Allievo: Castelli Miriam Classe: 3 B BIO Data 14/01/13 ATTIVITA’ DI LABORATORIO: Incidenza di fattori fisico- chimici nello sviluppo colturale Fasi di lavoro La prima operazione da fare è il RAVVIVO DEI BATTERI : Per preparare il terreno di coltura utilizziamo il terreno NB. Pesiamo 0,8 g di terreno con la bilancia Motivazione NB è la sigla che indica Nutrient brodo Questi grammi si ottengono da una proporzione ( 8:1000 = x : 100 ) . Si eseguono questi calcoli poiché sul contenitore del terreno è riportato il valore 8 g / mL. Dopo aver pesato i grammi di terreno prendiamo una beuta e un cilindro . Questa vetreria ci consente di preparare il terreno. Con il cilindro preleviamo 100 mL di H2O distillata e li mettiamo nella beuta. Utilizziamo il cilindro per essere precisi. Accendiamo la piastra e poniamo la beuta sopra di essa. Questa operazione ci consente di preparare il terreno e di farlo diventare limpido . Mescoliamo ( fino a che i grammi di NB non si siano ben amalgamati) la soluzione con una bacchetta di vetro e aspettiamo, poi, che il terreno diventi limpido . Bisogna aspettare che il terreno diventi limpido perché a quel punto vuol dire che il terreno è sterile . Una volta pronto si chiude la beuta con del cotone e della carta stagnola. Si chiude la beuta con cotone e stagnola per preservare la sterilità del terreno. Mettiamo, successivamente, in autoclave il terreno preparato a 121° per 15 minuti . Tutto questo va fatto ad una atmosfera L’autoclave garantisce una maggior sterilità in quanto elimina eventuali batteri entrati durante la preparazione del terreno. Seminiamo, poi i batteri liofilizzati oppure utilizziamo 1 ml di un precedente coltura conservati in un ambiente asettico. Utilizziamo dei batteri liofilizzati poiché in pastiglia i batteri rimangono in una forma quiescente . Incubiamo la coltura limpida a 37 ° per 24 ore. A questa temperatura i batteri non si alterano . Preparazione del terreno per le provette : Il terreno deve avere la seguente sigla N.B in quanto deve essere un brodo. Prendiamo una beuta per preparare il terreno. Pesiamo con la bilancia tecnica 0,8 grammi di N.B. Questi grammi si ottengono da una proporzione ( 8:1000 = x : 100 ) . Si eseguono questi calcoli poiché sul contenitore del terreno è riportato il valore 8 g / mL. Con un cilindro graduato si misura 100 mL di acqua e si mette nella beuta. Nella beuta mettiamo anche i grammi di terreno precedentemente pesati. Accendiamo la piastra e mettiamo sopra la beuta . Mescoliamo la soluzione fino a quando non diventa limpida. Utilizzando l’NaCl cambiamo la concentrazione Aggiungere nella beuta NaCl per variare la concentrazione salina e quindi influenziamo con l’OSMOSI la salina del terreno .Le concentrazione di NaCl variano da crescita dei batteri. gruppo a gruppo ( 3 %, 6% , 10 %, 15 % e 20 % ) Alcuni prepareranno il bianco ed il controllo nel quale non Il bianco ci servirà per tarare lo spettrofotometro va versato l’ NaCl mentre il controllo ci servirà per osservare come è avvenuta la crescita dei batteri. Travasiamo in 7 provette 10 ml di terreno Prendere le provette preparate dagli altri gruppi In questo modo quando ci scambieremo le provette preparate ogni gruppo avrà tutte le concentrazioni. Siglare le provette In questo modo ogni gruppo ha 7 provette con concentrazioni saline differenti. Ci permetterà di riconoscere quali sono le nostre Riporre le provette in autoclave . Questa operazione ci garantisce una maggior sterilità in quanto nelle azioni precedenti potevano accidentalmente finire dei batteri Seminiamo 1 ml di coltura viva ( escherichia coli e stafilococchi ) nelle provette tranne in quella del bianco poiché in essa mettiamo 1 ml di acqua sterile . L’acqua sterile , nel bianco, la mettiamo con le micro pipette e i puntali sterili . Mettiamo le provette a 37 ° per 24 ore nell’incubatore Il bianco siccome ci serve per tarare lo spettrofotometro non deve avere batteri . Con le micro pipette riusciamo ad essere molto precisi e grazie ai puntali sterili continuiamo a garantire la sterilità del bianco A questa temperatura i batteri non si alterano Alla fine dell’esperienza si fanno 2 analisi : VISIVA : in questa analisi si deve controllare che il bianco non sia contaminato , verificare come sono cresciuti i batteri nel controllo e vedere come si sono comportati i batteri in base alla diversa concentrazione di sale posta in precedenza nel terreno . SPETTROFOTOMETRO: bisogna tarare con il bianco questo strumento poi andare con le altre provette 15 %, 10 % , 5 % ed infine con la provetta del controllo. Quando effettuo l’analisi devo osservare anche la torbidità dei vari terreni. Se il brodo è limpido non avviene l’assorbimento se , invece, è torbido la luce viene assorbita. Più torbido sarà il campione , maggiore sarà la sua assorbanza. Infine eliminare tutto in autoclave. L’autoclave ci garantisce la sterilità per questo è ottimo per eliminare i batteri. Si raccolgono i dati ottenuti dai vari gruppi e si confrontano Questa operazione serve per verificare se ci sono stati eventuali errori, per riflettere e migliorare.