La MICROSCOPIA
è mettere sulla stessa linea di mira
la testa, l'occhio e il cuore
Ingrandimento
Lunghezza focale
I = Q/P
F1 = P*Q/P+Q
Lente convergente
B
F1
A
F2
Q
P
L’immagine si forma per la proprietà della lente di:
•deviare un raggio di luce parallelo al proprio asse ottico facendolo passare
per il fuoco
•lasciare inalterato il cammino dei raggi che passano per il centro ottico.
la luce
raggi g
raggi x ultravioletto Infrarosso microonde onde radio
OTTICA GEOMETRICA: LEGGI FONDAMENTALI
Le leggi della riflessione e della rifrazione
Riflessione:
l'angolo di incidenza e quello riflesso sono uguali: q1 = q’1
Rifrazione:
l'angolo di incidenza e quello rifratto è il rapporto tra la velocità della luce nel vuoto e
nel mezzo
Sin q1
N2
=
N1
Sin q2
LENTI SOTTILI
Le lenti sono oggetti che servono a deviare in maniera controllata i raggi di luce.
Sono perciò fatte con materiali trasparenti aventi indici di rifrazione diversi da quello
dell'aria.
Hanno due superfici di cui almeno una e curva, mentre una delle due facce può
essere anche piana (raggio di curvatura infinito).
La retta congiungente i centri di curvatura delle due calotte
sferiche e detta asse ottico.
COSTRUZIONE dell’ IMMAGINE
La costruzione geometrica dell'immagine viene eseguita in base alle 3 seguenti
regole:
a) i raggi che passano per il centro della lente (O), definito come l'intersezione del
piano della lente con l'asse ottico, non vengono deviati;
b) i raggi paralleli all'asse ottico sono deviati dalla lente in modo tale da passare
per il fuoco a “valle”
c) In raggi che attraversano il fuoco “ a monte” proseguono paralleli all'asse della
lente
Ingrandimento
Lunghezza focale
I = Q/P
F1 = P*Q/P+Q
Lente convergente
B
F1
A
F2
Q
P
L’immagine si forma per la proprietà della lente di:
•deviare un raggio di luce parallelo al proprio asse ottico facendolo passare
per il fuoco
•lasciare inalterato il cammino dei raggi che passano per il centro ottico.
MICROSCOPIO SEMPLICE
L'interposizione di una lente convergente di piccola distanza focale f (microscopio
semplice o lente di ingrandimento) tra occhio ed oggetto e in grado di produrre un buon
valore di ingrandimento
L'oggetto AB posto tra il fuoco F1 e la lente produce un'immagine diritta virtuale
A'B' che viene vista dall'occhio sotto l'angolo 2w
MICROSCOPIO COMPOSTO
Con il termine microscopio usualmente si vuole indicare il microscopio composto,.
Il microscopio composto e formato da due lenti convergenti: la prima, quella più
vicina all'oggetto da esaminare, ne forma un'immagine reale capovolta e viene
chiamata obiettivo, mentre la seconda, quella più vicina all'occhio del
microscopista, viene chiamata oculare e forma un'immagine virtuale ingrandita
della precedente immagine reale, con la quale condivide l'orientamento. L'occhio
vede l'immagine virtuale, la quale risulta capovolta (= ruotata di 180) rispetto
all'oggetto da esaminare.
Tutti i sistemi ottici, inclusi i microscopi ottici
i microscopi in fluorescenza, il microscopio
confocale e il 2 fotoni, sono limitati nella loro
risoluzione da una serie di fondamentali fattori
fisici
Risoluzione
raggi g
raggi x ultravioletto Infrarosso microonde onde radio
d = 0.61l / NA
d = l /2N (sin a)
d = l /2N (sin a)
d= 0.61l / N.A.
a
Aberrazione di sfericità
Aberrazione cromatica
Profondità di campo
Steps to improve depth of field
•Reduce NA by closing down aperture diaphragm, or use
a lower NA objective lens.
•Lower the magnification for a given NA.
•Use a high-power eyepiece with a low-power, high-NA
objective lens.
•Reduce zoom factor.
•Use the longest possible wavelength light.
R = l/2n(sin(q))
NA= n(sin(q))
Un normale condensatore di Abbe
produce un fascio illuminante a
forte apertura. Il campo
illuminato è però piccolo (il cono di
luce si restringe molto verso il
basso).
Avendo inserito sotto al
condensatore la forte lente
convergente (LGC), l’apertura
diminuisce ma il fascio si allarga.
Questo concorda con le esigenze
dei piccoli ingrandimenti.
Nelle foto che precedono, il fascio
emergente dal condensatore sfiora
un cartoncino bianco
disposto verticalmente sopra al
tavolino.
Diaframma di campo
Diaframma di apertura
Köhler Illumination
Köhler Illumination
Condenser Alignment
Phase Contrast Microscope Configuration
Darkfield Illumination
Microscopio elettronico a trasmissione
Fluorescenza
Excited lifetime 10-15 to 10-9 sec
Excited state
2
Absorbed light
High energy
Loss of energy
Emitted light
excitation
1
3
emission
Ground State
Low energy
Fluorophore
Excited fluorophore
in ground state
Photobleaching
Cycling
of fluorescence
excitation
absorption
destruction
emission
Ground state
Filtro di emissione
Beam Splitter
Filtro di eccitazione
Small
Medium
Large
