Le piante
transgeniche
Trasformazione genetica
Un processo mediante il quale un fenotipo di un organismo
può essere cambiato attraversi l’aggiunta di DNA esogeno
L’organismo così generato è chiamato transgenico o
Genetically Modified Organism (GMO)
Utilizzo e valore delle piante transgeniche
Agricoltura
•
Miglioramento genetico
•
miglioramento delle peformance
‘Farmaceuticals’ / ‘Neutraceuticals’
•
nuove colture per nuovi prodotti
•
piante ‘factories’ o ‘bio-reattori’
Ambiente
•
•
riduzione uso pesticidi
Bioremediation / phytoremediation
Modificazione delle piante: steps
1. Clonaggio (creazione della cassetta d’espressione del
transgene)
2. Trasformazione (via Agrobacterium o altro metodo)
3. Selezione piante trasformate (uso di marcatori selettivi)
4. Screening del materiale con appropriata espressione
genica
5. Isolamento delle linee omozigoti
6. test delle piante ottenute (analisi molecolari e
d’espressione genica)
Modificazione delle piante: clonaggio
Gene reporter/selettivo
Gene d’interesse
Elementi controllo espressione
(es. Green Florescent Protein o
(es. tolleranza ad erbicidi o
genica
Resistenza ad antibiotici)
Resistenza a malattie)
(es. solo in foglia o in seme)
Generazione di piante Transgeniche
Agrobacterium tumefaciens
Microiniezione
Biolistico
Come vengono prodotte le piante transgeniche
Molto diffusa la trasformazione via Agrobacterium
• Funzione per la maggior parte delle dicotiledoni e per alcune
moncotiledoni
• non necessita di attrezzature specifiche e può essere utilizzato in
qualsiasi laboratorio
L’ Agrobacterium: un ingegnere naturale
•L’ Agrobacterium tumefaciens è un batterio
del suolo che causa la formazione di tumori
(crown gall) nelle piante
•Contiene il plasmide
Ti (Tumor-inducing
plasmid)
•Il plasmide Ti possiede una regione di
DNA, il T-DNA (Transferred-DNA), che
viene incorporato nel DNA nucleare della
painta infettata
Ti Plasmid
• geni vir: essenziali per il trasferimento
e l’integrazione della regione T-DNA
T-DNA region
•Auxine iaaM e iaaH : sintetizzano gli
ormoni auxicini della crescita (acido
indolacetico)
Cytokinin
Auxin
Left border
Opine
•Citochinine - gene tmr (ipt): genera
la citochinina trans-zeatina.
Promuovono la crescita cellulare e
la formazione delle galle
Right border
12-24 kbp
Opine
catabolism
vir genes
ori
•Opine: sono prodotti di reazioni di
condensazione tra aminoacidi e keto
acidi (es. nopaline, octopine, agropine).
Sintetizzate e secrete dalle galle sono
utilizzate come fonte di carbonio
dall’Agrobacterium
Manipolazione genetica del plasmide Ti
•La delezione dei geni auxinici e delle citochinine elimina
•Sono stati inseriti dei marcatori selettivi batterici
la formazione delle galle
di E. coli (selectable shuttle
vector) al di fuori della regione T-DNA
•Inserimento di marcatori selettivi per pianta all’interno della regione T-DNA
•Qualsiasi gene viene inserito
all’interno della regione T-DNA sarà
incorporato nel DNA della cellula
vegetale (es. geni di resistenza ad
erbicidi)
•Le cellule vegetali trasformate
vengono rigenerate come pianta
intera attraverso la coltura in vitro.
•Ogni cellula della nuova pianta
conterrà il transgene
Il Trasferimento del T-DNA da Agrobacterium a cellula vegetale
Agrobacterium
Cellula
vegetale
Nucleo
Ti plasmid
Il Trasferimento del T-DNA da Agrobacterium a cellula vegetale
ferita
Cellula
vegetale
Nucleo
Ti plasmid
Agrobacterium
Il Trasferimento del T-DNA da Agrobacterium a cellula vegetale
Agrobacterium
Segnale
di ferita
Cellula
vegetale
nucleo
Copia di T-DNA a singolo filamento
(protetto da “ssDNA binding protein”)
Il Trasferimento del T-DNA da Agrobacterium a cellula vegetale
Agrobacterium
Segnale
di ferita
Cellula
vegetale
Nucleo
poro
Copia di T-DNA a singolo filamento
(protetto da “ssDNA binding protein”)
T-DNA
Chromatina
Rigenerazione delle piante
•L’agrobatterio viene inoculato
sul tessuto vegetale
•Il tessuto viene messo in
coltura in piastre contenenti un
antibiotico selettivo
•I calli (tessuti indifferenziati)
vengono trasferiti in un altro
mezzo di coltura contenete
ormoni di crescita che inducono
la formazione di germogli e/o
radici
•Si può effettuare un controllo
dei calli trasformati prima della
loro rigenerazione attraverso
un’analisi molecolare (es. PCR)
Bombardamento con Microproiettili (biolistico)
•Proiettili sferici di oro o tungsteno (0.4 – 1.2m dia.)
vengono ricoperti con il DNA
•Questi proiettili vengono sparati ad alta velocità (3-600
metri/sec) mediante un’apparecchiatura (particle gun)
utilizzando aria compressa o gas compresso (elio)
•Il proietticle penetra la parete cellulare e le membrane
(trasformazione d cloroplasti o mitocondri)
•Possono essere trasformate un gran numero di specie
(anche monocotiledoni) che non sono suscettibili al
trasferimento di DNA via Agrobacterium.
•Questo metodo può essere utilizzato anche per
sospensioni cellulari, colture di calli, tessuti meristematici,
embrioni immaturi, coleoptili e polline.
Il transgene: RNA Antisenso
Questa tecnica viene utilizzata normalmente nelle piante per bloccare
l’espressione di geni endogeni.
Frammenti clonati di geni vengono posti nel trasgene in
orientamento inverso vicino ad un promotore.
Quando questo transgene antisenso viene reintrodotto nelle cellule
vegetali previene in qualche modo la produzione della proteina
endogena.
Non si ha un copleto knock-out del gene . Si può avere una debole
o una maggiore produzione della proteina.
Alterazione della maturazione dei frutti mediante RNA Antisenso
La Poligalatturonase (PG) è un enzima che abbassa la pectina nelle pareti dei
frutti in maturazione
Attività PG
Frutto Wildtype
Frutto PG
Antisenso
0
2
4
6
8 10
Giorni dal primo cambiamento del colore
Le piante transgeniche con PG
antisenso (FLAVR SAVR tomato)
producono poco PG. Le pareti si
ammorbidiscono molto
lentamente
Molti geni sono stati manipolati
in modo analogo per rispordere
ad alcune questioni basilari:
- qual’è il ruolo degli ormoni
nella maturazione dei frutti?
- quali enzimi agiscono nella
parete dei frutti ?
Il transgene: RNAi
Una tecnica,che merita particolare
attenzione, e che è stata introdotta solo di
recente, è quella che permette di interferire
con l’espressione di alcuni geni dannosi
mediante la trasfezione di piccoli frammenti
di RNA a doppio filamento in grado di
antagonizzare l’RNA messaggero
corrispondente (“ RNA INTERFERENCE”).
La tecnologia dell’RNAi è basata su un
processo di inattivazione genica posttrascrizionale, altamente specifico,
presente in piante e animali, innescato da
RNA a doppia elica (dsRNA) omologo alla
sequenza del gene da sopprimere.
Diffusamente utilizzato in
Caenorhabditis (nematode) – lavora
anche in Drosophila, nei trypanosomi e
in pianta
RNAi
In questo fiore un gene che controlla la
produzione di pigmento viola è stato
disattivato mentre il fiore era in crescita. Le
cellule che si sono sviluppate dopo questo
intervento risultano bianche in quanto I
pigmenti viola non venivano più prodotti.
Courtesy of Dr. Richard Jorgensen, University of Arizona.
RNAi
Il gene FLC quando viene silenziato produce precocemente I fiori
in quanto la sua funzione è proprio quella di reprimere la fioritura.
(Wesley et al., 2001, Plant J. 27: 581-590).
Chalcone synthase gioca un ruolo nella formazione dei pigmenti in pianta. Il
suo silenziamento produce semi giallo pallido (Wesley et al., 2001, Plant J.
27: 581-590).
EIN-2 è un gene responsabile della percezione dell’etilene gene (Wesley
et al., 2001, Plant J. 27: 581-590).
GUS è il gene reporter molto utilizzato (Wesley et al., 2001, Plant J. 27: 581590).
Phytoene desaturase è un gene che quandi viene silenziato forma piante
bianche. Questo perchè I carotenoidi prevengono il fotosbiancamento
della clorofilla. (Helliwell et al., 2002, Functional Plant Biology, 29: 12171225).
Il transgene: Gene ‘stacking’ o ‘pyramiding’
Utilizzato già nel breeding tradizionale delle piante (“Gene stacking” è la
combinazione attraverso l’incrocio e la selezione della pregenie di tratti
desiderati in un’unica linea)
Biotecnologie : nuove strategie di co-espressione
Quando è necessario co-esprimere geni multipli
•pathway biochemiche
•enzimi multimerici
•proteine multiple che controllano diversi ‘choke points’ nelle
biosintesi
.
Miglioramento della tolleranza in pianta di stress abiotici
clima
Suolo
Temperatura (caldo, freddo)
Disponibilità di nutrienti
Idrico (siccità, asfissia)
Acidità e alcalinità
Stimoli meccanici (vento)
luce
troppa
poca
Inquinanti
Metalli pesanti
Ozono
Applicazione prodotti
chimici
erbicidi
Erbicidi e problema delle infestanti
10% della perdita di produzione nelle colture è causata dale malerbe
> $10 billioni vengono spesi annualmente in erbicidi
Moltio erbicidi sono attivi contro le colture
- spesso devono essere distribuiti precocemente per precauzione
Molti erbicidi sono persistenti nel suolo o lasciano residui tossici
Il tillage (ploughing) può essere
utilizzato per il controlllo delle
malerbe ma può prvocare serie
perdite d’acqua
Modalità d’ingegnerizzazione per tolleranza ad erbicidi
•Esistono più di 100 diversi erbicidi con varie modalità d’azione
• Molti erbicidi agiscono interferendo con enzimi chiave
• Molti agiscono a livello di cloroplasti
•Le piante variano nel loro livello di sensibiltà agli erbicidi. Alcune sono capaci di:
(a) Produrre enzimi che inattivano erbicidi particolari
(b) Produrre un target alterato di enzimi, insensibili a particolari erbicidi
(c) Inibire l’uptake dell’erbicida
•Le colture possono essere ingegnerizzate per tolleranza aparticolari erbicidi
attraverso l’inserimento di singoli nuovi geni
La tolleranza ad erbicidi
è il tratto dominante delle colture GM coltivate a livello commerciale
74% di colture GM coltivate nel 2000 erano tollaranti ad erbicidi (HT)
7% ‘stacked transgenes’ (HT + Bt gene per resistenza ad insetti)
coltura
tratto
% delle colture
GM globali
soia*
HT
58%
colza
HT
6%
mais
HT
5%
cotone
HT
5%
cotone
HT+Bt
4%
mais
HT+Bt
3%
(* 36% della soia coltivata nel mondo è transgenica)
Colture tolleranti al Glyphosate
Le prime colture ingegnerizzate messe in commercio sono state quelle con
tolleranza all’erbicida glyphosate (Roundup)
Attualmente molte colture presentano inserito questo tratto transgenico
(soiia, mais, colza, cotone ecc)
Colza tollerante
Ingegnerizzazione per tolleranza a Glyphosate
Il Glyphosate inibisce un enzima cloroplastico essenziale nella biosintesi degli
aminoacidi :
5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimic acid synthase (EPSPS)
Non è stato possibile generare piante tolleranti al glyphosate attraverso
mutagenesi e seliezione tradizionale
Un mutante del gene EPSPS è stato isolato da Agrobacterium, che introdotto in
pianta conferisce tolleranza al glyphosate
EPSPS Transgene introdotto in pianta
Transit peptide from plant
gene added to allow
chloroplast import
promoter tp
Codon usage modified
for efficient expression
in plants
Agro. EPSPS
polyA+
Regulatory sequences recognised by plant (either from plant
gene or plant virus gene). In this case 35S CaMV promoter
Ingegnerizzazione tolleranza a Phosphinothricina
L-phosphinotricina è un ingrediente attivo negli erbicidi glufosinate / bialaphos
Questi erbicidi agiscono inibendo la glutamine synthetase (GS)
- GS necessaria per la sintesi di glutamine da glutamate e ammonio
- GS previene l’accumulo di ammonio a livelli tossici nelle cellule vegetali
H
HOOC
CH2
CH2
C
COOH
glutamate
NH2
O
CH3
P
OH
H
CH2
CH2
C
NH2
COOH
L-phosphinotricina
Piante tolleranti a Phosphinothricina
Non è stato possibile generare piante tolleranti al glyphosate attraverso
mutagenesi e seliezione tradizionale
- trasformare piante con un mutante GS insensibile alla phosphinotricina
- trasformare il gene delle piante per un enzima che inattiva la phosphinotricina
I geni batterici (pat o bar ) che codificano per phosphinothricin acetyl
transferase sono stati trasferiti in pianta
detossificano L-phosphinotricina attraverso acetilazione, così GS non è inibita
Coltivazioni commerciali di Cicoria, rape e mais tolleranti a Phosphinothricina
Tolleranza a Phosphinotricina Introdotta in pianta
Codon usage modified for efficient expression in plants
promoter
Bacterial pat
polyA
Regulatory sequences recognised by plant
(either from plant gene or plant virus gene).
Frequently use 35S CaMV promoter
Tolleranza a stress ambientali
Il progresso per gli stress ambientali attraverso il breeding classico è andato
molto lentamente
Crop
Abiotic losses
(% record yield)
Maize
Wheat
66%
82%
Soyabean
69%
Sorghum
Oat
81%
75%
La tolleranza di solito coinvolge molti geni e processi fisiologici
L’approccio transgenico ha dovuto sffrontare anche questi problemi ma alcuni
progressi sonos stati fatti anche se ancora non ci sono piante in commercio
Risposta della pianta allo stress
Ozono
Riconoscimento
stress
Temperature
estreme
Stress
transduction
asfissia
Alterazione
Espressione
genica
siccità
Alterazione
metabolismo
salinità
Risposte
fisiologiche/
sviluppo
Risposta della pianta allo stress
?
?
Ca2+
Hormones
Fattori di transcrizione
Riconoscimento
stress
Stress
transduction
Alterazione
Espressione
Caratteri multigenici
genica
Alterazione
metabolismo
Es.
•Antiossidanti prodotti in risposta a molti stress per detossificare dai radicali liberi
(reactive oxygen species -ROS)
•Soluti compatibili (osmo-protectants) sostanze osmoprotettive prodotte da
alcune piante in risposta a stress osmotici come siccità e salinità
•heat-shock proteins (HSPs) accumulate in seguito a stress da calore
Resistenza a siccità/salinità
Trehalosio è un osmoprotettivo contro stress ambientali:
congelamento, salinità, caldo e essiccazione.
Il Trehalose (1--D-glucopyranosyl-glucopyranoside) è
sintetizzato in due steps nei lieviti.
Zygosaccharomyces rouxii è uno dei lieviti più osmotolleranti, specialmente al sale.
Kwon, S.J., Hwang, E.W. & Kwon, H.B. (2004). Genetic engineering of drought
resistant potato plants by co-introduction of genes encoding trehalose-6phosphate synthase and trehalose-6-phosphate phosphatase of
Zygosaccharomyces rouxii. Korean J. Genet. 26, 199-206.
Patate transgeniche mofologicamente uguali ai
parentali
NS ter
NS prom
nptII
LB
trehalose-6-P synthase
CaMV
35S
trehalose-6-P phosphotase
2A
RB
Piante transgeniche per resistenza a malattie
Impatto delle malattie sulle colture
La colture sono spesso coltivate in modo estensivo e in monocoltura.
Incremento del rischio di malattie epidemiche
Le malattie limitano in modo significativo la produttività e richiedono sostanziali
apporti di prodotti chimici.
Crop
Biotic losses*
(% average yield)
Maize
Wheat
Soyabean
Sorghum
Oat
42%
39%
41%
37%
54%
* Biotic losses include diseases, insects and weeds
Breeding tradizionale
•insetti e funghi sono molto più distruttivi di virus e batteri
•In alcuni casi, con il breeding tradizionale si è potuto introdurre geni di
resistenza da specie selvatiche a specie coltivate.
• Per alcune malattie non sono stati trovati geni di resistenza efficaci e durevoli
•Riduzione della suscettibilità ai geni di resistenza
continua necessità di ricerca fonti di gene di
resistenza
Vantaggi delle Transgeniche
Nessuna restrizione legata ad incompatibilità sessuale
Introduzione di resistenze in specie che in natura non presentano fonti di
resistenze
Colture GM per resistenza ad insetti e virus sono commercializzate in USA
Transgenic insect and viral resistant crops are already grown commercially in
US e altri Paesi:
- mais, cotone, patata, pomodoro resistente ad insetti
- patata, papaya, zucchini resistenti a virus
Resistenza ad insetti
La resistenza ad insetti è il secondo più importatnte tratto tansgenico nelle colture
commerciali GM
19% delle colture GM per resistenza ad insetti contengono il gene Bt
Un’altro 7% sono Bt + tolleranza ad erbicidi
Crop
Trait
% of global
GM crops
Maize
Bt
15%
Cotton
Bt + HT
4%
Cotton
Bt
3%
Maize
Bt + HT
3%
Tossine Bt
Le tossine prodotte da Bacillus thuringiensis uccidono solo gli insetti
Diversi ceppi di Bacillus thuringiensis producono diverse tossine, ciascuna attuiva solo
per uo o poche specie d’insetti.
Le spore batteriche o isolati della
tossina sono già disponibili come
insetticidi organici
Tossine Bt
Tossine prodotte nelle spore, e formano
cristalli proteici
Le tossine codificate da geni
Cry
Attività della tossina;
• protossina è digerita nell’intestino da proteasi +
pH alcalino
• protossina si lega ad un sito specifico sulla
parete intestinale
• avvengono ulcerazioni e diminuisce l’appetito
• si ha la rottura della parete intestinale, larve
muoiono
Colture Bt
Alcune colture (cotone, mais, patata ecc.) sono state trasformate con diverso
geni Cry che producono tossine attive contro alcuni erbivori. Ad oggi sono
stati utilizzati più di 40 diversi geni Cry
Codon usage modificato per
un’efficiente espressione in
pianta
promotore
Bt Cry
polyA
Sequenze regolatrici riconosciute dalla pianta
Colture Bt
Regole di conduzione per minimizzare l’insorgenze di resistenza a Bt
1. 20% mais non-BT (50% cotone non-Bt) in campo;
2. Monitoraggio
Introduzione di resistenze multiple
incremento dei livelli d’espressione
impatto con insetti non-target: ‘buffer zone’ di mais non Bt intorno a mais BT
‘Transgenic pollen harms monarch larvae". J.E. Losey et al., Nature 20 May
1999 (correspondence). È stato molto criticato per dati riferiti ad un solo anno,
per uso di larve molto suscettibili.I lavori attuali riportano pochi se non effetti nulli,
giusta comparazione con campi trattati con insetticidi
Resistenza a Virus
“RNA-mediated interference”: si basa sull’espressione di geni
patogeno-derivati o da frammenti di geni (es. Resistenza patogeno
derivata)
Interferisce con I normali processi patogenici del microbo sia a livello proteico
(resistenza virale e batterica) sia a livello di RNA ( solo resistenza virale).
“Protein-mediated interference”:
- espressione di una tossina derivata batterica, inattivando l’enzima per
controllare specifici Pseudomonas
- espressione costitutiva di “coat protein” virali (CPs) o proteine di
movimento (MPs) per la protezione di piante a virosi.
Non si conosce bene il meccanismo d’interferenza mediata dalle proteine.
- necessari livelli di espressione elevati di “coat protein”
Papaya ringspot virus (PRV)
Questo virus ha avuto un enorme impatto in Hawaii , con forti riduzioni nella
produzione di frutti freschi
Non esistono in natura geni di resistenza a questo virus, e senza la produzione di
papaya transgenica la produzione industriale nelle Hawaii potrebbe essere distrutta.
Dal 1996 nelle hawaii si coltiva papaya PRV resistente.
Resistenza a PRV in Papaya
Il gene della coat protein di viene espresso mediante il
promotore 35S CaMV.
La papaya è stata trasformata attraverso metodo biolistico.
promoter
PRV coat protein gene
polyA+
Regulatory sequences recognised by plant
(either from plant gene or plant virus gene).
In this case 35S CaMV promoter and terminator
Questo gene conferisce resistenza parziale a PRV in una varietà (‘Rainbow’) e
resistenza completa in un’altra (‘SunUp’)
Gli agricoltori gestiscono la coltivazione con molta cura per minimizzare la
pressione di selezione sui virus per il mantenimento della resistenza.
Would it surprise you to know
that saving a crop from a virus
helped save a community from
disaster? Through advancements
in plant biotechnology, researchers
developed a type of papaya that
is resistant to a virus that was
destroying Hawaii’s crops. This
healthier plant not only kept
Hawaiian farming communities
in business, it also resulted in an
increase in papaya production.
And its just one example of how
crops enhanced by plant biotechnology could one day help
feed an ever-increasing world
population. The research is ongoing and the facts are there to be
examined. If you want to learn more
we invite you to call us or visit our
web site: www.whybiotech.com
Council for Biotechnology Information
Resistenza multipla a virus in zucchini
Geni “Coat protein” per 3 virosi (cucumber
mosaic virus CMV; zucchini yellow mosaic virus
ZYMV; watermelon mosaic virus 2 WMV 2) sono
stati introdotti in Cucurbita pepo
- tutti espressi dal promotore 35S CaMV
ZYMV CP
LB
nptII
Prom
CMV CP
WMV 2 CP
t
t
Prom
Prom = promoter
t = terminator
protegge contro I 3 virus
Prom
RB
t
Resistenza a virus in pianta
Transcapsidazione
Se la pianta viene infettata da un’altro virus questo potrebbe essere
incorporato nel capside codificato dal transgene provocando un
mascheramento virale.
•La coat protein introdotta sarà sufficiente a produre il mascheramento?
•Se ciò si verifica si possono avere nuove proprietà biologiche?
Sinergia
Se la pianta viene infettatabda un’altro virus, si possono avere
manifestazioni di sintomi più gravi a causa della presenza della coat
protein?
Ricombinazione
La frequenza del fenomeno potrebbe ssere incrementata? Si
possono avere nuovi ricombinanti?
Quale futuro?
Miglioramento del
valore nutrizionale
degli alimenti
Modificazioni nutrizionali
Miglioramento del contenuto proteico e qualitativo
Incremento delle vitamine, antiossidanti, ferro e altri minerali ecc.
Rimozione dei fattori antinutrizionali quali inibitori delle proteasi e lecitine.
Remove anti-nutritional factors e.g. protease inhibitors, lectins
Modificazione del contenuto in grassi saturi.
Incremento/decremento di fenoli e fibre
Miglioramento qualitativo delle proteine
Animali and uomini devono incorporare 10 aminoacidi essenziali attraverso il
regime alimentare in quanto incapaci di produrli da se.
Il valore nutrizionale delle proeine di riserva delle sementi risulta spesso limitato.
posssono deficitare di uno o più aminoacidi essenziali per la salute umana
(es. Nei legumi perdita di cisteina e metionina)
Il bilanciamento aminoacidico nelle sementi è stato manipolato in laboratorio
mediante diverse strategie:
- introduzione di proteine di riserva nei semi da altre specie
- alterazione in vitro delle sequenze dei geni delle proteine di riserva
- manipolazione della pathway della biosintesi degli amino acidi per incrementarne
alcuni
Strategie simili sono state utilizzate per migliorare il contenuto e la composizione
proteica in colture no-food
‘Increased nutritive value of transgenic potato by expressing a
nonallergenic seed albumin gene from Amaranthus hypochondriacus’
Chakraborty et al., PNAS 97, 3724-3729 (2000)
La patata, la quarta coltura nel mondo, è utilizzata per produrre alimenti,
mangimi, amido e alcool.
Limitata in lisina, tirosina, metionina e cisteina
Patate trasformate con gene di Amaranthus hypochondriacus che codifica per la
produzione di albumina nei semi presentano un buon bilanciamento
aminoacidico
2 costrutti
alternativi.
Promotore
constitutivo o
tuberospecifico
p35S CaMV
AmA1
pGBSS
AmA1
Nos 3’
Nos 3’
pSB8
pSB8G
l’espressionei nei tuberi è da 5 a 10 volte maggiore quando si utilizza il promotore GBSS promoter piuttosto chi il 35S
Cambiamenti qualitativi proteici nelle patate transgeniche
contenuto in aminoacidi essenziali da 3 a 5 volte più elevato
Contenuto proteico totale incrementato del 35-45%
8-
Fold
increase
4-
1D E S G H R T A P Y V M C I L F K
Amino acid
Le piante producono il doppio rispetto al wild-type
L’albunia di Amaranthus non è allergenica :
- già utilizzata come farina in Messico e Sud America
- test iperallergenici condotti su animali come mangime non evidenziano reazioni allergiche
Vitamina A
La vitamina A (retinolo) è essenziale alla
crescita umana.
Il nostro corpo non produce vitamina A, e la
possiamo incamerare dalla dieta per due vie:
- 50% come pro-Vitamina A dei carotenoidi delle piante che viene convertita il
vitamina A nell’intestino.
- ingestione diretta da alimenti animnali e supplementi.
Tutti I carotenoidi che contendono anelli possono essere convertiti in retinolo,
e una delle più importanti pro-vitamine dei carotenoidi è il -carotene
Deficenza in vitamina A
400 milioni di persone sono a rischio per deficienza in vitamin A (VAD), in
particolare in Asia e Africa.
circa 2.5 milioni delle morti annue riguardano bambini sotto i 5 anni
VAD rende I bambini particolarmente suscettibili
ad infezioni.
0.5 milioni di bambini diventano cieci a causa
della VAD
Il ricorso a supplementi in
vitamina A è riuscito a
ridurre I problemi del 50%
nelle aree soggette, ma
ciò risulta molto oneroso e
non utilizzabile in tutte le
aree.
Pro-vitamina A in pianta
-carotene è un pigmento richiesto nella fotosintesi
- prodotto in tutti I tessuti verdi della pianta
- prodotto anche nell’endosperma del mais giallo e del sorgo
Il riso è una coltura fondamentale per la gran parte del modo ma la granella
di riso non produce vitamina A o il suo precursore, -carotene
La VAD è un problema molto serio nelle regioni in cui il
riso è la derrata alimentare principale; più del 70% di
bambini sotto I 5 anni ne sono affetti
La ricerca di mutanti di riso con -carotene neklla
granella è stata un insuccesso.
- alcune varietà di riso non lucido “unpolished rice’
(riso bruno e riso rosso) possono produre
vitamina A ma la gran parte di riso è lucido con
l’aleurone rimosso prima che diventi rancido
all’immagazzinamento.
Produzione del ‘Golden Rice’
Il progetto riguardante l’introduzione della provitamina A è durato 8 anni
Ingo Potrykus and Peter Beyer con fondi dell
Rockefeller Foundation e EU
inizialmente è stato mostrato che l’ultimo precursore della pathway dei carotenoidi
nell’endopserma del riso è il geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP)
Può arrichire in -carotene via 4 enzimi:
phytoene synthase, phytoene desaturase,
-carotene desaturase, lycopene cyclase
Questi geni sono stati isolati da narciso ed introdotti
in riso ad uno ad uno.
Produzione del ‘Golden Rice’
Geranyl geranyl
pyrophosphate (GGPP)
Phytoene
-carotene
Lycopene
ß-carotene
Produzione del ‘Golden Rice’
Geranyl geranyl pyrophosphate (GGPP)
1° esper.mostrava che
riso transgenico
espirmente PS di
narciso era normale,
fertile and produceva
phytoene
Phytoene
synthase
Phytoene
Phytoene
desaturase
-carotene
(1)
Si può deviare la pathway
verso il -carotene
(2) Incanalare la GGPP via da
altre pathways nion ha
effetti dannosi
Erwinia
uredovora
double
desaturase
crtI
-carotoene
desaturase
Lycopene
lycopene
ß-cyclase
Daffodil
ß-carotene
Erwinia
‘Engineering provitamin A (ß -carotene) biosynthetic pathway into
(carotenoid-free) rice endosperm’.
Ye et al., Science 287,303-305 (2000).
Due T-DNAs codificanti per 3 geni della pro-vitamin A (più il gene marcatore
selettivo) sono stati introdotti insieme via Agrobacterium attraverso co-transformation
LB
RB
pro
Daffodil 1
ter
LB
pro
Daffodil 2
Daffodil 1 = phytoene synthase
Daffodil 2 = lycopene ß-cyclase
ter
pro
pro
tp
Erwinia
Hyg resis
ter
ter
RB
With own native transit peptides and endospermspecific promoter from rice glutelin (GT1 promoter)
Erwinia = Erwinia double desaturase - with added transit peptide, expressed
from
35SCaMV promoter
La granella del riso transgenico mostrava un colore giallo oro brillante. La
migliore linea aveva l’85% di carotenoidi come ß-carotene
Produzione del ‘Golden Rice’
Produzione del ‘Golden Rice’
Paine, J.A., Shipton, C.A., Chaggar, S., Howells, R.M., Kennedy, M.J., Vernon, G., Wright, S.Y.,
Hinchliffe, E., Adams, J.L., Silverstone, A.L. & Drake, R. (2005).Improving the nutritional value of
Golden Rice through increased pro-vitamin A content Nature Biotechnology 23:482-487.
In molte pathways biosintetiche multi steps esistone degli steps limitanti.
Il collo di bottiglia in questo caso era rappresentato dalla attività enzimatica di
PSY (gene codificante per la phytoene synthase) .
Dopo aver provato diversi gei PSY
provenienti da diverse fonti è stato
provato che la combinazione gne del
mais e del riso davano la migliore
combinazione
Produzione del ‘Golden Rice’
Golden Rice2 che è stato ottenuto
accumulava 37 µg/g di carotenoidi di
cui 31 µg/g ß-carotene circa 23 volte
quello del Golden Rice precedente.
Alimenti funzionali
Altre definizioni:
•Alimenti supplementati con ingredienti che conferiscono benefici alla salute.
•Alimenti che producono effeti benefici al corpo mediante adeguata nutrizione.
Esisteno diversi lavori in corso che utilizzano Gm per
generare alimenti funzionali quali ad esempio incremento
degli antiossidanti, delle vitamine, dei fenoli e delle fibre.
Per esempio:
La supplementazione della dieta con carotenoidi,lycopene e ß-carotene, reduce le
malattie al cuore, alcuni tumori ecc.
I pomodori sono la principale fonte di lycopene nella dieta e
hanno anche un buon contenuto in ß-carotene
Lo stesso gene phytoene desaturase (crtI) di Erwinia che è
stato utilizzato nel ‘golden rice’ è stato introdotto in pomodoro
per aumentare il ß-carotene
Neutraceuticals
Ralley, L., Enfissi, E.M.A., Misawa, N., Schuch, W., Bramley, P.M. & Fraser, P.D. (2004). Metabolic
engineering of ketocarotenoid formation in higher plants. Plant J. 39 477-486
Astaxanthin, canthaxanthin, and zeaxanthin sono carotenoidi
ad alto valore utilizzati nellì’industria come coloranti o
supplementi alimentari.
Hanno anche un elevato potere antiossidante ed è stato
riportato che portano benefici alla salute attraverso un’azione
immunologica e prevevendo la formazione dei tumori.
Sono state generate piante transgeniche esprimenti I geni del carotenoide 4,4’
oxygenase (crtW) e 3,3’ hydroxylase (crtZ) di Paracoccus, simultanemente
Vaccini
Cosa sono i vaccini edibili?
Un vaccine edibile è una proteina geneticamente ingegnerizzata da un
materiale edibile che, una volta alterata geneticamente, viene inserita nel
materiale, Ingerita oralmente porta una produzione naturale di anticorpi
contro una specifica proteina virale, proprio come gli altri vaccini
I vaccini edibili differiscono da quelli tradizionali nel modo in cui essi
stimolano la produzione di anticorpi nel ricevente che, nel caso dei
vaccini edibili avviene durante la digestione
Vaccini
“La proteina antigene
dovrebbe interagire con la
mucosa del tratto
gastrointestinale , attivando
le cosidette “mucous type
of immune protection”.
Come risultato l’organismo
dovrebbe sintetizzare gli
anticorpi contro la proteina
virale. Quindi la proteina
antigene è l’iniziatore che
stimola il corpo a produrre
anticorpi necerrari ad una
efficace vaccinazione.
Oral immunization of mice with transgenic tomato fruit expressing
respiratory syncytial virus-F protein induces a systemic immune response
Jagdeep S. Sandhu1, Sergei F. Krasnyanski2, Leslie L. Domier3, Schuyler S. Korban2, Mark
D.Osadjan1; & Dennis E. Buetow1
Transgenic Research 9: 127–135, 2000.
Respiratory syncytial virus (RSV)
fruit-based edible subunit vaccine against RSV
was developed by expressing the RSV fusion
(F) protein gene in transgenic tomato plants.
preferentially fruit-expressed E8 promoter
Biotech Farm
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