microscopia - I blog di Unica
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La MICROSCOPIA è mettere sulla stessa linea di mira la testa, l'occhio e il cuore Ingrandimento Lunghezza focale I = Q/P F1 = P*Q/P+Q Lente convergente B F1 A F2 Q P L’immagine si forma per la proprietà della lente di: •deviare un raggio di luce parallelo al proprio asse ottico facendolo passare per il fuoco •lasciare inalterato il cammino dei raggi che passano per il centro ottico. la luce raggi g raggi x ultravioletto Infrarosso microonde onde radio OTTICA GEOMETRICA: LEGGI FONDAMENTALI Le leggi della riflessione e della rifrazione Riflessione: l'angolo di incidenza e quello riflesso sono uguali: q1 = q’1 Rifrazione: l'angolo di incidenza e quello rifratto è il rapporto tra la velocità della luce nel vuoto e nel mezzo Sin q1 N2 = N1 Sin q2 LENTI SOTTILI Le lenti sono oggetti che servono a deviare in maniera controllata i raggi di luce. Sono perciò fatte con materiali trasparenti aventi indici di rifrazione diversi da quello dell'aria. Hanno due superfici di cui almeno una e curva, mentre una delle due facce può essere anche piana (raggio di curvatura infinito). La retta congiungente i centri di curvatura delle due calotte sferiche e detta asse ottico. COSTRUZIONE dell’ IMMAGINE La costruzione geometrica dell'immagine viene eseguita in base alle 3 seguenti regole: a) i raggi che passano per il centro della lente (O), definito come l'intersezione del piano della lente con l'asse ottico, non vengono deviati; b) i raggi paralleli all'asse ottico sono deviati dalla lente in modo tale da passare per il fuoco a “valle” c) In raggi che attraversano il fuoco “ a monte” proseguono paralleli all'asse della lente Ingrandimento Lunghezza focale I = Q/P F1 = P*Q/P+Q Lente convergente B F1 A F2 Q P L’immagine si forma per la proprietà della lente di: •deviare un raggio di luce parallelo al proprio asse ottico facendolo passare per il fuoco •lasciare inalterato il cammino dei raggi che passano per il centro ottico. MICROSCOPIO SEMPLICE L'interposizione di una lente convergente di piccola distanza focale f (microscopio semplice o lente di ingrandimento) tra occhio ed oggetto e in grado di produrre un buon valore di ingrandimento L'oggetto AB posto tra il fuoco F1 e la lente produce un'immagine diritta virtuale A'B' che viene vista dall'occhio sotto l'angolo 2w MICROSCOPIO COMPOSTO Con il termine microscopio usualmente si vuole indicare il microscopio composto,. Il microscopio composto e formato da due lenti convergenti: la prima, quella più vicina all'oggetto da esaminare, ne forma un'immagine reale capovolta e viene chiamata obiettivo, mentre la seconda, quella più vicina all'occhio del microscopista, viene chiamata oculare e forma un'immagine virtuale ingrandita della precedente immagine reale, con la quale condivide l'orientamento. L'occhio vede l'immagine virtuale, la quale risulta capovolta (= ruotata di 180) rispetto all'oggetto da esaminare. Tutti i sistemi ottici, inclusi i microscopi ottici i microscopi in fluorescenza, il microscopio confocale e il 2 fotoni, sono limitati nella loro risoluzione da una serie di fondamentali fattori fisici Risoluzione raggi g raggi x ultravioletto Infrarosso microonde onde radio d = 0.61l / NA d = l /2N (sin a) d = l /2N (sin a) d= 0.61l / N.A. a Aberrazione di sfericità Aberrazione cromatica Profondità di campo Steps to improve depth of field •Reduce NA by closing down aperture diaphragm, or use a lower NA objective lens. •Lower the magnification for a given NA. •Use a high-power eyepiece with a low-power, high-NA objective lens. •Reduce zoom factor. •Use the longest possible wavelength light. R = l/2n(sin(q)) NA= n(sin(q)) Un normale condensatore di Abbe produce un fascio illuminante a forte apertura. Il campo illuminato è però piccolo (il cono di luce si restringe molto verso il basso). Avendo inserito sotto al condensatore la forte lente convergente (LGC), l’apertura diminuisce ma il fascio si allarga. Questo concorda con le esigenze dei piccoli ingrandimenti. Nelle foto che precedono, il fascio emergente dal condensatore sfiora un cartoncino bianco disposto verticalmente sopra al tavolino. Diaframma di campo Diaframma di apertura Köhler Illumination Köhler Illumination Condenser Alignment Phase Contrast Microscope Configuration Darkfield Illumination Microscopio elettronico a trasmissione Fluorescenza Excited lifetime 10-15 to 10-9 sec Excited state 2 Absorbed light High energy Loss of energy Emitted light excitation 1 3 emission Ground State Low energy Fluorophore Excited fluorophore in ground state Photobleaching Cycling of fluorescence excitation absorption destruction emission Ground state Filtro di emissione Beam Splitter Filtro di eccitazione Small Medium Large
