TEC_CELL_4_2_ELISA

PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI
METODI COMPETITIVI
La misura della quantità di analita (An) è basata sulla competizione con il tracciante
(An*) per un numero limitato di siti anticorpali (Ab).
L’equilibrio che si instaura è:
KAn
An + Ab
+
An*
KAn*
An*-Ab
An-Ab
Le condizioni per l’esecuzione
del metodo sono:
[An*]i = costante
[Ab]i = costante
[Ab]i < [An]i + [An*]i
ELISA
understanding the acronym
• EL
Enzyme-Linked
– An enzyme’s activity is used as a “reporter” to test for the
presence/amount of a protein of interest.
– The enzymatic reaction will produce a colored species.
ELISA
understanding the acronym
• EL
• IS
Enzyme-linked
Immunosorbent
– An antibody or antigen (“immuno”) is adsorbed (“sorbent”) onto
the polystyrene wells in which we conduct the test.
ELISA
understanding the acronym
• EL
• IS
• A
Enzyme-linked
Immunosorbent
Assay
– We could determine the amount of (quantitative assay).
– We will use concentration standards to construct a standard
curve.
POSSIBILI FORMATI ANALITICI: piastre microtiter
In commercio sono disponibili numerosi kit su piastra microtiter a 96 pozzetti, spesso con
traccianti enzimatici e rivelazione colorimetrica. Il kit contiene la piastra con l’anticorpo
immobilizzato e tutti i reagenti pronti all’uso. E’ necessario disporre di pipette per la
dispensazione e di alcune attrezzature (lettore di micropiastre per la misura del segnale ed
eventualmente dispensatori, lavatori, ...)
384 wells
1536 wells
METODI COMPETITIVI ETEROGENEI
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) DIRETTO
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Antigene
Enzima
Tracciante
Substrato enzimatico
Anticorpo immobilizzato
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
Fase solida
METODI COMPETITIVI ETEROGENEI
Aggiunta del campione
SATURAZIONE
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODI COMPETITIVI ETEROGENEI
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODI COMPETITIVI ETEROGENEI
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODI COMPETITIVI ETEROGENEI
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODI COMPETITIVI ETEROGENEI
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODI COMPETITIVI ETEROGENEI
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODI COMPETITIVI ETEROGENEI
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI
COMPETITIVI
segnale
Per i metodi competitivi, il segnale diminuisce all’aumentare della
concentrazione di analita.
concentrazione analita
PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI
COMPETITIVI
Metodo immunometrico competitivo eterogeneo: il legame dell’analita
all’anticorpo viene rivelato indirettamente attraverso la misura del legame del
tracciante all’anticorpo.
1
2
tracciante
3
analita
aggiunta
reattivi
4
Tracciante legato
separazione
libero
legato
1
2
reazione
0
4
Conc. analita
16
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH”
Aggiunta del campione
Antigene
Enzima
Tracciante
Incubazione
Aggiunta del tracciante
Lavaggio
Anticorpo di
rivelazione
Substrato enzimatico
Anticorpo di cattura immobilizzato
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
Fase solida
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
SATURAZIONE
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH”
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH”
Aggiunta del campione
Incubazione
Aggiunta del tracciante
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH”
Aggiunta del campione
Incubazione
Aggiunta del tracciante
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH”
Aggiunta del campione
Incubazione
Aggiunta del tracciante
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH”
Aggiunta del campione
Incubazione
Aggiunta del tracciante
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH”
Aggiunta del campione
Incubazione
Aggiunta del tracciante
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH”
Aggiunta del campione
Incubazione
Aggiunta del tracciante
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH)
DIRETTI
INDIRETTI
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO
DTERMINAZIONE DELLA FERRITINA NEL SIERO UMANO
+
Ab monoclonali ani-ferritina
+
Ferritina presente nel
campion/stadards/controllo
60 min
37 °C
+
30 min
25 °C
Lettura del segnale a 492 nm
Colorazione giallo-arancione
Ab anti-ferritina
marcato con HRP
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO
DTERMINAIONE DELLA FERRITINA NEL SIERO UMANO
CARATTERISTICHE DEL METODO
• Limite di misura = la più piccola concentrazione in ferritina
significativamente differente dal valore dello standard O
con una probabilità del 95% = 2 ng/ml
• Specificità:
ferritina di milza umana 100% di reazione crociata
ferritina di fegato umano 112% di reazione crociata
ferritina di cuore umano 62% di reazione crociata
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Anticorpo
Enzima
Tracciante
Anticorpo
speciespecifico
Substrato enzimatico
Antigene di cattura immobilizzato
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
Fase solida
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI
Saturazione
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
STRATEGIE DI RIVELAZIONE DI UN ANTICORPO
Marcatura diretta
Rivelazione
mediante un
anticorpo secondario
marcato
Ab anti-specie X
marcato
Ab ottenuto nella
specie X
Streptavidina marcata
Rivelazione mediante un anticorpo
secondario rivelabile con un opportuno
reagente
Ab anti-specie X
biotinilato
Ab ottenuto nella
specie X
The Global Pregnancy Testing Market was valued
$1121 million in 2015 and estimated to reach $ 1410 million by 2020 growing at a CAGR of 4.7 %.
Pregnancy tests are tests used to detect the presence of reproductive hormones such as Follicle
Stimulating Hormone or Luteinising Hormone.
Fertility rapid test kits help to find the exact day of ovulation or confirm the presence of menopause in
women where as they are used to detect the sperm count.
DISPOSITIVI LATERAL FLOW
I dispositivi lateral flow (LFD), spesso denominati “strip”, sono metodi analitici
immunocromatografici.
I reagenti si trovano normalmente incorporati nel dispositivo, rendendo le
strip idonee per un’analisi da campo, grazie alla loro praticità d’uso da parte
di chiunque e in qualunque situazione.
Sono spesso meno precisi di altre metodiche di screening basate su saggi
immunologici come gli ELISA, ma possono essere sufficientemente sensibili,
quantitativi ed accurati quando appoggiati ad un sistema di lettura strumentale.
Un tipico LFD è formato da
- un sample pad dove viene deposto il campione
- un conjugate pad in cui è adsorbito il tracciante,
- una membrana dove avviene la reazione di legame del saggio sul quale ci sono due siti attivi,
uno per il test e uno di controllo,
- ed infine da un absorbent pad responsabile del direzionamento del flusso attraverso la
membrana.
POSSIBILI FORMATI ANALITICI: lateral-flow
immunoassay
Permettono un’analisi qualitativa o semiquantitativa molto rapida:
C
T
C
T
- Il campione viene aggiunto ad una
estremità (S)
- fluisce lungo la membrana per effetto di
capillarità,
S
Negativo
S
Positivo
- Successivamente, si raggiunge la zona di
cattura dell’analita (T) e la zona di
controllo (C)
Lateral flow test, IMMUNOSTRIP
Control line. Antibodies anti-IgG
adsorbed
Antibodies anti-antigen conjugated
with enzyme
Test line. Antibodies anti-antigen
adsorbed
Lateral Flow test,
IMMUNOSTRIP
The antibodies are binded to their antigen in the sample and the
complex antigen-antibody moves by capillarity towards the
reaction lines.
Lateral Flow test,
IMMUNOSTRIP
Antigen binds to the antibodies that
are in the test line.
Free antibodies bind to the antibodies
anti-Ig present in the control line.
LATERAL-FLOW IMMUNOASSAY
DETERMINAZIONE SEMIQUANTITATIVA DELLA MICROALBUMINA NELLE URINE
Principio immunologico: anticorpi monoclonali specifici per l'albumina
umana (immunoglobulina G)
Marcatore: oro colloidale
Linearità: da negativo a 100 mg/l
Intervalli di lettura:
- da negativo a 20 mg/l
- da 20 a 50 mg/l
- da 50 a 100 mg/l
- superiore a 100 mg/l
Stabilità del colore di reazione: fino a 5 minuti
Performance del test:
- sensibilità: 95 % a 15 mg/l; 97% a 20 mg/l
- specificità: 93% a 15 mg/l; 72% a 20 mg/l
- valore predittivo positivo: 97% a 15 mg/l; 84% a 20 mg/l
- valore predittivo negativo: 88% a 15/mg/l; 94% a 20 mg/l
Stabilità test confezionato: 18 mesi dalla data di confezionamento
Temperatura di conservazione del flacone: compresa tra +2 °C e + 30
°C
Fattori di interferenza:
- nel raccoglitore urine: disinfettanti ad alto potere ossidante
- nel campione: presenza di ossitetraciclina (incremento dei valori del
15%)
Certificazione ISO 9002
Conformità direttiva 98/79/CEE