OPENLAB Roma 7/9 Ottobre 2004 Dipartimento di Genetica e

OPENLAB
Roma 7/9 Ottobre 2004
Dipartimento di Genetica e Biologia Molecolare
Università di Roma La Sapienza
Venerdì 8 Ottobre
Parte sperimentale
h 9.15-10.30
h 11.30-12.45
OGM
ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI
Tecniche di trasformazione
degli organismi vegetali
Applicazioni
Considerazioni sugli aspetti safe/unsafe
Paola Vittorioso
Dipartimento di Genetica e Biologia Molecolare
Università di Roma La Sapienza
QUALI SONO I METODI DI TRASFORMAZIONE?
 I metodi indiretti
mediati da Agrobacterium tumefaciens
 I metodi diretti
che non utilizzano Agrobacterium
(trasformazione
di
protoplasti,
microiniezione,
elettroporazione di cellule e tessuti, tecniche biolistiche)
Caratteristiche delle cellule vegetali
 A differenza delle cellule animali che possono rigenerare
altri organismi SOLO a partire da cellule della linea
germinale, nelle piante qualunque tessuto può rigenerare una
pianta intera
 lo stadio differenziativo dei tessuti vegetali è reversibile e
può essere manipolato in vitro
I metodi indiretti
Agrobacterium
 batterio Gram-negativo del suolo in grado di infettare
numerose piante inducendo, in corrispondenza di una lesione,
caratteristiche alterazioni tumorali
 La virulenza di questi batteri è associata alla presenza di
grossi plasmidi, cioè molecole di DNA autonome ed
indipendenti dal resto del genoma
 un frammento di DNA batterico (T-DNA) viene trasferito
dal batterio alla cellula vegetale e si integra STABILMENTE
nel genoma della pianta
Agrobacterium tumefaciens
E i suoi………”rapporti” con la cellula vegetale
Cellula vegetale
T-DNA
LB
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RB
Cromosomi
vegetali
Plasmide Ti
Cellula di Agrobacterium
Dal plasmide di Agrobacterium vengono
derivati vettori di trasferimento in cellule
vegetali
 RB e LB sono essenziali per il trasferimento del T-DNA,
mentre il T-DNA stesso non lo è
 Qualunque sequenza di DNA inclusa RB e LB viene
trasferita nelle cellule vegetali
Vettore binario
Per la trasformazione di cellule vegetali
Marker
batterico
LB
Marker
vegetale
RB
gene
d’interesse
Arabidopsis thaliana
pianta modello
per la biologia molecolare vegetale
Perché:
 tempo di generazione molto breve: 6 sett./ciclo
 taglia piccola e gran numero di “eredi”
 genoma nucleare piccolo (125 Mb)
 poco DNA ripetuto
 facilmente trasformabile ad alta efficienza
Specie
Genoma
(Mb)
N. Geni
Refer.
125
25.500
(2000)
Drosophila
Homo sapiens
S.cerevisiae
180
3200
12,1
13.600
30.000/40.000
5.800
Escherichia coli
4,64
Arabidopsis thaliana
4.400
(2000)
(2001)
(1996)
(1987)
La trasformazione di Arabidopsis thaliana:
Infiltrazione sotto vuoto con Agrobacterium
Isolamento di linee transgeniche
Trasformazione
mediata da
Agrobatterio
Raccolta semi T1
T0
T2
sensibili
resistenti
Analisi in vitro
segregazione
Selezione
dei trasformanti T1
in vitro
Autoimpollinazione
Raccolta semi T2
Isolamento di piante omozigoti per il gene d’interesse
 I geni reporter sono sequenze di acidi nucleici
codificanti
per
proteine
facilmente
evidenziabili/quantificabili
Sono principalmente utilizzati per
 Studiare l’attività di sequenze
regolative di un gene
 La localizzazione di proteine
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Tengo el gen
de la
luciferasa!!!!
Tra i geni reporter più utilizzati:
CAT (cloramfenicolo acetiltrasferase)
GAL (b-galattosidasi)
GUS (b-glucuronidasi) idrolizza glucuronidi incolori in
prodotti colorati
LUC (luciferasi)
GFP (green fluorescent protein) fluoresce in seguito
a irragiamento con UV
Analisi di espressione
con il gene reporter GUS
Venerdì 8 Ottobre
Parte teorica
h 10.30-11.00
h 12.45-13.15
OGM
ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI
Tecniche di trasformazione
degli organismi vegetali
Applicazioni
Considerazioni sugli aspetti safe/unsafe
Paola Vittorioso
Dipartimento di Genetica e Biologia Molecolare
Università di Roma La Sapienza
TRASFORMAZIONE
di ORGANISMI VEGETALI
 In teoria la trasformazione vegetale offre l'opportunita' di
introdurre geni di qualunque origine nelle cellule vegetali,
superando ogni barriera di specie e modificando esclusivamente
i geni desiderati
 La prima cellula vegetale resistente agli antibiotici è stata
prodotta dalla Monsanto nel 1982. La prima pianta trasgenica
è stata invece prodotta nell’università belga di Gent nel 1983
 Ad oggi si trasformano con successo piu' di 120 specie
vegetali
Il “classico”………….
Induced mutation-assisted breeding ha permesso l’introduzione di
nuove varietà di prodotti agricoli quali riso, mais, orzo, e banana
Pro………
Facilità di esecuzione
Non richiede intervento di laboratori, multinazionali, etc.
Contro……...
No controlli sull’impatto ambientale ne’ sui rischi per la salute delle
nuove varietà ottenute per “breeding” convenzionale
Il “nuovo”………..
dalla “Green Revolution” alla “Gene Revolution”
OGM s
Organismi in cui un transgene è incorporato nel
genoma ospite, o un gene residente è modificato nei livelli di
espressione
Perché……...
 La popolazione mondiale raggiungerà i 10 miliardi a metà di
questo secolo, cioè 2 miliardi in più di persone da nutrire
 Nei prossimi 20 anni, la richiesta di cereali aumenterà del 50%,
quindi la produttività dei terreni già in uso deve essere migliorata
 Oggi…. Circa 1000 persone sono in uno stato di fame cronica e
miliardi di persone soffrono di carenze nutrizionali
Perché NO……
 rischio di reazioni allergiche: gli OGM DEVONO essere testati
per eventuali reazioni allergiche
 trasferimento genico orizzontale per gli antibiotici
 rischi per l’ambiente? (minaccia alla biodiversità, insorgenza di
insetti resistenti)
 effetti indesiderati??????
PERCHÉ TRASFORMARE GLI ORGANISMI VEGETALI?
 Controllare lo sviluppo delle piante e la loro resa:
Nell’endosperma dei semi del grano l’incrementata attività di
un proteina coinvolta nella regolazione della biosintesi
dell’amido aumenta la resa di quasi il 40%.
 Aumento della produttività
 Sviluppo nei paesi poveri
 Utilizzare le piante per produrre molecole di interesse:
Può essere modificato il contenuto di metaboliti indispensabili
per la nutrizione umana ed animale (es. vitamine, aminoacidi
essenziali). Migliorare non solo la quantità ma anche la
qualità dei raccolti.
 Migliorare la tolleranza delle piante agli stress biotici:
Introduzione di geni che conferiscano una maggiore capacità
di adattamento a condizioni estreme, tra cui: presenza di
metalli pesanti nel terreno, elevate concentrazioni saline,
siccità, elevate temperature.
 Coltivazione in zone inadatte
 Creare piante resistenti a malattie, pesticidi, erbicidi:
Un esempio classico riguarda il mais-BT: la tossina BT che
viene prodotta grazie all’inserzione di un gene batterico agisce
come un insetticida naturale contro la piralide (lepidotteri). Il
batterio in questione è un Bacillus thuringiensis e produce un’
elevata quantità di tossine attive sulle larve stesse.
 Risparmio economico
(meno diserbanti e risparmio sul costo del lavoro)
 Riduzione dell’uso di pesticidi
E, dulcis in fundo……………….
 Creazione di mutanti per studiare la funzione dei geni
Ricerca di base, perché………...
“fatti non foste per viver come bruti……………………”
Dante
Incremento di coltivazioni OGM
negli anni
Caratteri delle piante transgeniche
nei paesi industrializzati
Resistenza insetti
19
Resistenza erbicidi
29
Qualità prodotto
16
Resistenza
Caratter.
Virus
Agronomiche
8
5
Resistenza
Funghi/batteri
5
Geni vari
18
Caratteri delle piante transgeniche
nei paesi NON industrializzati
Resistenza erbicidi
29
Resistenza insetti
37
Qualità prodotto
6
Resistenza
Virus
10
Geni vari
14
Resistenza
Caratter.
Agronomiche Funghi/batteri
3
1
IL GOLDEN RICE
Una dieta basata su poche varietà agricole determina carenze di
micronutrienti come ferro, iodio, vitamine
La carenza di vitamina A causa 500.000 casi di cecità permanente
l’anno
Negli anni ‘90 finanziato dalla Fondazione Rockefeller un
progetto per “ingegnerizzare il pathway della provitamina-A
nell’ endosperma di riso”.
L’ultimo precursore del b-carotene prodotto dai chicchi di
riso è il geranil geranil difosfato (GGPP) per ottenere il
prodotto finale sono necessari solo altri 4 enzimi:
1-fitoene sintasi, 2-fitoene desaturasi, 3-zeta carotene
Desaturasi, 4-licopene ciclasi
Il progetto fu giudicato a bassa probabilità di successo ma
meritevole in quanto potenzialmente di grande utilità……………….
Il progetto è stato svolto e realizzato COMPLETAMENTE in
strutture Accademiche:
I. Potrykus, Inst. of Plant Sciences, Swiss Federal Institut
of Technology, ETH-Zurich,Switzerland
P. Beyer, University of Freiburg, Germany
Il PROTATO o LA PRATATA
Una dieta molto ricca in carboidrati (patate) comporta una carenza
proteica, e in molti aminoacidi essenziali, problema molto diffuso nelle
popolazioni più povere dell’ India
Un consorzio di istituti pubblici, scienziati, organi del
governo, ed industrie ha sviluppato la “pratata” nell’ambito di
un programma volto a sconfiggere la mortalità infantile
La pratata contiene un gene derivato da una pianta a seme
ad alto contenuto proteico (Amaranthus) originaria del Sud
America, e contiene 1/3, 1/2 più proteine della classica
patata
Greenpeace: E’ uno “specchietto per le allodole” per rendere più
attraenti gli OGM, mentre è di nulla utilità per risolvere il problema
della malnutrizione
Saggio Istochimico di attività b-glucuronidasica
(modificato da Jefferson et al., 1987)
Il seguente esperimento permette di conoscere in quale tessuto della pianta e a quale stadio di sviluppo il gene di nostro
interesse viene espresso. L’approccio scelto prevede che le sequenze di DNA che sono situate a monte del gene,
necessarie per la regolazione dell’espressione, siano clonate a monte di un gene, cosidetto reporter, che codifica per un
prodotto facilmente misurabile. Il gene reporter scelto è GUS proveniente dal batterio Escherichia Coli, codificante per
l’enzima b-glucuronidasi. Nelle piante trasformate con questo DNA, se sono attive le sequenze regolative clonate, sarà
espresso il gene per la b-glucuronidasi. Quindi incubando i tessuti con un substrato che l’enzima è in grado di
trasformare in un prodotto colorato, è possibile osservare al microscopio quali tessuti sono colorati e dove è localizzata
l’espressione di GUS (quindi del nostro gene).
.Preparazione dei campioni
 Prelevare le plantule (almeno 5 per ogni trasformante) e porle nella piastra multiwell







.Reazione istochimica:
Aggiungere ai campioni 1/2ml della soluzione di reazione
Infiltrare sotto vuoto per 10’
Staccare il vuoto con molta attenzione
Incubare i campioni per un periodo di 1h-12h, a 37°C o a RT a seconda del trasformante
.Lavaggio dei campioni:
Eliminare la soluzione e lavare con metanolo:ac.acetico (3:1)
Lavare con EtOH 70%
Conservare i campioni in EtOH 96%-100% o glicerolo 50%
Trasformazione sotto vuoto di piante di Arabidopsis
Le piante vengono trasformate dopo circa 3 settimane dalla germinazione, mediante infiltrazione con
Agrobacterium. Le piante devono avere tante gemme, tanti fiori e poche silique.
•.Preparare una coltura da 500 ml del clone batterico ricombinante da utilizzare, cresciuta in LB, o/n a 28°C,
in agitazione (~150rpm)
•.Centrifugare i batteri a 3000rpm, 5 min., a 4°C
•Eliminare il sopranantante e risospendere bene i batteri nel terreno di infiltrazione (200ml)
•.Capovolgere 1 vasetto con 10-15 piante in una scatola Magenta contenente ~200ml della sospensione
batterica. Fare attenzione che i fiori siano completamente immersi nella sospensione
•.Porre il tutto in una campana da vuoto e attacare la pompa per fare il vuoto (per ~2min,). Poi lasciare la
campana sotto vuoto per altri 10min.
•.Staccare il vuoto non troppo dolcemente (per favorire l’infiltrazione batterica) e poi porre la pianta (T0) in
un sacchetto da autoclave, per mantenere l’umidità, in camera climatica
•.Dopo 2/3 giorni la pianta può essere estratta dal sacchetto, e normalmente annaffiata fino a completa
maturità (produzione di semi)
•.Quando la pianta è completamente secca, raccogliere i semi per poi procedere alla selezione dei
trasformanti primari (T1)