopo la conferma delle alterazioni glicemiche e negatività per anticorpi contro le βcellule. Nel particolare si è proceduto prima con la ricerca di mutazioni nei geni MODY
studiati e successivamente escludendo i casi diagnosticati come MODY, si è proceduto con
la ricerca di mutazioni nei geni KCNJ11 e SLC30A8.
32
4.1.1 Studi correlati
Dalla coorte originaria è stato selezionato un sottogruppo di 104 bambini
sovrappeso/obesi e un sottogruppo di controllo composto da 54 bambini normopeso.
Per tutti sono stati valutati i livelli di due tra le principali adipochine prodotte dal tessuto
adiposo: l’adiponectina e la leptina. Il loro squilibrio è uno dei meccanismi alla base
dell’obesità e dell’insulino-resistenza, nonché probabile mediatore del rischio
cardiovascolare associato ad obesità. Tra i 104 bambini selezionati, 43 sono stati
rivalutati dopo un anno dal reclutamento.
Tra i 535 bambini sono stati genotipizzati 475 per la variante I148M del gene PNPLA3
recentemente associato a steatosi epatica non alcolica (NAFLD) in adulti portatori di
questa variante allelica. Per tutti i pazienti oltre i parametri clinici e biochimici raccolti
per la popolazione generale sono stati misurati gli indici di danno epatico (ALT e AST )
e l’insulino-resistenza. L’obiettivo è stato valutare la probabile associazione tra i diversi
genotipi della variante I148M e l’aumentata suscettibilità verso danni epatici e verso le
conseguenze metaboliche in una popolazione di soggetti obesi.
4.2 Donne con diagnosi di Diabete Gestazionale
Alla luce dei risultati presenti in letteratura riguardo studi genetici sul GDM che stimano una
prevalenza del 2–5% di mutazioni di GCK nel diabete gestazionale, suggerendo una
prevalenza approssimativa del MODY 2 nella popolazione generale del 0,04-0,10% [117].
Tenendo conto di quanto espresso precedentemente riguardo le linee guida per l’analisi
genetica del gene GCK, è stata reclutata una coorte di donne con diagnosi per diabete
gestazionale. La selezione è avvenuta valutando le alterazioni glicemiche riscontrate in
gravidanza, l’assenza di importanti fattori di rischio per GDM e di nota familiarità per diabete,
tenendo conto de criteri di inclusione per lo screening del gene GCK in pazienti con diabete
gestazionale.
A tale scopo sono state selezionate 25 donne, di cui 9 con diagnosi di GDM, 16 con
33
pregresso GDM tutte sottoposte ad anamnesi (tramite l’ausilio di una scheda prestampata)
ed esame obiettivo, e precedentemente alla valutazione clinica, ad OGCT e/o OGTT
secondo le linee guida ed in base all’epoca gestazionale. Per evidenziare eventuali
mutazioni responsabili o comunque correlate al diabete gestazionale o ad altre alterazioni
del metabolismo glucidico sono state analizzate le porzioni codificanti del gene GCK nella
suddetta coorte.
4.3 Pazienti diabetici
Tra 31 pazienti afferenti agli ambulatori della SCDU Medicina Interna 3 ad Indirizzo
Metabolico di Torino, affetti da diabete diagnosticato come tipo 2, ma con caratteristiche
cliniche particolari e non del tutto definite, sono stati selezionati per l’indagine genetica nel
gene GCK 9 soggetti in collaborazione con la Prof.ssa Trovati,. La selezione è avvenuta
seguendo le linee guida proposte per il sottotipo MODY2 (mild fasting hiperglycemia) e
riportate in precedenza, nella tabella 3 sono riportate le caratteristiche fenotipiche dei
pazienti selezionati.
Nascita
(anno)
Sesso
Età di
diagnosi
BMI
Glicemia 0’
(mg/dL)
HbA1c
(%)
c-pep
(ng/mL)
GADA
(U/mL) vn≤1
Familiarità
nota
1958
M
14 aa
24,69
100
8,0
2,94
0,02
2 generazioni
1942
F
30 aa
35,15
143
6,5
4,91
0,01
2 generazioni
1987
F
15 aa
16,80
115
6,3
0,82
0,05
2 generazioni
1962
F
26 aa
34,23
130
7,9
3,50
0,01
3 generazioni
1956
F
21 aa
23,01
140
7,3
2,80
0,01
3 generazioni
1947
F
28 aa
25,79
103
8,3
2,62
0,03
3 generazioni
1952
M
28 aa
27,97
150
8,3
2,02
0,03
2 generazioni
1962
F
13 aa
26,82
122
6,3
1,40
0,01
3 generazioni
1963
M
28 aa
25,90
150
6,3
2,47
0,01
3 generazioni
Tabella 3: Caratteristiche fenotipiche sulle quali sono stati selezionati i pazienti per lo screening del
gene GCK.
34
5. Materiali e metodi
5.1 Genetica
5.1.1 Estrazione del DNA
I campioni ematici delle popolazioni in esame sono stati raccolti e conservati con EDTA
(EtilenDiamina-TetrAcetato) a –20° C per un breve periodo.
Il DNA per l’analisi genetica è stato estratto da sangue intero con il metodo del Salting-Out
[118] Questo metodo si basa sul principio della diminuzione della solubilità delle proteine e
precipitazione delle stesse ad alte concentrazioni di sale. Questa tecnica estrattiva prevede
l’isolamento delle cellule nucleate del campione dopo aver eliminato per lisi i globuli rossi. I
leucociti così isolati vengono trattati allo scopo di estrarre gli acidi nucleici e degradare le
proteine presenti, che vengono allontanate mediante precipitazioni con sali.
Protocollo Salting –Out:
1’ GIORNO
Trasferire 5 mL di sangue intero in EDTA e portare a volume 35 mL con Buffer Lysis
(Sucrose 0,32 M, TRIS HCl 10mM pH7,5, MgCl2 5mM, TRITON X-100 0,01%)
Porre in ghiaccio 10’-15’
Centrifugare a 4000 rpm, 4° C per 10’
Eliminare il surnatante e aggiungere 10 mL di Fisio Buffer (NaCl 75 mM, EDTA 25 mM)
Centrifugare a 4000 rpm, 4° C per 10’
Risospendere il pellet in 3 mL di Buffer A (TRIS HCl 10 mM, EDTA 2 mM)
Aggiungere 10 µL di SDS 10% e 250 µL di Proteinase K (20 mg/dL)
Incubare 2h in bagnetto termostatato a 65° C
Aggiungere 500 µL di NaCl saturo e vortex per 15’’
Centrifugare a 2800 rpm 4 °C per 20’
Trasferire il surnatante in una nuova falcon tube 50 mL e aggiungere un pari volume di
Cloroformio
Centrifugare a 2800 rpm 4 °C per 10’
35
Prelevare il surnatante e aggiungere un pari volume di Isopropanolo
Incubare overnight a -20° C
2’ giorno
Il DNA precipitato è rimosso con una hooked pasteur e trasferito in una provetta con 1
mL di Etanolo 70%
Centrifugare a 13000 rpm per 10’
Eliminare le tracce di etanolo per evaporazione e risospendere il DNA in 500 µL di T.E
(TRIS HCl 10mM, EDTA 1mM, pH7,6) o acqua distillata.
Dopo l’estrazione del DNA, la concentrazione dei campioni è stata valutata tramite l’utilizzo
di un fluorimetro (Q-BIT Invitrogen). La qualità del DNA è stata valutata mediante corsa
elettroforetica con un gel di agarosio allo 0,8%
5.1.2 Disegno dei primers
I primers per le reazioni di amplificazione sono stati disegnati de novo a partire dalle
sequenze presenti nelle banche dati per i geni GCK e HNF-1α utilizzando il programma
PRIMER 3 (http://www-genome.wi.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi) mentre per HNF-4α
sono stati usate sequenze di primers già riportate in letteratura. I primers, rispettano le
caratteristiche richieste per una progettazione ottimale: lunghezza da 16 a 20 bp,
temperatura di melting (TM) circa uguale per il primer forward e il primer reverse valutata
secondo la formula:
TM = 4(G+C) + 2(A+T) °C
Questo studio ha l’obiettivo di ricercare qualunque variabile genetica localizzata all’interno
delle porzioni codificanti e nelle regioni di regolazione dei geni studiati. Il metodo della PCR
tradizionale per le regioni di interesse seguito del sequenziamento diretto permettono di
ottenere l’esatta sequenza nucleotidica degli esoni che costituiscono la porzione codificante
del gene.
36
GENE
GCK
HNF-1α
HNF-4α
LOCUS CROMOSOMICO
7p13
12q24.31
20q13.12
NUM. GENE ACCESSION
NM_000162.2
NM_000545.4
NM_000457.3a
OMIM * (Gene)
138079
142410
600281
OMIM # (Phenotype)
125851
600496
1125850
Tabella 4: Referenze Genbank delle sequenze dei geni di interesse
5.1.3 Amplificazione tramite Polimerasi Chain Reaction (PCR)
Le reazioni di amplificazione per lo studio dei geni GCK, HNF-1α e HNF-4 α sono state
effettuate in un volume finale di 25 μL. Sono stati messi a punto i protocolli per le reazioni di
PCR di tutte le coppie di primers specifici ottimizzando le concentrazione di tutta la gamma
dei reagenti che compongono la mix di reazione mediante prove empiriche. Per ogni
reazione tramite PCR è stato preparato un controllo negativo (senza il DNA) per identificare
eventuali contaminazioni.
La miscela di reazione messa a punto per i geni studiati è così composta:
40-60 ng di DNA genomico in un volume di 3 μL
10 X buffer Amplitaq Gold DNA polimerasi senza MgCl2 (Applied Biosystems) 2,5 μL
MgCl2 1,5 - 2,0 μL/ 2,5 mM
dNTPs 2 μL/ 2,5 mM
Primer Forward 0,75 μL /20 μM
Primer Reverse 0,75 μL /20 μM
5 U/μlL AmpliTaq Gold DNA polimerasi (Applied Biosystems) 0,2 μL
H2O a volume
I campioni di DNA sono stati amplificati tramite la reazione PCR con l’utilizzo di un Termo
Cycler (GeneAmp 9700, Perkin Elmer, Applied Biosystem).
Dopo un’iniziale fase di denaturazione a 95°C per 10 minuti, è stato applicato un numero di
37
cicli ottimizzato per ogni gene, con una fase di denaturazione a 95°C per 30 secondi, una
fase di appaiamento per 30 secondi alla temperatura ottimale primer-specifica e una fase di
estensione a 72°C per 30 secondi. Dopo l’ultimo ciclo, tutti i prodotti di PCR sono stati
sottoposti ad una estensione finale di 7 minuti a 72°C.
Tutte le coppie di primers e le condizioni di amplificazione utilizzate in questo studio sono
riportate in Tabella 5 (a-c)
ESONE
PRIMER
SEQUENZA 5'3'
PROM F GCK
GGCAAAGGCTTAACAGGCTA
PROM R GCK
TTCTCCAGGCAGGGCCAT
Ex 1AF GCK
CTGAACCTCAAACCCCAAACC
Ex 1AR GCK
TCGCAGGACCAGAGTCCA
Ex 2F GCK
GGTGTGCAGATGCCTGGT
Ex 2R GCK
TGGCTGTGAGTCTGGGAGT
Ex 3F GCK
TTGTGCCTTCCCTCCTCCT
Ex 3R GCK
CCACCCCTGGTAGACAGGT
Ex 4F GCK
CATTCAGTGGCCAGGTGTTG
Ex 4R GCK
GAATCCAGATCTCCCTTCTGAG
Ex 5 e 6F GCK
CTGTGCAGGAGGTAGTGACA
Ex 5 e 6R GCK
AGGGCCCTTGAAGCCTGT
Ex 7F GCK
TTGTTCCAGACAAAGCAGAGAC
Ex 7R GCK
CAAGCCCATTATCTGCAATGG
Ex 8F GCK
ACCTCAGTGGGGAGCAGT
Ex 8R GCK
GTCGCCCTGAGACCAAGTC
Ex 9F GCK
CCCTCCCTGGAGAACGAGA
Ex 9R GCK
GGGGACGAGAAGAGGACTAC
Ex 10F GCK
GCGCCCGGTAATGAATGTG
Ex 10R GCK
AAGAGGCCCGCTCTGTTC
PROMOTER
ESONE 1
ESONE 2
ESONE 3
ESONI 4
ESONE 5,6
ESONI 7
ESONE 8
ESONE 9
ESONE 10
Tabella 5a: set di primers per il gene GCK
38
Condizioni PCR
MgCl2 2,0
58°C (30’’ 30’’ 30’’)X 35
MgCl2 2,0
58°C (30’’ 30’’ 30’’)X 35
MgCl2 1,5
58°C (30’’ 30’’ 30’’)X 35
MgCl2 2,0
58°C (30’’ 30’’ 30’’)X 35
MgCl2 2,0
58°C (30’’ 30’’ 30’’)X 35
MgCl2 2,0
58°C (30’’ 30’’ 30’’)X 35
MgCl2 2,0
58°C (30’’ 30’’ 30’’)X 35
MgCl2 2,0
58°C (15’’ 15’’ 30’’)X 35
MgCl2 2,0
58°C (30’’ 30’’ 30’’)X 35
MgCl2 2,0
58°C (30’’ 30’’ 30’’)X 35
ESONI
PRIMER
SEQUENZA 5'3'
Ex 1F HNF1A
CCTTCCCAGCAACTAGGCTA
Ex 1R HNF1A
GCAGTGGGTGCAAGGAGT
Ex 2F HNF1A
CCACCTATGAGTTAGGGGAGA
Ex 2R HNF1A
CCACCCTCAGGGTTGACA
Ex 3F HNF1A
CTGGACAGCCTTTTACAGGA
Ex 3R HNF1A
AGCGCCATGGCAATGAGA
Ex 4F HNF1A
TGGAACCAAACTGAAGTGCA
Ex 4R HNF1A
CTCAAACCCTCCGGCAGA
Ex 5 e 6FHNF1A
GCTCTTCCAGCTCCTGGA
Ex 5 e 6 HNF1A
AGCTGGCCTAAGCAAACCA
Ex 7F HNF1A
CCCTTTCCCCTGCATCCA
Ex 7R HNF1A
AACCACGGGCTCTGGGAA
Ex 8 e 9F HNF1A
CTAGGCCTGCTGCATGCA
Ex 8 e 9R HNF1A
CCAGTCTGGCTGTTCAGCA
Ex 10F HNF1A
TCAGAGCCCTCCCTTTCTGA
Ex 10R HNF1A
CCCCATCCTGAGTACCCCTA
ESONE 1
ESONE 2
ESONE 3
ESONE 4
ESONI 5,6
ESONE 7
ESONI 8,9
ESONE 10
CONDIZIONI PCR
MgCl2 1,5
60°C (15’’ 15’’ 30’’)X 35
MgCl2 2,0
60°C (30’’ 30’’ 30’’)X 35
MgCl2 2,0
60°C (30’’ 30’’ 30’’)X 35
MgCl2 2,0
60°C (30’’ 30’’ 30’’)X 35
MgCl2 2,0
60°C (30’’ 30’’ 30’’)X 35
MgCl2 2,0
60°C (30’’ 30’’ 30’’)X 35
MgCl2 1,5
59°C (15’’ 15’’ 30’’)X 35
MgCl2 2,0
60°C (30’’ 30’’ 30’’)X 35
Tabella 5b: set di primers per il gene HNF-1α
ESONE
PRIMER
SEQUENZA 5'3'
HNF4a-Pro1F
CAAGGATCCAGAAGATTGGC
HNF4a-Pro2R
GGTCCAGTGCAGCACTGTAG
HNF4a-P2BF
CGCCTGTATGCAACTCC
HNF4a-P2BR
CAAAGCTGACCGCAGTC
HNF4a-Pro2F
TCATGATGCCTGCCTTGTAC
HNF4A-EX1CR1
CTCTCTGAACCTAGGCCCAA
HNF4a-Ex1bF
CATGCGGACCTGTTGGAGTG
HNF4a-Ex1bR2
CACAAGATTCCAGACCTCAG
HNF4a-Ex2F
AAGGCTCCCTTAGATGCCTG
HNF4a-Ex2R
CCACTCAGGGAGAAGACAGACCT
HNF4a-Ex3F
CCTAGTTCTGTCCTAAGAGG
HNF4a-Ex3R
GTCATAAAGTGTGGCTACAG
HNF4a-Ex4TF
CTCCTCATCAGTCACAGACAC
HNF4a-Ex4TR
GCAAACTGGGCCATGTGAAAC
HNF4a-Ex5F1
ACATCTGATTCCAGGGAG
HNF4a-Ex5R
AATCAAGCCAGTCCACGGCTAT
HNF4a-Ex6F
GCCCAGCGTCACTGAGTTGGCTA
HNF4a-Ex6R
TTGCCTGGGTGAGTGCCATG
HNF4a-Ex7F
GCACCAGCTATCTTGCCAAC
HNF4a-Ex7R
AGGAGAAGTCTGGCAGAGCG
HNF4a-Ex8bF
TTGTTGAGGTCCCTGAATCCTT
HNF4a-Ex8bR
ACAGATATCCACGCATCCATACA
HNF4a-Ex9sF
GATGGCGTCCCAAGGCCTGAG
HNF4a-Ex9sR
TCCTGCCTCCTGTCTTAAGCC
HNF4a-Ex10F
CATTTACTCCCACAAAGGCT
HNF4a-Ex10R
GACCACGTGATCACCAGGTG
CONDIZIONI PCR
MgCl2 1,5 mM 59,5°C (30’’30’’30’’)X 35
PROMOTER 1
MgCl2 2,0 mM 58°C (20’’30’’1’)X 35
ALT PROMOTER 2
MgCl2 1,5 mM 59,5°C (30’’35’’40’’)X 32
ESONE 1+1C
MgCl2 2,0 mM 58°C (20’’30’’1’)X 35
ESONE 1B
MgCl2 2,0 mM 59,5°C (20’’30’’40’’)X 35
ESONE 2
MgCl2 2,0 mM 58°C (20’’30’’1’)X 35
ESONE 3
MgCl2 2,0 mM 58°C (20’’30’’1’)X 35
ESONE 4
MgCl2 2,0 mM 58°C (20’’30’’1’)X 35
ESONE 5
MgCl2 2,0 mM 58,5°C (20’’30’’40’’)X 35
ESONE 6
MgCl2 2,0 mM 59,5°C (20’’30’’40’’)X 35
ESONE 7
MgCl2 2,0 mM 58,5°C (20’’30’’40’’)X 35
ESONE 8
MgCl2 2,0 mM 58,5°C (20’’30’’40’’)X 35
ESONE 9
MgCl2 2,0 mM 58,5°C (20’’30’’40’’)X 35
ESONE 10
Tabella 5c: set di primers per il gene HNF-4α
39
5.1.4 Elettroforesi su gel di agarosio
Dopo la reazione di PCR, 5 L dei prodotti di amplificazione sono stati separati
elettroforeticamente su un gel di agarosio al 2% in TBE 1X con aggiunta di bromuro di etidio
e visualizzati mediante transilluminatore a luce UV.
DNA 100 bp LADDER
DNA MASS LADDER
500bp
400bp
300bp
200bp
100bp
Figura 4: Fotografia di una corsa elettroforetica con frammenti di DNA amplificato lunghi 458 bp. Nella
Line 1 è stato 100
seminato DNA100 bp ladder, nella Line 7 DNA Mass Ladder.(5 ng,10 ng,20ng,40ng, 60
ng,100ng)
100
100
100
100
4.1.5 Purificazione dei prodotti PCR
La purificazione dei prodotti PCR è stata eseguita per mezzo di un composto enzimatico
ExoSap-IT (Amersham Biosciences, USB Corporation). Questo reagente è costituito da una
esonucleasi e una alcalin-fosfatasi, due enzimi proteolitici che permettono di rimuovere i
dNTPs, i primers, e anche i residui di DNA single stranded dal prodotto PCR. Secondo le
istruzioni della casa produttrice, il reagente è aggiunto direttamente al prodotto amplificato.
Dopo il veloce passaggio da effettuare in ghiaccio segue un incubazione di 37 °C per 15’ e
una fase di inattivazione enzimatica a 80° C per 15’.
4.1.5. Reazione di sequenziamento ed analisi delle sequenze
Per le reazioni di sequenza è utilizzato il kit ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle
Sequencing (V1.1 o V2.1 Perkin Elmer, Applied Biosystem) ed i primers specifici di ciascun
frammento.
Le reazioni sono effettuate in un volume finale di 10 μL. La composizione finale di una
miscela di reazione è la seguente :
40
DNA
0.3 μL primer 10 μM ( reverse o forward)
3,2 μL di Mix di buffer di reazione (200 mM Tris HCl pH 8 / 5 mM MgCl2)
0,8 μL di Big Dye Terminator Mix (contenente la DNA polimerasi e i
70 ng per un frammento di media lunghezza circa 400bp (20 ng ogni
100bp)
dideossinucleotidi marcati con quattro differenti fluorocromi)
H 2O a volume
Per la reazione di sequenziamento è utilizzato il seguente programma:
96°C per 10’’
50°C per 5’’
60°C per 4’
4°C per ∞
Per 30 cicli
Le reazioni di purificazione e sequenza sono state eseguite presso il servizio di sequencing
tramite un sequenziatore ABI PRISM 3730 (Perkin Elmer, Applied Biosystems).
Per la lettura e l’elaborazione dei cromatogrammi di sequenza e sono utilizzati i programmi
BIOEDIT e blast two sequence (NCBI)
5.2 Immunologia
5.2.1 Metodi radioimmunologici (RIA) per determinazione degli autoanticorpi
La presenza di auotanticorpi circolanti anti-GAD, anti-IA2 e anti-IAA è stata misurata
mediante dosaggio radioimmunologico (RIA) su campioni di siero usando appositi kit
provvisti di marcato radioattivo (GAD-Antibody
Radioassay, Insulin-Antibody
125
I Radioassay,
IA2-Antibody
125
I
125
I Radioassay, DLD Diagnostika GMBH, Hamburg,
Germany).
Il limite di normalità per GAD e IA2 in questi test è ≤ 1 IU/mL. La metodica per la
determinazione dei GAD presenta un coefficiente di variabilità (CV) intra-assay di 3,6% e
inter-assay di 4.9%. Il metodo IA2 ha un CV intra-assay compreso tra 2,5 - 2,8% e un CV
41
inter-assay compreso tra 3,3 e 3,5%. Per quanto riguarda gli anticorpi anti insulina IAA, il
limite di normalità è ≤ 0,4 IU/mL con CV intra-assay compreso tra 3,0 – 5,8 % e un CV interassay tra 4,2 e 6,7 %.
Descrizione del metodo:
Questo metodo analitico si basa sul principio di “competizione” tra l’antigene marcato con I 125
e l’antigene non marcato (gli anticorpi presenti nel siero) ai siti di legame limitati e costanti
presenti sull’ anticorpo. La quantità di tracciante legato all’anticorpo decrescerà quindi in
maniera proporzionale all’aumento della concentrazione dell’antigene non marcato.
In un sistema di questo tipo possono essere misurate: la frazione legata all’anticorpo, la
frazione libera o entrambe. Tramite l’utilizzo di un sistema di conteggio per i CPM “colpi per
minuto” effettuato con un gamma counter collegato ad un computer è possibile elaborare la
curva standard e ricavare la quantità di antigene presente nei campioni sconosciuti.
Protocollo standard del metodo radioimmunologico usato per la determinazione degli
autoanticorpi:
Dispensare 20 µL degli standards, dei controlli e dei campioni da dosare all’interno dei
corrispondenti tubi
Pipettare 50 µL di tracciante radioattivo ricostituito (I125) in tutti i tubi compresi quelli per
la determinazione dell’attività totale del tracciante.
Mixare e incubare (l’incubazione è specifica per ogni autoanticorpo da determinare)
Dispensare 50 µL di proteina A necessaria per la precipitazione del complesso
antigene-anticorpo in tutti i tubi di reazione escluso quello per l’attività totale
Incubazione (specifica per ogni anticorpo) e aggiunta di 1mL di Buffer a 4°C
Centrifugare per 15’ a 3000 x g (4°C )
Aspirare il surnatante e leggere per 1’-2’ al gamma-counter
42
5.3. Analisi Statistica
I risultati sono stati espressi come media +/- deviazione standard (DS) laddove è stata
verificata la distribuzione normale delle variabili.
Per le variabili continue (ordinali) in caso di confronto tra medie è stato utilizzato il test t di
Student per campioni indipendenti o per dati appaiati dove applicabile. Per variabili con
distribuzione non normale (trigliceridi, HOMA_IR, etc) sono stati impiegati test nonparametric (Mann-Withney U-test) oppure sono stati analizzati con test parametrici dopo
trasformazione logaritmica. Variabili quantitative sono state confrontate con i test chi-square
o Fisher. E’ stata effettuata l’analisi di regressione logistica per stimare quali determinanti
fossero indipendentemente associati con IGR.
Sono stati assunti come significativi i risultati con valori di p < 0,05.
Le analisi sono state effettuate utilizzando il programma SPSS versione 8 per Windows
(SPSS Chicago).
43
6. Risultati
6.1 Bambini sovrappeso/obesi
6.1.1 Valutazione delle iperglicemie
All’interno della coorte originaria costituita da 535 bambini e adolescenti sovrapeso/obesi
sono risultati IGR 58 soggetti con una prevalenza di alterazioni IGR di 11,4% (61/535) dato
che 3 soggetti presentavano contemporaneamente IFG e IGT (vedi figura). La frequenza per
IFG nei 535 soggetti è risultata di 7,66% quella per IGT del 3,18% e dello 0,56% per DM.
IFG è risultato Il sottotipo IGR più rappresentato con una percentuale del 67,2% (41/61). Dei
41 bambini IFG 3 (7,3%) hanno mostrato contemporaneamente alterazioni dopo carico orale
di glucosio (IGT) rappresentando la condizione indicata come CGI (Combined Glucose
Intolerance). Sono stati classificati IGT 14 soggetti che presentavano normali valori di
glicemia a digiuno, mentre sono risultati 3 casi di diabete su 61 ovvero 4,9% (2 diagnosticati
dopo una confermata glicemia basale patologica e il terzo dopo confermata OGTT).
GRUPPO STUDIATO
n 535 SOGGETTI
100%
SOGGETTI NGR
n 477
89,15%
SOGGETTI IGR
n 58
18,85%
ALTERAZIONI
GLICEMICHE
n 61 IN 58 SOGGETTI
11,4%
SOGGETTI IFG
n 41 *
7,66%
SOGGETTI IGT
n 17 *
3,18%
SOGGETTI DM
n3
0,56%
Figura5 Numeri e prevalenza di pazienti con normali valori glicemici (NGR), con alterata glicemia
basale (IFG), con alterata tolleranza al glucosio (IGT) e con diabete mellito (DM) nella coorte studiata.
*Tre pazienti presentano contemporaneamente IFG e IGT
44
% Alterazioni Glicemiche
5%
5%
IFG
24%
IGT
CGI
DM
66%
Figura 6: Differenza nella distribuzione delle diverse forme IGR nella popolazione di 58 bambini
sovrappeso/obesi sardi.
6.1.2 Analisi Immunologica
Data la alta prevalenza del diabete autoimmune in Sardegna, è stata valutata la presenza di
anticorpi circolanti in tutti i 58 bambini classificati come IGR. Positività verso gli autoanticorpi
è stata trovata in 2 dei 3 bambini diagnosticati come diabetici, entrambi con un alto titolo
(5,48 e 37,71 IU/mL) per gli anticorpi anti–GAD (7,53 e 9,28 IU/mL) per gli anticorpi anti-IA2
ricordando che il range di normalità per la determinazione di questi anticorpi è ≤1 IU/mL Uno
dei due pazienti (quello con titolo inferiore per GAD e per IA2) ha mostrato un quadro di
completa positività verso gli autoanticorpi studiati presentando un titolo di 5,836 IU/mL per gli
anticorpi anti IAA, dove il range di normalità è di ≤0,4 IU/mL. In questi 2 casi si è quindi
potuta confermare la diagnosi di T1DM autoimmune. Escludendo i tre pazienti con diagnosi
di diabete, sono risultati positivi ad un singolo anticorpo il 3,6% (2/55) dei soggetti con una
condizione pre-diabetica: un soggetto IFG con titolo borderline di 1,78 IU/mL per GADA
mentre l’atro classificato come IGT ha mostrato titolo 2,7 IU/mL sempre per GADA (119)
45
6.1.3
Analisi Genetica : GCK, HNF1-α, HNF4-α
Tutti i bambini e adolescenti obesi, i quali hanno mostrato alterazioni glucidiche confermate
nel tempo, assenza di positività per gli autoanticorpi GAD, IA2 e IAA con o senza familiarità
nota per diabete, sono stati sottoposti a screening per mutazioni nei geni GCK causa di
MODY 2 e HNF-1α causa di MODY 3.
L’ indagine genetica è stata eseguita valutando il contributo di geni e loci di suscettibilità noti
e non noti in tutti i bambini/adolescenti in modo da ottenere un dato primitivo di prevalenza
sulle forme di diabete monogenico in Sardegna.
I test di biologia molecolare sono stati eseguiti su 45 bambini sia per il gene GCK che per
HNF-1α. Nei casi in cui è stata riferita una familiarità nota per diabete (2 bambini) si è
proceduto anche con l’esecuzione dei test genetici per il gene HNF-4α causa più rara di
MODY 1.
Lo studio del gene GCK, non ha mostrato risultati particolarmente significativi. In tabella 6
sono riportati gli SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) ritrovati nelle regioni introniche e i
polimorfismi sinonimi e non sinonimi individuati nelle regioni esoniche.
L’unica mutazione
individuata è una delezione frameshift, con slittamento del codice di
lettura, come mostrato nella figura del cromatogramma di sequenza. La mutazione trovata,
all’interno dell’esone 7, è una lunga delezione in eterozigosi di 22 paia di basi (L271fsdel22)
che con molta probabilità è responsabile del classico fenotipo riportato.
Figura 7: Cromatogramma della delezione L271fsdel22 nel gene GCK (CASO 1)
46
SNPs
Referenza
N° di portatori
Prom -30 G>A
rs 1799884
19 (di cui 2 in omozigosi)
IVS4 +87 A>C
rs 2268573
17 (di cui 5 in omozigosi)
IVS6 +38 T>C
rs 2268574
25 (di cui 12 in omozigosi)
IVS 9 +8 C>T
rs 2908274
7 (di cui 1 in omozigosi)
Tabella 6: Referenza e numero dei soggetti portatori di SNPs individuati nel gene GCK
L’indagine relativa al gene HNF-1α ha portato all’identificazione di 2 soggetti portatori di
mutazioni patogenetiche associate a MODY 3 e diversi casi di polimorfismi sia intronici che
esonici alcuni riportati in letteratura come responsabili di suscettibilità per diabete di tipo 2
come riportato in seguito. (vedi tabelle)
Le mutazioni causa di MODY 3 sono entrambe mutazioni missense con cambio di un singolo
nucleotide presenti in letteratura come causa del sottotipo MODY3. La prima G31D [120] si
trova localizzata all’interno dell’esone 1 e vede la sostituzione di una guanina con un’adenina
con conseguente cambio della tripletta da GGT (glicina) a GAT (aparagina). La seconda
mutazione, T354M [121] nell’esone 5, presenta un cambio di una treonina, amminoacido
codificato dalla tripletta ACG con una meteonina codificato dalla tripletta ATG in posizione
354 del polipeptide di riferimento.
Figura 8: Cromatogramma della mutazione missense G31D nel gene HNF-1α (CASO 2)
47
Figura 9: Cromatogramma della mutazione missense T354M (esone 5) nel gene HNF-1α (CASO 3)
Numerosi studi sono stati condotti riguardo le varianti comuni nei geni causa di MODY e un
aumentato rischio per diabete mellito tipo 2 in popolazioni costituite da soggetti normopeso e
obesi con risultati contrastanti [122, 123, 124]. Varianti comuni nel gene HNF-1α sono state
associate ad alterazioni della secrezione insulinica [124, 125]. Uno studio eseguito su una
vasta popolazione scandinava [125, 126] ha evidenziato un’ associazione tra il polimorfismo
I27L (rs1169288) e aumentato rischio per diabete tipo 2 con un HR 1,2 (95% C.I. 1,1-1,3) P=
0,0002.
Nella nostra popolazione (Figura10), sono risultati portatori del polimorfismo I27L, il 43% dei
casi (19/44) tra questi il 10,5 % presentava la mutazione in omozigosi (C/C).Tra i soggetti
portatori del polimorfismo il 63% erano IFG il 26% IGT e l’11% CGT. Nessuna differenza è
emersa tra i valori di insulinemia dei bambini che mostravano la mutazione sia in eterozigosi
che in omozigosi rispetto a quelli wild type (20 ±8,7 µU/mL vs 22 ±8,7 µU/mL).
60,0
50,0
40,0
%
A/A
30,0
A/C
C/C
20,0
10,0
0,0
genotipi
Figura 10: Distribuzione delle frequenze genotipiche, nella popolazione di bambini sovrappeso/obesi
per il polimorfismo I27L nel gene HNF-1a
48
SNP o mutazioni
Referenza
N° di portatori
Ex1 L17L
rs 1169289
17 (di cui 1 in omozigosi)
Ex1 I127L
rs 1169288
19 (di cui 2 in omozigosi)
IVS1 +91 G>A
rs 2244608
8 (di cui 1 in omozigosi)
IVS2 -23 C>T
rs 1169301
4 (di cui 1 in omozigosi)
Ex4 G288G
rs 56348580
14 (di cui 3 in omozigosi)
Ex7 L459L
rs 2259820
14 (di cui 1 in omozigosi)
Ex7 S487N
rs 2464196
19 (di cui 1 in omozigosi)
IVS7 +7 G>A
rs 2464195
16 (di cui 4 in omozigosi)
Ex8 T515T
ENS SNP6126557
12 (di cui 1 in omozigosi)
IVS8 +29 T>C
rs 1169304
22 (di cui 19 in omozigosi)
Ex 9 G574S
rs 1169305
22 (di cui 22 in omozigosi)
IVS9 -24 T>C
rs 735396
10 (di cui 2 in omozigosi)
Tabella 7: Referenza e numero dei soggetti portatori di SNPs individuati nel gene HNF1α
Per quanto riguarda il gene HNF-4α nei due casi selezionati con nota familiarità diabetica
non è stata riportata nessuna variante genetica.
A seguire sono riassunte in tabella le mutazioni patogenetiche trovate nella popolazione
studiata.
GENE
MUTAZIONI GENETICHE
GCK (MODY2)
L271fsdel22
HNF1α (MODY3)
G31D
T354M
HNF4α (MODY1)
NESSUNA VARIANTE
Tabella 8: Mutazioni genetiche nei geni studiati
49
Famiglie MODY
Come ultimo step lo studio genetico è stato allargato alle famiglie di quei soggetti in cui sono
state identificate mutazioni nucleotidiche che determinano un cambio amminoacidico della
proteina di interesse. Nella figura sottostante è riportato l’albero genealogico della famiglia 1.
Come si può notare è evidente la trasmissione verticale, autosomica dominante della
mutazione tipica delle forme di diabete monogenico. Lo studio della famiglia ha mostrato la
presenza della delezione genetica nell’esone 7, nel nonno, nella madre e nelle due sorelle
del probando, già diagnosticato come diabetico. Le due sorelle dopo analisi clinica hanno
evidenziato la forma di pre-diabete detta CGI (IFG + IGT) confermando il ruolo patologico di
questa delezione e la penetranza genetica completa.
Caso 1) Delezione nell’esone 7 del gene GCK di 22 bp
Figura 11: Albero
genealogico della famiglia 1
50
Caso 2) Mutazione missense G31D
Figura 12: Albero
genealogico della famiglia 2
Il secondo caso mostra il modello a trasmissione autosomico dominante della mutazione
G31D presente in tre generazioni come mostrato nella figura. In questa famiglia con diagnosi
per MODY 3 si evince il ruolo patologico della mutazione: la nonna presenta diabete mellito,
la madre e lo sesso probando sono classificati come IFG mentre la sorella, normopeso e con
normali livelli di glicemia basale, non ha mostrato nessuna mutazione nel gene HNF-1α,
essendoci il 50% di probabilità di possedere l’allele mutato per figli di soggetti portatori di
mutazioni autosomiche dominanti in eterozigosi.
Caso 3) Mutazione missense T354M
Figura 13: Albero
genealogico della famiglia 3
Il terzo albero genealogico mostra il modello di penetranza della mutazione T354M
localizzata nell’esone 5.
51
ll nonno presenta diabete mellito, la madre e lo sesso probando sono classificati come IFG
mentre la sorella del probando non ha presentato nessun tipo di alterazione nella
regolazione del glucosio dopo i test clinici. Data l’età del soggetto, i valori glicemici normali
non escludono lo scaturire della patologia negli anni successivi e quindi la penetranza
completa della mutazione T354M. In questo caso è auspicabile intervenire con una terapia di
prevenzione.
6.1.4 Identificazione di geni responsabili nelle forme non classificabili come MODY:
determinazione delle mutazioni nei geni SLC30A8 e KCNJ11
Nei soggetti negativi per geni MODY noti, sono stati sequenziati 2 geni coinvolti nella
secrezione insulinica, SLC30A8 e KCNJ11:
1. SLC30A8 (ZnT-8): un recente studio genetico di associazione svolto allo scopo di
identificare nuovi loci di rischio per il T2DM ha identificato un SNP non sinonimo
(R325W, rs13266634) nel gene SLC30A8 localizzato in una regione di 33-kb in
linkage disequilibrium sul cromosoma 8 [127]. Il gene SLC30A8 codifica per uno
zinco-trasportatore espresso unicamente nelle vescicole secretorie delle β cellule.
Nelle cellule pancreatiche umane, la sovraespressione di ZnT-8 stimola l’accumulo di
zinco ed aumenta la secrezione insulinica glucosio-indotta [128].
Dalla popolazione originaria un totale di 50 bambini e adolescenti di cui 25
normoglicemici (92 ± 5) e 25 iperglicemici (106 ± 6) sono stati selezionati per lo studio
della variante rs13266634 T>C del gene SLC30A8. I dati, ancora preliminari, non
evidenziano nessuna differenza statisticamente significativa nelle frequenze alleliche
tra controlli (C carriers, 66%) e iperglicemici (C carriers 85 %).
2. KCNJ11: (potassium inward-rectifier 6.2, Kir6.2) KCNJ11 Come già riportato nella
parte sulla classificazione del diabete monogenico PNDM, il gene KCNJ11 codifica
per uno dei componenti del canale del potassio della β cellula ed è un elemento
essenziale per la normale secrezione insulinica stimolata dal glucosio [129].
52
Numerosi, studi precedenti hanno evidenziato che la variante E23K (sostituzione
G>A) è associata a diabete di tipo 2. In particolare l’omozigosità per l’allele A (K/K) è
significativamente più frequente nei soggetti diabetici [130]. Studi di meta-analisi
confermano questo dato [131].
L’analisi genetica è stata effettuata su tutti i pazienti risultati negativi per lo studio dei
geni MODY.
Sono stati individuati 5 SNPs noti E23K (rs5219 A>G), A190A (rs5218 C>T), L270V
(rs1800467 C>G) I337V (rs5215 G>A) K381K (rs8175351 G>A) Non è stata
osservata nessuna differenza significativa nelle frequenze genotipiche e alleliche dei
diversi
SNPs.
L’analisi
della
variante
E23K
del
gene
KCNJ11
è
stata
successivamente studiata in una popolazione di controllo costituita da bambini con
normali livelli glicemici.
Il 26,7% dei bambini/adolescenti IGR contro il 19,2% del gruppo senza alterazioni
della glicemia è risultato portatore del genotipo A/A E23K del gene (p=NS). Il
genotipo A/G è equamente distribuito fra i due gruppi (41,5% in entrambi), mentre il
genotipo G/G prevale tra i bambini NGR (39,2% vs 31,1% dei bambini IGR). I
portatori del genotipo A/A sono iperinsulino secernenti rispetto ai portatori del
genotipo A/G o G/G in particolare: genotipo A/A: HOMA-B% medio: 299,11; genotipo
A/G G/G: HOMA-B% medio 249,26 (p<0,04). Questi dati preliminari suggeriscono
che la variante E23K del gene KCNJ11 potrebbe essere associata ad una alterata
glicemia in soggetti obesi sardi pur non raggiungendo la significatività. Studi su una
popolazione più numerosa sono in corso per confermare questo dato. Risulta invece
significativa l’associazione tra il genotipo A/A della variante E23K e la secrezione
insulinica, suggerendo in possibile ruolo nell’alterazione della sintesi insulinica nei
portatori.
53
6.1.5 Studi correlati
Per quanto riguarda le due adipochine prese in esame, nella sottopopolazione studiata
(104 bambini e adolescenti sovrappeso/obesi e 54 controlli normopeso), i livelli di
adiponectina sono risultati 3 volte più alti nel gruppo dei normopeso rispetto ai valori
riportati per il gruppo dei bambini sovrappeso/obesi (5,7 ± 3,7 µg/mL vs 18,2 ± 8 µg/mL)
così come la leptina che risultava essere significativamente più alta nei bambini
sovrappeso/obesi rispetto al gruppo di controllo (19,7 ± 14,1 ng/mL vs 6,8 ± 7,1 ng/mL).
Tra i 104 bambini selezionati, 48 (47,5%) si sono ripresentati dopo un anno per un
follow-up. Durante il periodo trascorso, la quasi totalità dei soggetti aveva apportato
alcuni cambiamenti nello stile di vita (dieta, attività fisica) anche se solo alcuni
mostravano significativi cambiamenti di peso. Al follow-up, il cambiamento più
significativo si è osservato nella concentrazione di adiponectina che ha mostrato un
incremento del 245% (p<0,0001) pari ai livelli osservati nei bambini di peso normale. I
livelli di leptina invece non hanno dimostrato cambiamenti associati a risultati metabolici
positivi, rimanendo comunque ad alti livelli al follow-up. A distanza di un anno,
indipendentemente dalla perdita di peso, nei bambini che avevano apportato delle
migliorie riguardo lo stile di vita, i valori di HOMA-IR e adiponectinemia associati alla
percentuale di massa grassa, hanno mostrato significativi miglioramenti rispetto ai valori
basali. Gli interessanti risultati ottenuti mostrano come i livelli di adiponectina circolante,
potrebbero rappresentare un buon biomaker per valutare l’efficacia di cambiamenti sullo
stile di vita nei bambini obesi/sovrappeso [132].
L’obesità infantile è un problema sempre più diffuso in diverse regioni del mondo e
proporzionalmente a tale incremento anche la steatosi epatica non alcolica (NAFLD,
spesso associata ad obesità ed insulino resistenza, si riscontra sempre più
frequentemente nei bambini. La variante I148M del gene PNPLA3 è stata recentemente
associata ad un aumento di NAFLD ed alanina amminotransferasi (ALT). Nella
popolazione studiata le transaminasi, markers di danno epatico, sono risultate
significativamente più alte nei portatori di due alleli I148M: circa 52% per ALT (P=0,001)
54
e circa 17,4% per AST (P=0,022) indipendentemente da età, sesso e BMI. Inoltre la
prevalenza di steatosi epatica all’ecografia è risultata molto più alta negli omozigoti mutati
(33%) rispetto agli omozigoti wild-type (13%). Le variazioni tra i tre genotipi nella
tolleranza glucidica e resistenza insulinica non sono invece risultate significative
confermando che la variante non sinonima I148M si associa ad un aumento dei markers
di danno epatico suggerendo un ruolo importante nella suscettibilità genetica a
sviluppare epatopatie anche in bambini e adolescenti obesi [133]
6.2 Donne con diagnosi di diabete gestazionale
L’analisi genetica è stata eseguita su 25 donne di cui 9 con diagnosi di GDM e 16 con
pregresso GDM, tutte con familiarità diabetica ed età di diagnosi inferiore ai 33 anni e con
livelli di glicemia basale compresi in un range che andava da 60 mg/dL a 110 mg/dL con un
valore medio di 84,6 ± 12,2 mg/dL. Per le pazienti che hanno effettuato OGTT (20/25)
incremento medio alla seconda ora è stato di 70,2 ± 36,7 mg/dL.
L’ indagine genetica ha portato all’ individuazione di alcuni SNPs noti del gene GCK ritrovati
anche nelle altre popolazioni studiate. Nessuna mutazione nel gene GCK associata ad
alterazioni dei livelli glucidici è stata trovata nella popolazione investigata. Tutti gli SNPs
sono riportati in letteratura e tutti sono situati nelle regioni non codificanti del gene: -30 G>A
(rs1799884), -84C>G (rs 13306391),
IVS4 +87 A>C (rs 2268573),
IVS6 +38 T>C (rs
2268574), IVS9 +8 C>T (rs 2908274), IVS9 +49 G>A (rs 13306387).
I risultati ritrovati nella nostra popolazione e riportati nella tabella 9 mostrano come le
varianti introniche IVS4 +87 A>C e IVS6 +38 T>C siano presenti nella maggior parte delle
pazienti sottoposte a screening con una percentuale dell’ 80% (20/25) per entrambe le
varianti. I portatori del polimorfismo nell’introne 4 in eterozigosi rispetto alla popolazione
totale sono il 52%, quelli in omozigosi sono il 28% Le frequenze alleliche per questo SNPs
sono risultate del 46% per l’allele wild type A e del 54% per l’allele mutato C. Per IVS6 +38 la
percentuale è risultata del 56% per gli eterozigoti e del 24% per gli omozigoti sulla
55
popolazione totale (frequenze alleliche: 52% per l’allele T e 48% per l’allele C). Le frequenze
riportate per questi due SNPs nella coorte studiata, sono molto simili a quelle riportate nella
popolazione europea. Per il polimorfismo IVS4 +87 A>C le frequenze riportate sono: A/A
0,224, A/C 0,466, C/C 0,310 (ss5724382). Per IVS6 +38 T>C le frequenze sono C/C 0,305,
C/T 0,475, T/T 0,220 (ss52074383). E’ interessante notare come delle 7 pazienti con
mutazione in omozigosi per IVS 4, 6 fossero portatrici della variante in omozigosi anche per
l’altro SNPs nell’introne 6, mentre 4 pazienti su 25 erano wild type per entrambe le varianti
riportate, come a mostrare l’esistenza di un associazione allelica, in grado di determinare
aplotipi differenti e ben caratterizzanti.
56
PROM -30
PROM -84
INT4
INT6
INT9
1
WT
WT
IVS4+87°>C (A/C)
WT
WT
2
WT
WT
IVS4+87°>C (A/C)
IVS6+38T>C (T/C)
WT
3
-30G>A (G/A)
WT
IVS4+87°>C (A/C)
IVS6+38T>C (T/C)
WT
4
-30G>A (G/A)
WT
IVS4+87°>C (A/C)
IVS6+38T>C (T/C)
WT
5
WT
WT
WT
WT
WT
6
WT
WT
IVS4+87°>C (C/C)
IVS6+38T>C (T/C)
IVS9+8 C>T(T/C)
7
WT
WT
IVS4+87°>C (A/C)
IVS6+38T>C (T/C)
WT
8
WT
-84 C>G (C/G)
IVS4+87°>C (A/C)
IVS6+38T>C (T/C)
WT
9
WT
WT
IVS4+87°>C (A/C)
IVS6+38T>C (T/C)
IVS9+49 G>A(G/A)
10
-30G>A (G/A)
WT
IVS4+87°>C (C/C)
IVS6+38T>C (C/C)
IVS9+8 C>T(T/C)
11
WT
WT
WT
WT
WT
12
WT
WT
IVS4+87°>C (A/C)
IVS6+38T>C (T/C)
WT
13
WT
WT
WT
WT
WT
14
-30G>A (A/A)
-84 C>G (C/G)
IVS4+87°>C (C/C)
IVS6+38T>C (C/C)
WT
15
WT
-84 C>G (C/G)
WT
IVS6+38T>C (T/C)
WT
16
-30G>A (A/A)
-84 C>G (C/G)
IVS4+87°>C (C/C)
IVS6+38T>C (C/C)
IVS9+8 C>T(T/C)
17
-30G>A (G/A)
WT
IVS4+87°>C (A/C)
IVS6+38T>C (T/C)
IVS9+8 C>T(T/C)
18
WT
WT
IVS4+87°>C (A/C)
IVS6+38T>C (T/C)
WT
19
WT
WT
IVS4+87°>C (C/C)
IVS6+38T>C (C/C)
WT
20
WT
WT
IVS4+87°>C (A/C)
IVS6+38T>C (T/C)
WT
21
-30G>A (A/A)
-84 C>G
IVS4+87°>C (A/C)
IVS6+38T>C (T/C)
WT
22
-30G>A (A/A)
-84 C>G
IVS4+87°>C (C/C)
IVS6+38T>C (C/C)
IVS9+8 C>T(T/C)
23
WT
-84 C>G
IVS4+87°>C (A/C)
IVS6+38T>C (T/C)
WT
24
WT
WT
WT
WT
WT
25
-30G>A (G/A)
-84 C>G
IVS4+87°>C (C/C)
IVS6+38T>C (C/C)
IVS9+8 C>T(T/C)
Tabella9: SNPs nel gene GCK in 25 pazienti con diagnosi per diabete gestazionale. In rosso sono
riportati gli SNPs in omozigosi. (WT:wild type)
Tra tutti gli SNPs di particolare interesse è la variante nella regione del promoter -30 G>A
(rs1799884) Il suo sito è all’interno di un lungo frammento di 26 bp altamente conservato che
suggerisce la grande importanza di questa regione nucleotidica da un punto di vista
strutturale e/o funzionale.
57
Nella popolazione da noi presa in esame la variante è stata trovata nel 36% (9/25) dei casi
riportati, tra questi il 44% (4/9) presentava la variante in omozigosi A/A e tra questi 3
presentavano anche gli altri due SNPs in omozigosi (IVS4+87 e IVS6 +38).
Il polimorfismo -30 G>A è stato associato ad un maggiore rischio per diabete di tipo 2 [134],
in alcuni lavori è riportata una correlazione con un aumentato rischio di GDM specialmente
per le varianti in omozigosi (A/A) [135]. La frequenza allelica della forma wild type G nella
nostra popolazione è risultata del 74% mentre per A del 26%. Le frequenze genotipiche sono
risultate per G/G 64%, A/G 20%, A/A 16% che potrebbero confermare questo tipo ti tesi. E’
necessario però esaminare un gruppo di controllo per valutare la reale associazione tra
questo polimorfismo ed il GDM.
c
b
a
↑
↑
↑
Figura 14: Cromatogramma del polimorfismo -30 G>A nel promotore del gene GCK. a polimorfismo
in eterozigosi (A/G) b sequenza wilde tipe (G/G) c polimorfismo in omozigosi (A/A)
6.3 Pazienti diabetici
Dei nove soggetti selezionati per le loro caratteristiche fenotipiche 3 pazienti (33% della
popolazione in esame) sono risultati portatori di mutazioni nel gene che codifica per la
glucochinasi. Il primo soggetto (t5, vedi tabella) ha riportato mutazione missense H50R a
livello dell’esone 2 con cambio di un singolo nucleotide e conseguente sostituzione della
tripletta CAT (istidina) con CGT (arginina). Questa mutazione presente in letteratura è stata
riportata anche in studi su soggetti italiani [136].
58
Figura 15: Cromatogramma della mutazione missense H50R nel gene GCK [Massa et all., 2001]
Per il secondo paziente (t3) è stata individuata una mutazione puntiforme localizzata nella
porzione dell’esone 7, con sostituzione di una guanina con un’adenina e conseguente
cambio dell’amminoacido corrispondente da metionina (ATG) ad isoleucina (ATA)
in
posizione M235I della proteina, questa mutazione non è mai stata descritta con questo
particolare cambio amminoacidico. Sono riportate in letteratura, nella stessa posizione altre
sostituzioni M235T [54] e M235V [137] responsabili di una parziale inattivazione del sito
catalitico della glucochinasi con un indice di riduzione dell’attività dell’enzima di circa il 50% e
di un effetto sulla stabilità della proteina al calore [137]. La presenza di differenti varianti
localizzate nello stesso sito, rendono questa porzione di DNA una zona “calda” del gene
GCK.
Figura 16: Cromatogramma della mutazione missense M235I nel gene GCK
Come ultimo caso (t9) è stata individuata una mutazione frameshift, con slittamento della
cornice di lettura, nell’esone 9 denominata c.1079-1080insCCTC. Si tratta di un’inserzione di
4 paia di basi -CCTC- localizzata tra il nucleotide 1079 e 1080 del cDNA.
59
Figura 17: Cromatogramma della mutazione frameschift nel gene GCK c. 1079-1080insCCTC
La tabella 10 illustra le caratteristiche cliniche dei pazienti reclutati per lo screening genetico.
Tutti i pazienti diagnosticati come MODY 2 a seguito dell’indagine genetica presentano buon
compenso (HbA1c <7.0%) e trattamento con sola dieta o metformina a basso dosaggio.
I valori di C-peptide depongono per una funzione β cellulare conservata; nel paziente t5 il
valore basso di C-peptide è giustificato dall’importante sottopeso (BMI=16.8 kg/m2). Nessuno
dei 3 pazienti presenta complicanze extrapancreatiche.
Glicemia 0’
HbA1c
c-pep
GADA
(mg/dL)
(%)
(ng/mL)
(U/mL) vn≤1
Familiarità
nota
24,69
100
8,0
2,94
0,02
2 generaz
30 aa
35,15
143
6,5
4,91
0,01
2 generaz
F
15 aa
16,80
115
6,3
0,82
0,05
2 generaz
1962
F
26 aa
34,23
130
7,9
3,50
0,01
3 generaz
t5
1956
F
21 aa
23,01
140
7,3
2,80
0,01
3 generaz
t6
1947
F
28 aa
25,79
103
8,3
2,62
0,03
3 generaz
t7
1952
M
28 aa
27,97
150
8,3
2,02
0,03
2 generaz
t8
1962
F
13 aa
26,82
122
6,3
1,40
0,01
3 generaz
t9
1963
M
28 aa
25,90
150
6,3
2,47
0,01
3 generaz
ID
Anno di
nascita
Sesso
Età di
diagnosi
BMI
t1
1958
M
14 aa
t2
1942
F
t3
1987
t4
Tabella 10: Caratteristiche fenotipiche dei soggetti selezionati per lo screening del gene GCK. Sono
evidenziati i soggetti diagnosticati come MODY2.
60
7. Conclusioni
7.1 Bambini obesi sovrappeso
Data l’elevata prevalenza di diabete autoimmune in Sardegna [138] è stata controllata la
presenza di autoanticorpi anti GAD anti IA2 e anti IAA nei soggetti risultati IGR dopo OGTT.
I nostri risultati hanno mostrato che 2 dei 3 pazienti diagnosticati come diabetici erano affetti
dalla forma autoimmune di diabete di tipo 1, evidenziando che questa condizione può essere
associata ad un fenotipo sovrappeso/obeso. Questo dato concorda con uno studio condotto
in Germania su una popolazione di bambini con T2DM dove è stata riportata un’alta
prevalenza di positività verso almeno uno degli autoanticorpi diretti contro le β cellule
pancreatiche [139]. I risultati da noi ottenuti sono invece differenti da quelli riportati da
Wabitsch [140] e collaboratori i quali su una coorte di 35 soggetti IGR non hanno individuato
neanche un caso di positività verso gli autoanticorpi. Altri studi condotti su popolazioni di
bambini IGR sovrappeso/obesi [141,142,143] non hanno valutato la presenza di
autoanticorpi. La prevalenza di positività verso gli autoanticorpi diretti verso le cellule
pancreatiche trovati nella popolazione esaminata sottolineano l’importanza del diabete
autoimmune in Sardegna. Nei bambini da noi studiati, risultati dopo il test da carico orale di
glucosio affetti da minori alterazioni glucidiche (IFG, IGT e non DM) la prevalenza di
autoimmunità è risultata del 3,6%, percentuale più alta rispetto a quella riportata in studi
precedenti dove GADA e IA2 erano presenti nel 1-2% dei casi di bambini in età scolare
facenti parte di una popolazione generale [144] In ogni modo, in bambini con iperglicemia
incidentale, è stata riportata una frequenza più alta di marcatori immunologici per diabete di
tipo 1 rispetto alla frequenza riportata per soggetti con normale regolazione glucidica [145].
7.1.1 Assetto genetico della popolazione sarda
La popolazione sarda è, in campo genetico, una popolazione d’elezione per lo studio di
alcune patologie familiari grazie alla peculiarità di rappresentare un isolato genetico. La
specificità biologica di questa popolazione nel contesto delle popolazioni europee e circummediterranee, nonché la sua eterogeneità interna troverebbe supporto nella probabile azione
61
di diversi fattori microevolutivi che hanno agito nel tempo (effetto del fondatore, effetto a collo
di bottiglia, isolamento e flussi genetici interni). Sostengono questa ipotesi studi svolti sul
cromosoma Y che rispetto alle altre popolazioni dell’Europa continentale e dell’area
mediterranea, evidenziano la possibile conseguenza del distacco della popolazione sarda
dalla popolazione ancestrale continentale dopo Last Glacial Maximum [146,147,148].
Studio Genetico
In Sardegna dati certi di prevalenza e di incidenza riguardo le forme di diabete monogenico
MODY non sono disponibili. Nel passato, grazie al lavoro dei gruppi della dott.ssa Frongia in
collaborazione con il Prof Barbetti [149] e del Prof Maioli [150] sono state diagnosticate
diverse famiglie MODY.
Quanto brevemente esposto sopra, riguardo le caratteristiche genetiche della popolazione
sarda, in associazione con l’elevata prevalenza di diabete autoimmune in Sardegna hanno
stimolato maggiormente l’interesse per lo studio di geni causa di diabete monogenico MODY
in questa popolazione.
Nella coorte costituita da bambini sardi sovrappeso/obesi forme di diabete monogenico sono
state individuate nel 6,12 % dei casi, mostrando che il MODY può essere presente in
bambini con fenotipo sovrappeso/obesi IGR anche in assenza di una nota storia familiare.
Nei casi riportati in questo studio la familiarità è stata identificata grazie allo studio
metabolico e genetico eseguito successivamente sui familiari dei soggetti portatori di
mutazioni patogenetiche.
Inoltre per quanto riguarda i dati riportati in questo studio è strato mostrato che non ci sono
sostanziali differenze tra la popolazione sarda e le altre popolazioni riguardo la prevalenza
del diabete monogenico MODY, sottotipi (2 e 3) come invece riportato per altre patologie di
origine genetica. Ulteriori ricerche nei bambini obesi e ovviamente normopeso saranno utili
per rendere più chiara la prevalenza di MODY nei soggetti con IGR/DM nella popolazione
sarda.
62
7.2 Donne con diagnosi di diabete gestazionale
Nella popolazione da noi esaminata non sono state ritrovate mutazioni patogenetiche nel
gene GCK. Nonostante siano state utilizzate le linee guida proposte per lo screening in
pazienti con GDM, i risultati ottenuti si sono rivelati contrastanti rispetto a quelli riportati in
letteratura, condotti principalmente su popolazioni del nord Europa [134-135] Vi e’ la
possibilità che le differenze riportate possano essere riferibili ad un diverso assetto genetico
delle popolazioni; trattandosi di uno studio condotto su una popolazione costituita
interamente da donne sarde è interessante considerare che fattori microevolutivi potrebbero
avere avuto un ruolo determinante nella fissazione genetica di particolari varianti.
Ha suscitato particolare interesse la variante nella regione del promoter -30 G>A
(rs1799884). Studi precedenti, condotti su diverse popolazioni, hanno evidenziato
l’associazione tra la variante -30 G>A e alterazioni nella regolazione dei carboidrati,
evidenziando una modesta correlazione tra l’allele A e il rischio di GDM, secondo un modello
a trasmissione autosomica recessiva. Tra questi uno studio scandinavo [135] condotto su
una vasta popolazione di donne con GDM e una popolazione di controllo ha evidenziato una
correlazione tra l’allele A e il rischio di GDM, (OR 1,28 -95% CI 1,06-1,53 p=0,008 valore
corretto p=0,032) correlazione che aumenta ulteriormente sotto un modello recessivo (A/A vs
G/A+G/G) (OR 2,12 [95% CI 1,21-3,7] p=0,009). Le frequenze genotipiche riportate nella
nostra popolazione (G/G 64%, A/G 20%, A/A 16%) sembrano confermare il possibile ruolo
patogenetico con modello a trasmissione autosomica recessiva proposto per questa
variante.
Gli altri 5 SNPs riportati nella popolazione studiata, sono situati nelle regioni non codificanti
del gene, per cui non hanno un reale significato patogenetico ma possono essere
interessanti da un punto di vista della genetica di popolazione (trattandosi di una popolazione
costituita interamente da donne di origine sarda). Come espresso in precedenza, la
popolazione sarda mostra rispetto al pool genetico europeo delle differenze sostanziali
dovute prevalentemente alle differenze in termini di frequenze geniche e alleliche per lo più
dovute alla fissazione di alleli rari. Nella nostra popolazione la frequenza per i polimorfismi
63
IVS4 e IVS6 è risultata del 80% per entrambe le varianti mostrando che per quanto riguarda
questi SNPs non esistono differenze sostanziali tra le frequenze alleliche della popolazione
sarda e quelle riportate per la popolazione europea generale.
7.3 Pazienti diabetici
In questo studio, il 33% dei soggetti selezionati in base alle indicazioni dettate dalle più
recenti linee-guida [48], ha mostrato una mutazione nella regione esonica del gene GCK
associata a MODY 2.
Questo risultato evidenzia l’utilità dei criteri di inclusione per i test genetici, nella selezione di
soggetti con presunto diabete monogenico. Ovviamente per valutare l’effettivo ruolo
patogenetico e la penetranza genetica di queste mutazioni (soprattutto quelle non riportate in
letteratura) sarà necessario effettuare ulteriori studi sia genetici che metabolici nei familiari
dei pazienti risultati positivi allo screening.
A tutt’oggi, i test di biologia molecolare sono piuttosto costosi per cui è necessario
selezionare con un accurata anamnesi i pazienti da sottoporre ad analisi genetica.
Sicuramente lo sviluppo di nuove tecnologie porterà alla diminuzione dei costi e dei tempi di
esecuzione dei test e le analisi dei geni associati a diabete monogenico potrebbero in futuro
diventare test di rutine per pazienti neo diagnosticati.
64
8. Bibliografia
1. Steinbrook R: Facing the diabetes epidemic - mandatory reporting of glycosylated
hemoglobing values in New York City. N Engl J Med 354:545-548, 2006.
2. Yach D, Stuckler D, Brownell KD: Epidemiologic and economic consequences of the
global epidemics of obesity and diabetes. Nat Med 12:62-66, 2006.
3. Alberti KG, Zimmet PZ: Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its
complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a
WHO consultation. Diabet Med 15:539-553, 1998.
4. Diagnosis and classification of diabetes mellitus. Diabetes Care 29(1):S43-48, 2006.
5. Kahn SE: The relative contributions of insulin resistance and beta-cell dysfunction to the
pathophysiology of Tipe 2 diabetes. Diabetologia 46:3-19, 2003
6. Atkinson MA, Eisenbarth GS: Tipe 1 diabetes: new perpectives on desease pathogenesis
and treatment. Lancet 358:221-229, 2001
7. McCulloch DK, Palmer JP: The appropriate use of B-cell function testing in the preclinical
period of type 1 diabetes. Diabet Med 8:800-804, 1991
8. Bonner-Weir S, Trent DF, Weir GC: Partial pancreatectomy in the rat and subsequent
defect in glucose- induced insulin release J.Clin Invest 71:1544-1553, 1983
9. McCulloch DK, Koerker DJ, Kahn SE, Bonner-Weir S, Palmer JP: Correlations of in vivo
beta-cell function tests with bête-cell mass and pancreatic insulin content in streptozocinadministrated baboons. Diabetes 40:673-679, 1991
65
10. Clark A, Wells CA, Buley ID, Cruickshank JK, Vanhegan RI, Matthews DR, Cooper GJ,
Holman RR, Turner RC: Islet amyloid, increased A-cells, reduced B-cells and exocrine
fibrosis: quantitative changes in the pancreas in type 2 diabetes. Dyabetes res 9:151-159,
1988
11. Wang F, Herrington M, Larsson J, Permert J: The relationship between diabetes and
pancreatic cancer. Mol cancer 2:4, 2003
12. Clark A, Jones LC, de Koning E, Hansen BC, Matthews DR: Decreased insulin secretion
in type 2 diabetes: a problem of cellular mass or function? Diabetes 50(1):S169-171, 2001
13. Imagawa A, Hanafusa T, Miyagawa J, Matsuzawa Y: A novel subtype of type 1 diabetes
mellitus characterized by a rapid onset and an absence of diabetes-related antibodies.
Osaka IDDM Study Group. N Engl J Med 342:301-307, 2000
14. Undlien DE. Lie BA, Thorsby E: HLA complex genes in type 1 diabetes and other
autoimmune diseases. Which genes are involved? Trends Genet 17:93-100, 2001
15. Lucassen AM, Julier C, Beressi JP, Boitard C, Froguel P,Lathrop M, Bell JI: Susceptibility
to insulin dependent diabetes mellitus maps to a 4.1 kb segment of DNA spanning the insulin
gene and associated VNTR. Nat Genet 4:305-310, 1993
16. Marron MP, Raffel LJ, Garchon HJ, Jacob CO, Serrano-Rios M, Martinez Larrad MT,
Teng WP, Park Y, Zhang ZX, Goldstein DR, Tao YW, Beaurain G, Bach JF, Huang HS, Luo
DF, Zeidler A, Rotter JI, Yang MC, Modilevsky T, Maclaren NK, She JX: Insulin-dependent
diabetes mellitus (IDDM) is associated with CTLA4 polymorphhisms in multiple ethnic
groups. Hum Mol Genet 6:1275-1282,1997
66
17. Bottini N, Musumeci L, Alonso A, Rahmouni S, Nika K, Rostamkhani M, MacMurray J,
Meloni GF, Lucarelli P, Pellecchia M, Eisenbarth GS, Comings D, Mustelin T: A functional
variant of lymphoid tyrosine phosphatise is associated with type I diabetes. Nat Genet
36:337-338, 2004
18. Vella A, Cooper JD, Lowe CE, Walker N, Nutland S, Widmer B, Jones R,Ring SM,
McArdle W, Pembrey ME, Strachan DP, Dunger DB, Twells RC, Clayton DG, Todd JA:
Localization of a type 1 diabetes locus in the IL2RA/CD25 region by use of tag singlenucleotide polymorphisms. Am J Hum Genet 76:773-779, 2005
19. Smith DJ, Cooper JD, Bailey R, Field S, Burren O, Smink LJ, Guja C, Ionescu-Tirgoviste
C, Widmer B, Dunger DB, Savage DA, Walker NM, Clayton DG, Todd JA: A genome-wide
association study of nonsynonymous SNPs identifies a type 1 diabetes locus in the
interferon-induced helicase (IFIH1) region. Nat Genet 38:617-619, 2006
20. Allotey RA, Mohan V, McDermott MF, Deepa R, Premalatha G, Hassan Z, Cassel PG,
North BV, Vaxillaire M, Mein CA, Swan DC, O’Grady E, Ramachandran A, Snehalatha C,
Sinnot PJ, Hemmatpour SK, Froguel P, Hitman GA: The EIF2AK3 gene region and type I
diabetes in subjects from South India. Genes Immun 5:648-652, 2004
21. Knip M: Enviromental triggers and determinant of beta-cell autoimmunity and type 1
diabetes. Rev Endocr Metab Disord 4:213-223, 2003
22. Lebovitz HE: Type 2 diabetes: an overview. Clin Chem 45:1339-1345, 1999
23. Stumvoll M, Goldstein BJ, van Haeften TW: Type 2 diabetes: principles of pathogenesis
and therapy. Lancet 365:1333-1346, 2005
24. Hansen L, Pedersen O: Genetics of type 2 diabetes mellitus: status and perspectives.
Diabetes Obes Metab 7:122-135, 2005
67
25. Florez JC, Hirschhorn J, Altshuler D: The inherited basis of diabetes mellitus: implications
for the genetic analysis of complex traits. Annu Rev Genomics Hum Genet 4:257-291, 2003
26.Stumvoll M, Fritsche A, Volk A, Stefan N, Madaus A, Maerker E, Teigeler A, Koch M,
Machicao F, Haring H: The Gly972Arg polymorphism in the insulin receptor substrate-1 gene
contributes to the variation in insulin secretion in normal glucose-tolerant humans. Diabetes
50:882-885, 2001
27. Hara K, Boutin P, Mori Y, Tobe K, Dina C,Yasuda K, Yamauchi T, Otabe S, Okada T ,
Kazuhiro Eto K, Kadowaki H, Hagura R, Akanuma Y, Yazaki Y, Nagai R, Taniyama M,
Matsubara K,
Yoda M, Nakano Y, Kimura S, Tomita M, Kimura S, Ito C, Froguel P,
Kadowaki T: Genetic Variation in the Gene Encoding Adiponectin Is Associated With an
Increased Risk of Type 2 Diabetes in the Japanese Population. Diabetes 51(2):536-540,
2002
28. Tattersall RB. Mild familial diabetes with dominant inheritance. Q J Med 43:339-57, 1974
29. Tattersall RB, Fajans SS. A difference between the inheritance of classical juvenile-onset
and maturity onset type diabetes of young people. Diabetes 24:44-53, 1975
30. Hattersley AT, Beards F, Ballantyne E, Appleton M, Harvey R, Ellard S: Mutations in
the glucokinase gene of the fetus result in reduced birth weight. Nat Genet 19:268-270,
1998
31. Lenderman H: Is maturity-onset diabetes at young age (MODY) more common in
Europe than previously assumed? Lancet 345:648, 1995
32. Frayling TM, Evans JC, Bulman MP, Pearson E, Allen L, Owen K, Bingham C,
Hannemann M, Shepherd M, Ellard S, Hattersley AT: β-Cell genes and diabetes: molecular
and clinical characterization of mutations in transcription factors. Diabetes 50(1):S94-S100,
2001
68
33. Permutt MA, Wasson J, Cox N: Genetic epidemiology of diabetes. J Clin Invest
115(6):1431-9, 2005
34. ADA (American Diabetes Association): Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus,
Diabetes Care, 2009.
35. Froguel P, Zouali H, Vionnet N, Velho G, Vaxillaire M, Sun F, Lesage S, Stoffel M,
Takeda J, Passa P, Permutt MA, Beckman JS, Bell GI, Cohen D: Familial hyperglycemia due
to mutations in glucokinase. Definition of a subtype of diabetes mellitus. N Engl J Med
328:697-702, 1993
36. Yamagata K, Furuta H, Oda N, Kaisaki PJ, Menzel S, Cox NJ, Fajans SS, Signorini
S, Stoffel M, Bell GI: Mutations in the hepatocyte nuclear factor-4a gene in maturity-onset
diabetes of the young (MODY1). Nature 384:458-460, 1996
37. Vaxillaire M, Boccio V, Philippi A, Vigouroux C, Terwilliger J, Passa P, Beckmann
JS, Velho G, Lathrop GM, Froguel P: A gene for maturity onset diabetes of the young
(MODY) maps to chromosome 12q. Nat Genet 9:418-423, 1995
38. Yamagata K, Oda N, Kaisaki PJ, Menzel S, Furuta H, Vaxillaire M, Southam L, Cox RD,
Lathrop GM, Boriraj VV, Chen X, Cox NJ, Oda Y, Yano H, Le Beau MM, Yamada S,
Nishigori H, Takeda J, Fajans SS, Hattersley AT, Iwasaki N, Hansen T, Pedersen O, Polonsky KS, Bell GI, Turner RC, Chevre JC, Froguel P, Bell GI: Mutations in the hepatocyte
nuclear factor-1a gene in maturity- onset diabetes of the young (MODY3). Nature 384:455458, 1996
39. Stoffers DA, Ferrer J, Clarke WL, Habener JF: Early-onset type-II diabetes mellitus
(MODY4) linked to IPF1. Nat Genet 17:138-139, 1997
40. Horikawa Y, Iwasaki N, Hara M, Furuta H, Hinokio Y, Cockburn BN, Lindner T,
Yamagata K, Ogata M, Tomonaga O, Kuroki H, Kasahara T, Iwamoto Y, Bell GI, Mutation
69
in hepatocyte nuclear factor-1 13 gene (TCF2) associated with MODY. Nat Genet 1997
17:384-385, 1997
41. Malecki MT, Jhala US, Antonellis A, Fields L, Doria A, Orban T, Saad M, Warram JH,
Montminy M, Krolewski AS: Mutations in NEUROD1 are associated with the development of
type 2 diabetes mellitus. Nat Genet 23:323-328, 1999
42. Frayling TM, Lindgren CM, Chevre JC, Menzel S, Wishart M, Benmezroua Y, Brown
A, Evans JC, Rao PS, Dina C, Lecoeur C, Kanninen T, Almgren P, Bulman MP, Wang Y,
Mills J, Wright- Pascoe R, Mahtani MM, Prisco F, Costa A, Cognet I, Hansen T,
Pedersen O, Ellard S, Tuomi T, Groop LC, Froguel P, Hattersley AT, Vaxillaire M: A
genome-wide scan in families with maturity- onset diabetes of the young: evidence for further
genetic heterogeneity. Diabetes 52:872-881, 2003
43. Kim SH, Ma X, Weremowicz S, Ercolino T, Powers C, Mlynarski W, Bashan KA,
Warram JH, Mychaleckyj J, Rich SS, Krolewski AS, Doria A: Identification of a locus for
maturity-onset diabetes of the young on chromosome 8p23. Diabetes 53:1375-1384, 2004
44. Chevre JC, Hani EH, Boutin P, Vaxillaire M, Blanche´ H, Vionnet N, Pardini VC, Timsit
J, Larger E, Charpentier G, Beckers D, Maes M, Bellanne´-Chantelot C, Velho G, Froguel
P: Mutation screening in 18 Caucasian families suggest the existence of other MODY
genes. Diabetologia, 41:1017-1023, 1998
45. Costa A, Bescos M, Velho G, Cheˆvre J, Vidal J, Sesmilo G, Bellanne´-Chantelot C,
Froguel P, Casamitjana R, Rivera-Fillat F, Gomis R, Conget I:
Genetic and clinical
characterisation of maturity-onset diabetes of the young in Spanish families. Eur J
Endocrinol 142:380–386, 2000
70
46. Pearson ER, Velho G, Clark P, Stride A, Shepherd M, Frayling TM, Bulman MP, Ellard
S, Froguel P, Hattersley AT:
13-Cell genes and diabetes: quantitative and qualitative
differences in the pathophysiology of hepatic nuclear factor-1a and glucokinase mutations.
Diabetes 50(Suppl 1):S101–S107, 2001
47. Shepherd M, Sparkes AC, Hattersley AT. Genetic testing in maturityonset diabetes of the
young (MODY): a new challenge for the diabetic clinic. Practical Diabetes Int 18: 16–21,
2001
48. Ellard S, Bellannè-Chantelot C, Hattersley AT: European Molecular Genetics Quality
Network, MODY Group, Best practice guidelines for the molecular genetic diagnosis of
maturity-onset diabetes of the young. Diabetologia 51:546–553, 2008
49. Matschinsky FM, Glucokinase, glucose homeostasis, and diabetes mellitus. Curr Diab
Rep 5:171-176, 2005
50. Froguel, P, Vaxillaire M, Sun F, Velho G, Zouali H, Butel M O, Lesage S, Vionnet N,
Clement K, Fougerousse F, Tanizawa Y, Weissenbach J, Beckmann JS, Lathrop GM, Passa
P, Permutt MA, Cohen D: Close linkage of glucokinase locus on chromosome 7p to earlyonset non-insulin-dependent diabetes mellitus. Nature 356:162-164, 1992
51. Hattersley AT, Turner RC, Permutt MA, Patel P, Tanizawa Y, Chiu KC, O'Rahilly S,
Watkins PJ, Wainscoat JS: Linkage of type 2 diabetes to the glucokinase gene. Lancet 339:
1307-10, 1992
52. Njolstad PR, Sovik O, Cuesta-Munoz A, Bjorkhaug L, Massa O, Barbetti F, Undlien DE,
Shiota C, Magnuson MA, Molven A, Matschinsky FM, Bell GI: Neonatal diabetes mellitus due
to complete glucokinase deficiency. N Engl J Med 344:1588-92, 2001
71
53. Glaser B, Prebekaran K, Mozhgan H, Davis E, Cuesta A, Buchs A, Stanley C, Thornton
PS, Permutt MA, Matschinsky FM, Herold KC: Familial hyperinsulinism caused by activating
glucokinase mutation. N Engl J Med 338:226-230, 1998
54. Gloyn AL, Noordam K, Willemsen MAAP, Ellard S, Lam WWK, Campbell IW, Midgley P,
Shiota C, Buettger C, Magnuson MA, Matschinsky FM, Hattersley AT: Insights into the
biochemical and genetic basis of glucokinase activation from naturally occurring
hypoglycemia mutations. Diabetes 52:2433-2440, 2003
55. Gloyn AL, Glucokinase (GCK) mutations in hyper-and hypoglycemia: Maturity-onset
diabetes of the young, permanent neonatal diabetes, and hyperinsulinemia of infancy.
Human Mutation, 22:353-362, 2003
56. Lynedjian PB: Molecular biology of glucokinase regulation. In Glucokinase and Glycemic
Disease: From Basics to Novel Therapeutics. Front Diabetes, 16:155-168, 2004
57. Magnuson MA, Shelton KD: An alternate promoter in the glucokinase gene is active in
the pancreatic beta cell. J Biol Chem 264:15936-15942, 1989
58. Fajans SS, Bell GI, Polonsky KS: Molecular mechanisms and clinical pathophysiology of
maturity-onset diabetes of the young. N Engl J Med 345:971-980, 2001
59. Velho G, Froguel P, Clement K, Pueyo ME, Rakotoambinina B, Zouali H, Passa P,
Cohen D, Robert JJ: Primary pancreatic 13-cell secretory defect caused by mutations in
glucokinase gene in kindreds of maturity onset diabetes of the young, Lancet, 340:444-448,
1992
60. Byrne MM, Sturis J, Clement K, Vionnet N, Pueyo ME, Stoffel M, Takeda J, Passa P,
Cohen D, Bell GI, Velho G, Froguel P, Polonsky K: Insulin secretory abnormalities in
subjects with hyperglycemia due to glucokinase mutations, J Clin Invest 93:1120-1130,
1994
72
61. Velho G, Petersen KF, Perseghin G, Hwang JH, Rothman DL, Pueyo ME, Cline
GW, Froguel P, Shulman GI: Impaired hepatic glycogen synthesis in glucokinase-deficient
(MODY-2) subjects. J Clin Invest 98:1755-1761, 1996
62. Vaxillaire M, Froguel P: Genetic basis of maturity-onset diabetes of the young.
Endocrinol Metab Clin North Am 35:371-384, 2006
63. Velho G, Hattersley AT, Froguel P: Maternal diabetes alters birth weight in glucokinasedeficient (MODY2) kindred but has no influence on adult weight, height, insulin secretion or
insulin sensitivity. Diabetologia, 43:1060-1063, 2000
64. Weedon MN, Frayling TM, Shields B, Knight B, Turner T, Metcalf BS, Voss L, Wilkin TJ,
McCarthy A, Ben-Shlomo Y, Davey Smith G, Ring S, Jones R, Golding J, Byberg L, Mann
V, Axelsson T, Syva¨nen AC, Leon D, Hattersley AT: Genetic regulation of birth weight and
fasting glucose by a common polymorphism in the islet cell promoter of the glucokinase
gene. Diabetes 54:576-581, 2005
65. Marz W, Nauck M, Hoffmann MM, Nagel D, Boehm BO, Koenig W, Rothenbacher D,
Winkelmann BR: G(-30)A polymorphism in the pancreatic promoter of the glucokinase gene
associated with angiographic coronary artery disease and type 2 diabetes mellitus. Circulation
2844-2849, 2004
66. Shih DQ, Stoffel M:
Dissecting the transcriptional network of pancreatic islets during
development and differentiation. Proc Natl Acad Sci USA 98:14189-14191, 2001
67. Stride A, Ellard S, Clark P Shakespeare L, Salzmann M, Shepherd M, Hattersley AT:
13-Cell dysfunction, insulin sensitivity, and glycosuria precede diabetes in hepatocyte nuclear
factor-1a mutation carriers. Diabetes Care 28:1751-1756, 2005
68. Vaxillaire M, Pueyo ME, Clement K, Fiet J, Timsit J, Philippe J, Robert JJ, Tappy L,
Froguel P, Velho G: Insulin secretion and insulin sensitivity in diabetic and non-diabetic
73
subjects with hepatic nuclear factor-1a (maturity-onset diabetes of the young-3 mutations.
Eur J Endocrinol 141:609-618, 1999
69. Pontoglio M, Prie D, Cheret C, Doyen A, Leroy C, Froguel P, Velho G, Yaniv M,
Friedlander G: HNF1a controls renal glucose reabsorption in mouse and man. EMBO Rep
1:359-365, 2000
70. Pontoglio M, Sreenan S, Roe M, Pugh W, Ostrega D, Doyen A, Pick AJ, Baldwin A,
Velho G, Froguel P, Levisetti M, Bonner-Weir S, Bell GI, Yaniv M, Polonsky KS: Defective
insulin secretion in hepatocyte nuclear factor 1a-deficient mice. J Clin Invest 101:2215-2222,
1998
71. Wang H, Antinozzi PA, Hagenfeldt KA, Maechler P, Wollheim CB: Molecular targets of a
human HNF1 a mutation responsible for pancreatic beta-cell dysfunction. EMBO J 19:42574264, 2000
72. Pearson ER, Pruhova S, Tack CJ Johansen A, Castleden HA, Lumb PJ, Wierzbicki AS,
Clark PM, Lebl J, Pedersen O, Ellard S, Hansen T, Hattersley AT: Molecular genetics and
phenotypic characteristics of MODY caused by hepatocyte nuclear factor 4a mutations in a
large European collection. Diabetologia 48:878-885, 2005
73. Boj SF, Parrizas M, Maestro MA, Ferrer J: A transcription factor regulatory circuit in
differentiated pancreatic cells Proc Natl Acad Sci USA 98:14481-14486, 2001
74. Thomas H, Jaschkowitz K, Bulman M, Frayling TM, Mitchell SM, Roosen S, LingottFrieg A, Tack CJ, Ellard S, Ryffel GU, Hattersley AT: A distant upstream promoter of the
HNF4a gene connects the transcription factors involved in maturity-onset diabetes of the
young. Hum Mol Genet 10:2089-2097, 2001
75. Hertz R, Magenheim J, Berman I, Bar-Tana J: Fatty acyl-CoA thioesters are ligands of
hepatic nuclear factor-4a. Nature 392:512-516, 1998
74
76. Stoffel M, Duncan SA: The maturity-onset diabetes of the young (MODY1) transcription
factor HNF4a regulates expression of genes required for glucose transport and metabolism.
Proc Natl Acad Sci USA 94:13209-13214, 1997
77. Gupta RK, Vatamaniuk MZ, Lee CS, Flaschen RC, Fulmer JT, Matschinsky FM,
Duncan SA, Kaestner KH: The MODY1 gene HNF-4a regulates selected genes involved in
insulin secretion. J Clin Invest 115:1006-1015, 2005
78. Pearson ER, Boj SF, Steele AM, Barrett T, Stals K, Shield JP, Ellard S, Ferrer J,
Hattersley AT: Macrosomia and hyperinsulinaemic hypoglycaemia in patients with
heterozygous mutations in the HNF4A gene, PLoS Med 4(4):e118, 2007
79. Lindner TH, Njolstad PR, Honkawa V, Bostad L, Bell GI, Sovic O: A novel syndrome of
diabetes mellitus renal dysfunction and genital malformation associated with a partial
deletion of the pseudo POU domain of hepatocyte nuclear factor 1beta. Hum Mol Genet
8(11):2001-2008, 1999
80. Bellanne-Chantelot C, Chauveau D, Gautier JF Dubois-Laforgue D, Clauin S, Beaufils
S, Wilhelm JM, Boitard C, Noe¨l LH, Velho G, Timsit J, Clinical spectrum associated with
hepatocyte nuclear factor-1/3 mutations. Ann Intern Med 140:510-517, 2004
81. Haumaitre C, Barbacci E, Jenny M, Ott MO, Gradwohl G, Cereghini S:
Lack of
TCF2/vHNF1 in mice leads to pancreas agenesis. Proc Natl Acad Sci USA 102:1490-1495,
2005
82. Maestro MA, Cardalda C, Boj SF, Luco RF, Servitja JM, Ferrer J: Distinct roles of
HNF1 /3, HNF1 a, and HNF4 a in regulating pancreas development, /3-cell function and
growth. Endocr Dev 12:33-45, 2007
83. Bellanne-Chantelot C, Clauin S, Chauveau D, Collin P, Daumon M, Douillard C,
Dubois-Laforgue D, Dusselier L, Gautier JF, Jadoul M, Laloi-Michelin M, Jacquesson L,
75
Larger E, Louis J, Nicolino M, Subra JF, Wilhem JM, Young J, Velho G, Timsit J: Large
genomic rearrangements in the hepatocyte nuclear factor-1/3 (TCF2) gene are the most
frequent cause of maturity-onset diabetes of the young type 5. Diabetes 54:3126-3132,
2005
84. Liu L, Furuta H, Minami A, Zheng T, Jia W, Nanjo K, Xiang K: A novel mutation,
Ser159Pro, in the NeuroD1/BETA2 gene contributes to the development of diabetes in a
Chinese potential MODY family. Mol Cell Biochem 303:115-120, 2007
85. Pearson ER, Starkey BJ, Powell RJ, Gribble FM, Clark PM, Hattersley AT: Genetic cause
of hyperglycaemia and response to treatment in diabetes. Lancet 362:1275-1281, 2003
86. Guertin KR, Grimsby J: Small molecule glucokinase activators as glucose lowering
agents: a new paradigm for diabetes therapy. Curr Med Chem 13:1839-1843, 2006
87. Raeder H, Johansson S, Holm PI, Haldorsen IS, Mas E, Sbarra V, Nermoen I, Eide SA,
Grevle L, Bjørkhaug L, Sagen JV, Aksnes L, Søvik O, Lombardo D, Molven A, Njølstad
PR: Mutations in the CEL VNTR cause a syndrome of diabetes and pancreatic exocrine
dysfunction. Nat Genet 38:54-62, 2006
88. Maassen JA, Janssen GM,’t Hart LM: Molecular mechanisms of mitochondrial diabetes
(MIDD). Ann Med 37:213-221, 2005
89. Vionnet N, Passa P, Froguel P: Prevalence of mitochondrial gene mutations in families
with diabetes mellitus. Lancet 342:1429-1430, 1993
90. Ciafaloni E, Ricci E, Shanske S, Moraes CT, Silvestri G, Hirano M, Simonetti S, Angelini
C, Donati MA, Garcia C, Martinuzzi A, Mosewich R, Servidei S, Zammarchi E, Bonilla E,
DeVivo DC, Rowland LP, Schon EA, DiMauro S: MELAS: clinical features, biochemistry, and
molecular genetics. Ann Neurol 31:391-398, 1992
76
91. Shield JP: Neonatal diabetes: new insights into aetiology and implication. Horm Res
53(1):7-11, 2000
92. Flanagan SE, Patch AM, Mackay DJG, Edghill EL, Gloyn AL, Robinson D, Julian PH,
Shield JPH, Temple K, Ellard S, Hattersley AT: Mutations in ATP-sensitive K+ channel genes
cause transient neonatal diabetes and permanent diabetes in childhood or adulthood. Diabetes,
56:1930-1937, 2007
93. Gloyn AL, Pearson ER, Antcliff JF, Proks P, Bruining GJ, Slingerland AS,Howard N,
Srinivasan S, Silva JM, Molnes J, Edghill EL, Frayling TM, Temple IK, Mackay D, Shield JP,
Sumnik Z, van Rhijn A, Wales JK, ClarkP, Gorman S, Aisenberg J, Ellard S, Njolstad PR,
Ashcroft FM, Hattersley AT: Activating mutations in the ATP-sensitive potassium channel
subunitKir6.2 gene are associated with permanent neonatal diabetes. N Engl J Med
350:1838-1849, 2004
94.
Massa O, Iafusco D, D’Amato E, Gloyn AL, Hattersley AT, Pasquino B, Tonini G,
Dammacco F, Zanette G, Porzio O, Frongia P, Meschi F, Bottazzo G, Crinò A, Lorini R,
Cerutti F, Vanelli M, Barbetti F and the Early Onset Diabetes Study Group of the Italian
Society of Pediatric Endocrinology and Diabetology. KCNJ11 activating mutations in Italian
patients with Permanent Neonatal Diabetes. Hum Mutat 25:22-7, 2005
95. Stanik J, Gasperikova D, Paskova M, Barak L, Javorkova J, Jancova E, Ciljakova M,
Hlava P, Michalek J, Flanagan SE, Pearson E, Hattersley AT, Ellard S, Klimes I: Prevalence
of permanent neonatal diabetes in Slovakia and successful replacement of insulin with
sulfonylurea therapy in KCNJ11 and ABCC8 mutation carriers. J Clin Endocrinol Metab
92:1276-1282, 2007
96. Njolstad PR, Sovik O, Cuesta-Munoz A, Bjorkhaug L, Massa O, Barbetti F,Undlien DE,
Shiota C, Magnuson MA, Molven A, Matschinsky FM, Bell GI: Neonatal diabetes mellitus due
to complete glucokinase deficiency. N Engl J Med 344:1588-1592, 2001
77
97. Njolstad PR, Sagen JV, Bjorkhaug L, Odili S, Shehadeh N, Bakry D, Sarici SU, Alpay F,
Molnes J, Molven A, Sovik O, Matschinsky FM: Permanent neonatal diabetes caused by
glucokinase deficiency: inborn error of the glucose-insulin signaling pathway. Diabetes
52:2854-2860, 2003
98. Stoffers DA, Zinkin NT, Stanojevic V, Clarke WL, Habener JF: Pancreatic agenesis
attributable to a single nucleotide deletion in the human IPF1 gene sequence. Nat Genet
15:106-10, 1997
99. Pearson ER, Flechtner I, Njølstad PR,Malecki MT, Flanagan SE, Larkin B,Ashcroft FM,
Klimes I, Codner E, Iotova V, Slingerland AS, Shield J, Robert JJ,Holst JJ, Clark PM, Ellard
S, Søvik O,Polak M: Hattersley AT: Switching from insulin to oral sulfonylureas in patients
with diabetes due to Kir6.2 mutations. N Engl J Med 355:467-477, 2006
100. Masia R, Koster JC, Tumini S, Chiarelli F, Colombo C, Nichols CG, Barbetti F: ATPBinding Mutation (G334D) in KCNJ11 Is Associated With a Sulfonylurea-Insensitive Form of
Developmental Delay, Epilepsy, and Neonatal Diabetes. Diabetes 56:328-336, 2007
101. Babenko AP, Polak M, Cavè H, Busiah K, Czernichow P, Scharfmann R, Bryan J, AguilarBryan L: Activating mutations in the ABCC8 gene in neonatal diabetes mellitus. N Engl J Med
355:456-466, 2006
102. Patch AM, Flanagan SE, Boustred C, Hattersley AT, Ellard S: Mutations in the ABCC8
gene encoding the SUR1 subunit of the KATP channel cause transient neonatal diabetes,
permanent neonatal diabetes or permanent diabetes diagnosed outside the neonatal period.
Diabetes Obes Metab 9(2): 28-39, 2007
103. Vaxillare M, Froguel P: Activating mutations in the ABCC8 gene in neonatal diabetes
mellitus. N Engl J Med 355: 456-466, 2006
78
104. Vaxillaire M, Dechaume A, Busiah K, Cave H, Pereira S, Scharfmann R, de Nanclares
GP, Castano L, Froguel P, Polak M: New ABCC8 mutations in relapsing neonatal diabetes
and clinical features. Diabetes 56:1737-1741, 2007
105. Domenech E, Gomez-Zaera M, Nunes V: Wolfram/DIDMOAD syndrome, a
heterogenic and molecularly complex neurodegenerative disease. Pediatr Endocrinol Rev
3:249-257, 2006
106. Waeber G, Delplanque J, Bonny C, Mooser V, Steinmann M, Widmann C, Maillard
A, Miklossy J, Dina C, Hani EH, Vionnet N, Nicod P, Boutin P, Froguel P:
The gene
MAPK8IP1, encoding islet-brain-1, is a candidate for type 2 diabetes. Nat Genet 24:291-295,
2000
107. Shimomura H, Sanke T, Hanabusa T, Tsunoda K, Furuta H, Nanjo K Nonsense
mutation of islet-1 gene (Q310X) found in a type 2 diabetic patient with a strong family history.
Diabetes 49:1597-1600, 2000
108. Neve B, Fernandez-Zapico ME, Ashkenazi-Katalan V, Dina C, Hamid YH, Joly E,
Vaillant E, Benmezroua Y, Durand E, Bakaher N, Delannoy V, Vaxillaire M, Cook T,
Dallinga-Thie GM, Jansen H, Charles MA, Cle´ment K, Galan P, Hercberg S, Helbecque
N, Charpentier G, Prentki M, Hansen T, Pedersen O, Urrutia R, Melloul D, Froguel P:
Role of transcription factor KLF11 and its diabetes-associated gene variants in pancreatic /3
cell function. Proc Natl Acad Sci USA 102:4807-4812, 2005
109. Bernassola F, Federici M, Corazzari M, Terrinoni A, Hribal ML, De Laurenzi V, Ranalli
M, Massa O, Sesti G, McLean WH, Citro G, Barbetti F, Melino G: Role of transglutaminase
2 in glucose tolerance: knockout mice studies and a putative mutation in a MODY patient.
FASEB J 16:1371-1378, 2002
110. Porzio O, Massa O, Cunsolo V, Colombo C, Malaponti M, Bertuzzi F, Hansen T,
Johansen A, Pedersen O, Meschi F, Terrinoni A, Melino G, Federici M, Decarlo N,
79
Menicagli M, Campani D, Marchetti P, Ferdaoussi M, Froguel P, Federici G, Vaxillaire M,
Barbetti F: Missense mutations in the TGM2 gene encoding transglutaminase 2 are found in
patients with early-onset type 2 diabetes. Hum Mutat, 28:1150, 2007
111. Murphy R, Ellard S, Hattersley AT, Clinical implications of a molecular genetic
classification of monogenic β-cell diabetes, Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 4:200-213,
2008
112. Slingerland AS, Hattersley AT: Mutations in the Kir6.2 subunit of the KATP channel
and permanent neonatal diabetes: new insights
and new treatment, Ann Med, 2005;
37:186-195.
113. Moller AM, Dalgaard LT, Pociot F, Nerup J, Hansen T, Pedersen O: Mutations in the
hepatocyte nuclear factor-1alpha gene in Caucasian families originally classified as having
Type I diabetes. Diabetologia, 41:1528-1531, 1998
114. Lambert AP, Ellard S, Allen LI, Gallen IW, Gillespie KM, Bingley PJ, Hattersley AT:
Identifying hepatic nuclear factor 1alpha mutations in children and young adults with a
clinical diagnosis of type 1 diabetes. Diabetes Care 26:333-337, 2003
115. Hattersley AT, Pearson ER:
Pharmacogenetics and beyond: the interaction of
therapeutic response, beta-cell physiology, and genetics in diabetes. Endocrinology
147:2657–2663, 2006
116. Sacks DB, Bruns DE, Goldstein DE, Maclaren NK, McDonald JM, Parrot M:
Guidelinesand recommendation for laboratory analysis in the diagnosis and management of
diabetes mellitus. Clin Chem 48:436-472, 2002
117. Ellard S, Beards F, Allen LIS, Shepherd M, Ballantyne E, Harvey R, Hattersley AT: A
high prevalence of glucokinase mutations in gestational diabetic subject selected by clinical
criteria. Diabetologia 43:250-253, 2000
80
118. Miller SA, Dykes DD, Polesky HFA: Simple salting out procedure for extracting DNA
from human nucleated cells. Nucleic Acid Res 16:1215, 1988
119. Cambuli VM, Incani M, Pilia S, Congiu T, Cavallo MG, Cossu E, Federica Sentinelli F,
Stefano Mariotti S, Loche S, Baroni MG: Oral glucose tolerance test in Italian
overweight/obese children and adolescents results in a very high prevalence of impaired
fasting glycaemia, but not of diabetes. Diabetes Metab Res Rew 25(6):528-34, 2009
120. Chèvre JC, Hani EH, Boutin P, Vaxillaire M, Blanché H, Vionnet N, Pardini VC, Timsit J,
Larger E, Charpentier G, Beckers D, Maes M, Bellanné-Chantelot C, Velho G, Froguel P:
Mutation screening in 18 Caucasian families suggest the existence of other MODY genes.
Diabetologia 41(9):1017-23, 1998
121. Ellard S: Hepatocyte Nuclear Factor 1 Alpha (HNF-1α) Mutations in Maturity-Onset
Diabetes of the Young: Hum Mutat 16:377-385, 2000
122. Holmkvist J, Almgren P, Lyssenko V, Winckler W, Anevski D, Cilio C, Almgren P,
Berglund G, Nilsson P, Tuomi T, Lindgren CM, Altshuler D, Leif Groop: Common variant in
HNF-1α and risk of type 2 diabetes. Diabetologia 49:2882-2891, 2006
123. Winckler W, Weedon MN, Graham RR, McCarroll SA, Purcell S, Almgren P, Tuomi T,
Gaudet D, Bengtsson Boström K, Walker M, Hitman G, Hattersley AT, McCarthy MI, Ardlie
KG, Hirschhorn, Daly MJ, Frayling TM, Leif Groop, Altshuler D: Evaluation of Common
Variant in the Six Known Maturity-Onset Diabetes of the Young (MODY) Genes for
Association With Type 2 Diabetes. Diabetes 56:685-693, 2007
124. Cauchi S, Nead KT, Choquet H, Horber F, Potoczna, Balkau B, Marre M, Charpentier
G, Froguel P, Meyre D: The Genetic susceptibility to type 2 diabetes may be modulated by
obesity status: implication for association studies. BMC Medical Genetics 9:45, 2008
81
125. Holmkvist J, Cervin C, Lyssenko V, Lindgren CM, Eriksson KF, Bo I, Tuomi T, Nilsson
P, Leif Groop: Common Variant in Maturity-Onset Diabetes of the Young Genes and Future
Risk of Type 2 Diabetes. Diabetes 57:1738-1744, 2008
126. Urhammer S, Fridberg M, Hansen T, J S K Rasmussen, Møller AM, Clausen JO,
Pedersen O : A prevalent amino acid polymorphism at codon 98 in the hepatocyte nuclear
factor 1 alfa gene is associated with reduced serum C- peptide and insulin responses to an
oral glucose challenge. Diabetes 46:912-916, 1997
127. Sladek R, Rocheleau G, Rung J, Dina C, Shen L, Serre D, Boutin P, Vincent D, Belisle
A, Hadjadj S, Balkau B, Heude B, Charpentier G, Hudson TJ, Montpetit A, Pshezhetsky AV,
Prentki M, Posner BI, Balding DJ, Meyre D, Polychronakos C, Froguel P: A genome-wide
association study identifies novel risk loci for type 2 diabetes. Nature 445:881-885, 2007
128. Chimienti F, Devergnas S, Pattou F, Schuit F, Garcia-Cuenca R, Vandewalle B, KerrConte J, Van Lommel L, Grunwald D, Favier A, Seve M: In vivo expression and functional
characterization of he zinc transporter ZnT8 in glucose-induced insulin secretion. J Cell Sci
119:4199-4206, 2006
129. Ashcroft F,Rorsman P: Type 2 diabetes mellitus: not quite exciting enough? Human
Molecular Genetics 13:R21-R31, 2004
130. Hani EH, Boutin P, Durand E, Inoue H, Permutt MA, Velho G, Froguel P: Missense
mutations in the pancreatic islet beta cell inwardly rectifying K+ channel gene (KIR6.2/BIR): a
meta-analysis suggests a role in the polygenic basis of Type II diabetes mellitus in
Caucasians. Diabetologia 41(12):1511-1515, 1998
131. Florez JC, Burtt N, de Bakker PI, Almgren P, Tuomi T, Holmkvist J, Gaudet D, Hudson
TJ, Schaffner SF, Daly MJ, Hirschhorn JN, Groop L, Altshuler D: Haplotype structure and
genotype-phenotype correlations of the sulfonylurea receptor and the islet ATP-sensitive
potassium channel gene region. Diabetes 53(5):1360-1368, 2004
82
132. Cambuli VM, Musiu MC, Incani M, Paderi M, Serpe R, Marras V, Cossu E, Cavallo
MG,Mariotti S, Loche S Baroni MG: Assessment of adiponectin and leptin as biomarkers of
positive metabolic outcomes after lifestyle intervention in overweight and obese children. J
Clin Endocrinol Metab 93(8):3051-3057, 2008
133. Romeo S, Sentinelli F, Dash S, Yeo GSH, Savage DB, Leonetti F, Capoccia D, Incani
M, Maglio C, Iacovino M, O’Rahilly S, Baroni MG. Morbid obesity exposes the association
between PNPLA3 I148M (rs738409) and indices of hepatic injury in individuals of European
descent. International Journal of Obesity Vol. aop, No. current. doi:10.1038/ijo.2009.216,
2009
134. Rose CS, Ek J, Urhammer S, Glümer C, Borch-Johnsen K, Jørgensen T, Pedersen O,
Hansen T: A -30 G>A Polymorphism of the β Cell-Specific Glucokinase Promoter Associates
With Hyperglycemia in the General Population of Whites. Diabetes 54:3026-3031, 2005
135. Shaat N, Karlsson E, Lernmark A, Ivarsson S, Lynch K, Parikh H, Almgren P, Berntorp
K, L. Groop: Common variants in MODY genes increase the risk of gestational diabetes
mellitus. Diabetologia 47(7):1545-1551, 2007
136. Massa O, Meschi F, Cuesta-Munoz A, Caumo A, Cerutti F, Toni S, Cherubini V,
Guazzarotti L, Sulli N, Matschinsky FM, Lorini R, Iafusco D, Barbetti F: High prevalence of
glucokinase mutations in Italian children with MODY. Influence on glucose tolerance, firstphase insulin response, insulin sensitivity and BMI. Diabetes Study Group of the Italian
Society of Paediatric Endocrinology and Diabetes (SIEDP). Diabetologia
44(7):898-905,
2001
137. García-Herrero CM, Galán M, Vincent O, Flández B, Gargallo M, Delgado-Alvarez E,
Blázquez E, Navas MA: Functional analysis of human glucokinase gene mutations causing
MODY2: exploring the regulatory mechanisms of glucokinase activity. Diabetologia 50:325333, 2007
83
138. Casu A, Pascutto C, Bernardinelli L, Songini M: The Sardinian IDDM Epidemiology
Study Group. Type 1 diabetes among Sardinian children is increasing. The Sardinian
Diabetes register 0-14 years, 1989-1999. Dibetes Care 27:1623-1629, 2004
139. Reinehr T, Schober E, Wiegand S, Thon A, Holl R, DPV-Wiss Study Group: Beta-cell
autoantibodies in children with type 2 diabetes mellitus: subgroup or misclassification? Arch
Dis Child 91(6):473-477
140. Wabitsch M, Hauner H, Hertramp M, Muche R, Hay B, Mayer H, Kratzer W, Debatin
KM, Heinze E: type II diabetes mellitus and impaired glucose regulation in Caucasian
children and adolescents with obesity living in Germany. Int J Obese Relat Metab Disord
28:307-313, 2004
141. Williams DE, Cadwell BL, Cheng YI Cowie CC, Gregg EW, Geiss LS, Engelgau MM,
Narayan KM, Imperatore G: Prevalence of impaired fasting glucose and relationship with
cardiovascular desease risk factors in UK adolescents, 1999-2000. Pediatics 116:11221126, 2005
142. Sinha R, Fish G, Teague B, Tamborlane VW, Banyas B, Allen K, Savoye M, Rieger V,
Taksali S, Barbetta G, Sherwin RS, Caprio S: Prevalence of impaired glucose tolerance
among children and adolescents with marked obesity. N Engl J Med 346:802-810, 2002
143. Invitti C, Guzzaloni G, Gilardini L, Morabito F, Viberti G: Prevalence and concomitants
og glucose intolerance in European obese children and adolescent. Diabetes Care 26:118124, 2003
144. Locatelli M, Songini M, Bottazzo GF: IDDM Sardinia Project: a study model on the
etiopathogenesis of insulin-dependent diabetes mellitus and other autoimmune pathologies.
Gruppi di studio IDDM Sardegna. Ann Ist Super Sanità 35(2):253-263 1999
84
145. Lorini R, Alibrandi A, Vitali L, Klersy C, Martinetti M, Betterle C, D’annunzio G, Bonifacio
E: Risk of type 1diabetesdevelopment in children with incidental hyperglycemia :
a
multicenter Italian study. Diabetes Care 24(7):1210-1216, 2001
146. Vona G: Le caratteristiche genetiche dei sardi. Antropologia Contemporanea. 18(3-4):
101-109, 1995
147. Vona, G: The peopling of Sardinia (Italy): History and effects. Int J Anthropol, 12:71-87,
1997
148. Piazza A, Cappello N, Olivetti E, Rendine S: A genetic history of Italy. Ann Hum Genet,
52(3):203-213,1998
149. Massa O, Meschi F, Cuesta –Munoz, Caumo A, Cerutti F, Toni S, Cherubini V,
Guazzarotti L, Sulli N, Matschinsky FM, Lorini R, Iafusco D, Barbetti F, Diabetes Study
Group of the Italian Society of Paediatric Endocrinology and Diabetes (SIEDP): High
prevalence of glucokinase mutations in Italian children with MODY. Influence on glucose
tolerance, first-phase insulin response, insulin sensitivity and BMI. Diabetologia 44:898-905,
2001
150. Bertini C, Maioli M, Fresu P, Tonolo G, Pirastu M, Maioli M: A new missense mutation
in the glucokinase gene in an Italian Mody family. Diabetologia 40:1413-4,1997
85
APPENDICE I: Pubblicazione derivanti dal lavoro di questa tesi
Papers
Cambuli VM, Incani M, Cossu E, Congiu T, Scano F, Pilia S, Sentinelli F, Cavallo MG,
Loche S, Baroni MG. Prevalence of Type 1 Diabetes auto-antibodies (GADA, IA2,IAA) in
overweight and obese children and their association with glucose levels. Submitted to
Diabetes Care 2009
Romeo S, Sentinelli F, Dash S, Yeo GSH, Savage DB, Leonetti F, Capoccia D, Incani M,
Maglio C, Iacovino M, O’Rahilly S, Baroni MG. Morbid obesity exposes the association
between PNPLA3 I148M (rs738409) and indices of hepatic injury in individuals of
European descent. International Journal of Obesity (2009) Vol. aop, No. current.
doi:10.1038/ijo.2009.216
Cambuli VM, Incani M, Pilia S, Congiu T, Cavallo MG, Cossu E, Sentinelli F, Mariotti S,
Loche S, Baroni MG. Oral glucose tolerance test in Italian overweight/obese children and
adolescents results in a very high prevalence of impaired fasting glycaemia, but not of
diabetes. Diabetes Metab Res Rew (2009) 25(6):528-34. ISSN 1520-7552
Cambuli MV, Musiu MC, Incani M, Paderi M,Serpe R, Marras V, Cossu E, Cavallo MG,
Mariotti S, Loche S and Baroni MG. Assessment of adiponectin and leptin as biomarkers
of positive metabolic outcomes after lifestyle intervention in overweight and obese
children. J Clin Endocrinology Metabolism (2008) 93 (8): 3051-7
86
APPENDICE II
Abstracts
Cambuli VM, Congiu T, Incani M, Paderi M, Mastinu M, Leone MS, Loche S., Musiu MC,
Prinzis A, Cavallo MG, Cossu E, Baroni MG. Prevalenza di mutazioni MODY in bambini
sardi obesi non selezionati per familiarità diabetica. Riunione Scientifica annuale SIDAMD. Melià Hotel, Olbia – 14-15 Dicembre 2007
Paderi M, Cambuli VM, Incani M, Leone MS, Mastinu M, Loche S, Musiu MC, Prinzis A,
Mariotti S, Cossu E Baroni MG. Adiponectinemia e altri parametri metabolici subiscono
modifiche significative in bambini obesi trattati con interventi sullo stile di vita. Riunione
Scientifica annuale SID-AMD. Melià Hotel, Olbia – 14-15 Dicembre 2007
Congiu T, Cambuli VM, Sentinelli F, Prinzis A, Cossu E, Tuberi M, Loy E, Cocco S,
Incani M, Baroni MG. Ricerca di mutazioni mediante PCR-SSCP nel gene Beacon in
bambini obesi. Riunione Scientifica annuale SID-AMD. Euro Hotel, Nuoro – 15-16
Dicembre 2006. Giornale Italiano di Diabetologia e Metabolismo (2007) 27- n°2:111-120
Cambuli VM, Incani M, Congiu T, Maestrale GB, Prinzis A, Pilia S, Cavallo MG, Cossu
E, Loche S, Baroni MG. Prevalenza di mutazioni mody in bambini sardi obesi non
selezionati per familiarita' diabetica. XXII Congresso Nazionale SID. Torino, Il Lingotto.
26-29 Maggio 2008. Il Diabete (2008) Marzo (suppl. 1): P142, p63
Cambuli VM, Paderi M, Musiu MC, Incani M, Serpe R, Pilia S, Civolani P, Casini MR,
Prinzis A, Cossu E, Mariotti S, Loche S, Baroni MG. Livelli di adiponectina dopo un anno
di interventi sullo stile di vita in bambini obesi: ruolo della adiponectina come biomarker di
outcomes positivi. XXII Congresso Nazionale SID. Torino, Il Lingotto. 26-29 Maggio
2008. Il Diabete (2008) Marzo (suppl. 1): P194, p76
Cambuli VM, Musiu MC, Incani M, Paderi M, Serpe R, Pilia S, Civolani P, Cossu E,
Mariotti S, Loche S, Baroni MG. Adiponectin level after 1 year lifestyle intervention in
overweight/obese children: role of adiponectin as marker of positive outcome. 90th Annual
Meeting of The Endocrine Society. June 15-18, 2008. San Francisco, California, USA
Cambuli VM, Paderi M, Musiu MC, Incani M, Serpe R, Leone MS, Pilia S, Civolani P,
Casini MR, Prinzis A, Cossu E, Mariotti S, Loche S, Baroni MG. Adiponectin, but not
leptin, as biomarker of positive outcomes after 1 year lifestyle intervention in
overweight/obese children. XXVI Giornate Endocrinologiche Pisane 2008. Pisa, Palazzo
dei Congressi, 26-28 Giugno 2008
Baroni MG, Cambuli VM, Romeo S, Congiu T, Incani M, Sentinelli F, Filetti S, Musiu MC,
Cavallo MG, Cossu E, Loche S. Prevalence of maturity-onset diabetes of the young
(MODY) in Sardinia in overweight/obese children non selected according to family history
for diabetes. Diabetologia (2008) 51 (supp 1): 284A
Frau G, Mandas M, Cambuli VM, Incani M, Perra L, Zanda F, Mastino D, Scano F,
Leone MS, Prinzis A, Cossu E, Baroni MG. Screening di Nefropatia in una Popolazione di
87
Diabetici di Tipo 2: Correlazione tra l’indice di Filtrazione Glomerulare e l’Albuminuria. X
Riunione Scientifica SID-AMD. Cagliari, 28-29 Novembre 2008. Il Giornale di AMD (2009)
12 (1-2): 49-56 ISSN 2036-363X
Incani M, Cambuli VM, Congiu T, Sentinelli F, Maestrale GB, Perra L, Frau G, Zanda F,
Mastino D, Scano F, Loche S, Cossu E, Baroni MG. Prevalenza del diabete MODY in
bambini e adolescenti sardi sovrappeso/obesi. X Riunione Scientifica SID-AMD. Cagliari,
28-29 Novembre 2008. Il Giornale di AMD (2009) 12 (1-2): 49-56 ISSN 2036-363X
Perra L, Cambuli VM, Incani M, Frau G, Zanda F, Mastino D, Scano F, Mastinu M,
Prinizis A, Cossu E, Baroni MG. Screening per diabete gestazionale e studio della
sequenza del gene della glucokinasi (MODY 2). X Riunione Scientifica SID-AMD.
Cagliari, 28-29 Novembre 2008. Il Giornale di AMD (2009) 12 (1-2): 49-56 ISSN 2036363X
Sentinelli F, Cambuli VM, Congiu T, Incani M, Paderi M, Perra L, Frau G, Loche S1, Pilia
S1, Prinzis A, Cavallo MG2, Cossu E e Baroni MG. Ricerca di mutazioni nel gene kcnj11
(kir 6.2) in bamibi obesi sardi stratificati in base ad alterata regolazione glucidica. X
Riunione Scientifica SID-AMD. Cagliari, 28-29 Novembre 2008. Il Giornale di AMD (2009)
12 (1-2): 49-56 ISSN 2036-363X
Cambuli VM, Incani M, Pilia S, Congiu T, Cavallo MG, Cossu E, Sentinelli F, Mariotti S,
Loche S, Baroni MG. L’alterata glicemia a digiuno e’ molto frequente tra i bambini e gli
adolescenti sovrappeso/obesi sardi, ma non identifica IGT o diabete. La curva da carico
di glucosio standard è adeguata per identificare l’iperglicemia in età infantile? X Riunione
Scientifica SID-AMD. Cagliari, 28-29 Novembre 2008. Il Giornale di AMD (2009) 12 (1-2):
49-56 ISSN 2036-363X
Romeo S, Sentinelli F, Legnetti F, Capoccia D, Cambuli VM, Incani M, Scano F, Cavallo
MG, Mariotti S, Cossu E, Baroni MG. Angiopoietin-like 4 protein (ANGPTL4) E40K
protects obese individuals from developing the atherogenic lipid profile associated with
metabolic syndrome. XXXIII Nazional Congress of the Italian Society of Endocrinology. J.
Endocrinolol. Invest 32 (2009): OC18 pag. 9 ISSN 1121-1369
Cambuli VM, Frau G, Mandas M, Incani M, Perra L, Zanda F, Mastino D, Scano F,
Leone MS, Prinzis A, Cossu E, Baroni MG. Screening For Nephropathy In A Cohort Of
People Affected By Type 2 Diabetes: Correlation Between Glomerular Filtration Index
And Albuminuria. XXXIII Nazional Congress of the Italian Society of Endocrinology. J.
Endocrinolol. Invest 32 (2009): PP104 pag. 47 ISSN 1121-1369
Scano F, Cambuli VM, Zanda F, Incani M, Prinzis A, Sentinelli F, Zedda A, Cossu E,
Pilia S, Cavallo MG, Tiberti C, Mariotti S, Loche S and Baroni MG. Prevalence Of
Autoantibodies Linked To Type 1 Diabetes In A Population Of Obese Children And
Adolescents From Sardinia. XXXIII Nazional Congress of the Italian Society of
Endocrinology. J. Endocrinolol. Invest 32 (2009): PP139 pag. 56 ISSN 1121-1369
Cambuli VM, Sentinelli F, Incani M, Congiu T, Paderi M, Perra L, Frau G, Loche S, Pilia
S, Prinzis A, Cavallo MG, Cossu E, Baroni MG. Search For Mutations In Kcnj11 Gene
(Kir6.2) In Obese Children From Sardinia Affected By Impaires Fasting Glycaemia.
XXXIII Nazional Congress of the Italian Society of Endocrinology. J. Endocrinolol. Invest
32 (2009): PP282 pag. 92 ISSN 1121-1369
88
Incani M, Cambuli MV, Paderi M, Sentinelli F, Cavalot F, Trovati M, Mastino D, Cossu E,
Mariotti S, Baroni MG. La genetica del MODY nella pratica clinica: Analisi del gene
glucochinasi Riunione Scientifica AMD-SID, Fordongianus, 27-28 Novembre 2009.
Perra L, Mastino D, Incani M, Cambuli VM, Frau G, Murgia C, Zanda F, Scano F, Cossu
E, Baroni MG. Screening per il gene glucochinasi nel diabete gestazionale. Riunione
Scientifica AMD-SID, Fordongianus, 27-28 Novembre 2009.
Scano F, Cambuli MV, Zedda MA, Rippoli C, Soro M, Prinzis A, Zanda F, Incani M,
Mastinu M, Cavallo MG, Strazzera A, Fois AM, Cossu E, Baroni MG. Prevalenza di
autoimmunità β cellulare nei parenti di primo grado di soggetti affetti da diabete mellito di
tipo 1 in una popolazione sarda. Riunione Scientifica AMD-SID, Fordongianus, 27-28
Novembre 2009.
Cambuli VM, Incani M, Sentinelli F, Congiu T, Paderi M, Perra L, Frau G, Loche S, Pilia
S, Prinzis A, Cavallo MG, Cossu E, Baroni MG. Ricerca di mutazioni nel gene KCNJ11
(Kir 6.2) in bambini obesi sardi stratificati in base ad alterata alterazione glucidica.
Ampliamento dello studio. Riunione Scientifica AMD-SID, Fordongianus, 27-28
Novembre 2009.
89
