Le piante transgeniche Trasformazione genetica Un processo mediante il quale un fenotipo di un organismo può essere cambiato attraversi l’aggiunta di DNA esogeno L’organismo così generato è chiamato transgenico o Genetically Modified Organism (GMO) Utilizzo e valore delle piante transgeniche Agricoltura • Miglioramento genetico • miglioramento delle peformance ‘Farmaceuticals’ / ‘Neutraceuticals’ • nuove colture per nuovi prodotti • piante ‘factories’ o ‘bio-reattori’ Ambiente • • riduzione uso pesticidi Bioremediation / phytoremediation Modificazione delle piante: steps 1. Clonaggio (creazione della cassetta d’espressione del transgene) 2. Trasformazione (via Agrobacterium o altro metodo) 3. Selezione piante trasformate (uso di marcatori selettivi) 4. Screening del materiale con appropriata espressione genica 5. Isolamento delle linee omozigoti 6. test delle piante ottenute (analisi molecolari e d’espressione genica) Modificazione delle piante: clonaggio Gene reporter/selettivo Gene d’interesse Elementi controllo espressione (es. Green Florescent Protein o (es. tolleranza ad erbicidi o genica Resistenza ad antibiotici) Resistenza a malattie) (es. solo in foglia o in seme) Generazione di piante Transgeniche Agrobacterium tumefaciens Microiniezione Biolistico Come vengono prodotte le piante transgeniche Molto diffusa la trasformazione via Agrobacterium • Funzione per la maggior parte delle dicotiledoni e per alcune moncotiledoni • non necessita di attrezzature specifiche e può essere utilizzato in qualsiasi laboratorio L’ Agrobacterium: un ingegnere naturale •L’ Agrobacterium tumefaciens è un batterio del suolo che causa la formazione di tumori (crown gall) nelle piante •Contiene il plasmide Ti (Tumor-inducing plasmid) •Il plasmide Ti possiede una regione di DNA, il T-DNA (Transferred-DNA), che viene incorporato nel DNA nucleare della painta infettata Ti Plasmid • geni vir: essenziali per il trasferimento e l’integrazione della regione T-DNA T-DNA region •Auxine iaaM e iaaH : sintetizzano gli ormoni auxicini della crescita (acido indolacetico) Cytokinin Auxin Left border Opine •Citochinine - gene tmr (ipt): genera la citochinina trans-zeatina. Promuovono la crescita cellulare e la formazione delle galle Right border 12-24 kbp Opine catabolism vir genes ori •Opine: sono prodotti di reazioni di condensazione tra aminoacidi e keto acidi (es. nopaline, octopine, agropine). Sintetizzate e secrete dalle galle sono utilizzate come fonte di carbonio dall’Agrobacterium Manipolazione genetica del plasmide Ti •La delezione dei geni auxinici e delle citochinine elimina •Sono stati inseriti dei marcatori selettivi batterici la formazione delle galle di E. coli (selectable shuttle vector) al di fuori della regione T-DNA •Inserimento di marcatori selettivi per pianta all’interno della regione T-DNA •Qualsiasi gene viene inserito all’interno della regione T-DNA sarà incorporato nel DNA della cellula vegetale (es. geni di resistenza ad erbicidi) •Le cellule vegetali trasformate vengono rigenerate come pianta intera attraverso la coltura in vitro. •Ogni cellula della nuova pianta conterrà il transgene Il Trasferimento del T-DNA da Agrobacterium a cellula vegetale Agrobacterium Cellula vegetale Nucleo Ti plasmid Il Trasferimento del T-DNA da Agrobacterium a cellula vegetale ferita Cellula vegetale Nucleo Ti plasmid Agrobacterium Il Trasferimento del T-DNA da Agrobacterium a cellula vegetale Agrobacterium Segnale di ferita Cellula vegetale nucleo Copia di T-DNA a singolo filamento (protetto da “ssDNA binding protein”) Il Trasferimento del T-DNA da Agrobacterium a cellula vegetale Agrobacterium Segnale di ferita Cellula vegetale Nucleo poro Copia di T-DNA a singolo filamento (protetto da “ssDNA binding protein”) T-DNA Chromatina Rigenerazione delle piante •L’agrobatterio viene inoculato sul tessuto vegetale •Il tessuto viene messo in coltura in piastre contenenti un antibiotico selettivo •I calli (tessuti indifferenziati) vengono trasferiti in un altro mezzo di coltura contenete ormoni di crescita che inducono la formazione di germogli e/o radici •Si può effettuare un controllo dei calli trasformati prima della loro rigenerazione attraverso un’analisi molecolare (es. PCR) Bombardamento con Microproiettili (biolistico) •Proiettili sferici di oro o tungsteno (0.4 – 1.2m dia.) vengono ricoperti con il DNA •Questi proiettili vengono sparati ad alta velocità (3-600 metri/sec) mediante un’apparecchiatura (particle gun) utilizzando aria compressa o gas compresso (elio) •Il proietticle penetra la parete cellulare e le membrane (trasformazione d cloroplasti o mitocondri) •Possono essere trasformate un gran numero di specie (anche monocotiledoni) che non sono suscettibili al trasferimento di DNA via Agrobacterium. •Questo metodo può essere utilizzato anche per sospensioni cellulari, colture di calli, tessuti meristematici, embrioni immaturi, coleoptili e polline. Il transgene: RNA Antisenso Questa tecnica viene utilizzata normalmente nelle piante per bloccare l’espressione di geni endogeni. Frammenti clonati di geni vengono posti nel trasgene in orientamento inverso vicino ad un promotore. Quando questo transgene antisenso viene reintrodotto nelle cellule vegetali previene in qualche modo la produzione della proteina endogena. Non si ha un copleto knock-out del gene . Si può avere una debole o una maggiore produzione della proteina. Alterazione della maturazione dei frutti mediante RNA Antisenso La Poligalatturonase (PG) è un enzima che abbassa la pectina nelle pareti dei frutti in maturazione Attività PG Frutto Wildtype Frutto PG Antisenso 0 2 4 6 8 10 Giorni dal primo cambiamento del colore Le piante transgeniche con PG antisenso (FLAVR SAVR tomato) producono poco PG. Le pareti si ammorbidiscono molto lentamente Molti geni sono stati manipolati in modo analogo per rispordere ad alcune questioni basilari: - qual’è il ruolo degli ormoni nella maturazione dei frutti? - quali enzimi agiscono nella parete dei frutti ? Il transgene: RNAi Una tecnica,che merita particolare attenzione, e che è stata introdotta solo di recente, è quella che permette di interferire con l’espressione di alcuni geni dannosi mediante la trasfezione di piccoli frammenti di RNA a doppio filamento in grado di antagonizzare l’RNA messaggero corrispondente (“ RNA INTERFERENCE”). La tecnologia dell’RNAi è basata su un processo di inattivazione genica posttrascrizionale, altamente specifico, presente in piante e animali, innescato da RNA a doppia elica (dsRNA) omologo alla sequenza del gene da sopprimere. Diffusamente utilizzato in Caenorhabditis (nematode) – lavora anche in Drosophila, nei trypanosomi e in pianta RNAi In questo fiore un gene che controlla la produzione di pigmento viola è stato disattivato mentre il fiore era in crescita. Le cellule che si sono sviluppate dopo questo intervento risultano bianche in quanto I pigmenti viola non venivano più prodotti. Courtesy of Dr. Richard Jorgensen, University of Arizona. RNAi Il gene FLC quando viene silenziato produce precocemente I fiori in quanto la sua funzione è proprio quella di reprimere la fioritura. (Wesley et al., 2001, Plant J. 27: 581-590). Chalcone synthase gioca un ruolo nella formazione dei pigmenti in pianta. Il suo silenziamento produce semi giallo pallido (Wesley et al., 2001, Plant J. 27: 581-590). EIN-2 è un gene responsabile della percezione dell’etilene gene (Wesley et al., 2001, Plant J. 27: 581-590). GUS è il gene reporter molto utilizzato (Wesley et al., 2001, Plant J. 27: 581590). Phytoene desaturase è un gene che quandi viene silenziato forma piante bianche. Questo perchè I carotenoidi prevengono il fotosbiancamento della clorofilla. (Helliwell et al., 2002, Functional Plant Biology, 29: 12171225). Il transgene: Gene ‘stacking’ o ‘pyramiding’ Utilizzato già nel breeding tradizionale delle piante (“Gene stacking” è la combinazione attraverso l’incrocio e la selezione della pregenie di tratti desiderati in un’unica linea) Biotecnologie : nuove strategie di co-espressione Quando è necessario co-esprimere geni multipli •pathway biochemiche •enzimi multimerici •proteine multiple che controllano diversi ‘choke points’ nelle biosintesi . Miglioramento della tolleranza in pianta di stress abiotici clima Suolo Temperatura (caldo, freddo) Disponibilità di nutrienti Idrico (siccità, asfissia) Acidità e alcalinità Stimoli meccanici (vento) luce troppa poca Inquinanti Metalli pesanti Ozono Applicazione prodotti chimici erbicidi Erbicidi e problema delle infestanti 10% della perdita di produzione nelle colture è causata dale malerbe > $10 billioni vengono spesi annualmente in erbicidi Moltio erbicidi sono attivi contro le colture - spesso devono essere distribuiti precocemente per precauzione Molti erbicidi sono persistenti nel suolo o lasciano residui tossici Il tillage (ploughing) può essere utilizzato per il controlllo delle malerbe ma può prvocare serie perdite d’acqua Modalità d’ingegnerizzazione per tolleranza ad erbicidi •Esistono più di 100 diversi erbicidi con varie modalità d’azione • Molti erbicidi agiscono interferendo con enzimi chiave • Molti agiscono a livello di cloroplasti •Le piante variano nel loro livello di sensibiltà agli erbicidi. Alcune sono capaci di: (a) Produrre enzimi che inattivano erbicidi particolari (b) Produrre un target alterato di enzimi, insensibili a particolari erbicidi (c) Inibire l’uptake dell’erbicida •Le colture possono essere ingegnerizzate per tolleranza aparticolari erbicidi attraverso l’inserimento di singoli nuovi geni La tolleranza ad erbicidi è il tratto dominante delle colture GM coltivate a livello commerciale 74% di colture GM coltivate nel 2000 erano tollaranti ad erbicidi (HT) 7% ‘stacked transgenes’ (HT + Bt gene per resistenza ad insetti) coltura tratto % delle colture GM globali soia* HT 58% colza HT 6% mais HT 5% cotone HT 5% cotone HT+Bt 4% mais HT+Bt 3% (* 36% della soia coltivata nel mondo è transgenica) Colture tolleranti al Glyphosate Le prime colture ingegnerizzate messe in commercio sono state quelle con tolleranza all’erbicida glyphosate (Roundup) Attualmente molte colture presentano inserito questo tratto transgenico (soiia, mais, colza, cotone ecc) Colza tollerante Ingegnerizzazione per tolleranza a Glyphosate Il Glyphosate inibisce un enzima cloroplastico essenziale nella biosintesi degli aminoacidi : 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimic acid synthase (EPSPS) Non è stato possibile generare piante tolleranti al glyphosate attraverso mutagenesi e seliezione tradizionale Un mutante del gene EPSPS è stato isolato da Agrobacterium, che introdotto in pianta conferisce tolleranza al glyphosate EPSPS Transgene introdotto in pianta Transit peptide from plant gene added to allow chloroplast import promoter tp Codon usage modified for efficient expression in plants Agro. EPSPS polyA+ Regulatory sequences recognised by plant (either from plant gene or plant virus gene). In this case 35S CaMV promoter Ingegnerizzazione tolleranza a Phosphinothricina L-phosphinotricina è un ingrediente attivo negli erbicidi glufosinate / bialaphos Questi erbicidi agiscono inibendo la glutamine synthetase (GS) - GS necessaria per la sintesi di glutamine da glutamate e ammonio - GS previene l’accumulo di ammonio a livelli tossici nelle cellule vegetali H HOOC CH2 CH2 C COOH glutamate NH2 O CH3 P OH H CH2 CH2 C NH2 COOH L-phosphinotricina Piante tolleranti a Phosphinothricina Non è stato possibile generare piante tolleranti al glyphosate attraverso mutagenesi e seliezione tradizionale - trasformare piante con un mutante GS insensibile alla phosphinotricina - trasformare il gene delle piante per un enzima che inattiva la phosphinotricina I geni batterici (pat o bar ) che codificano per phosphinothricin acetyl transferase sono stati trasferiti in pianta detossificano L-phosphinotricina attraverso acetilazione, così GS non è inibita Coltivazioni commerciali di Cicoria, rape e mais tolleranti a Phosphinothricina Tolleranza a Phosphinotricina Introdotta in pianta Codon usage modified for efficient expression in plants promoter Bacterial pat polyA Regulatory sequences recognised by plant (either from plant gene or plant virus gene). Frequently use 35S CaMV promoter Tolleranza a stress ambientali Il progresso per gli stress ambientali attraverso il breeding classico è andato molto lentamente Crop Abiotic losses (% record yield) Maize Wheat 66% 82% Soyabean 69% Sorghum Oat 81% 75% La tolleranza di solito coinvolge molti geni e processi fisiologici L’approccio transgenico ha dovuto sffrontare anche questi problemi ma alcuni progressi sonos stati fatti anche se ancora non ci sono piante in commercio Risposta della pianta allo stress Ozono Riconoscimento stress Temperature estreme Stress transduction asfissia Alterazione Espressione genica siccità Alterazione metabolismo salinità Risposte fisiologiche/ sviluppo Risposta della pianta allo stress ? ? Ca2+ Hormones Fattori di transcrizione Riconoscimento stress Stress transduction Alterazione Espressione Caratteri multigenici genica Alterazione metabolismo Es. •Antiossidanti prodotti in risposta a molti stress per detossificare dai radicali liberi (reactive oxygen species -ROS) •Soluti compatibili (osmo-protectants) sostanze osmoprotettive prodotte da alcune piante in risposta a stress osmotici come siccità e salinità •heat-shock proteins (HSPs) accumulate in seguito a stress da calore Resistenza a siccità/salinità Trehalosio è un osmoprotettivo contro stress ambientali: congelamento, salinità, caldo e essiccazione. Il Trehalose (1--D-glucopyranosyl-glucopyranoside) è sintetizzato in due steps nei lieviti. Zygosaccharomyces rouxii è uno dei lieviti più osmotolleranti, specialmente al sale. Kwon, S.J., Hwang, E.W. & Kwon, H.B. (2004). Genetic engineering of drought resistant potato plants by co-introduction of genes encoding trehalose-6phosphate synthase and trehalose-6-phosphate phosphatase of Zygosaccharomyces rouxii. Korean J. Genet. 26, 199-206. Patate transgeniche mofologicamente uguali ai parentali NS ter NS prom nptII LB trehalose-6-P synthase CaMV 35S trehalose-6-P phosphotase 2A RB Piante transgeniche per resistenza a malattie Impatto delle malattie sulle colture La colture sono spesso coltivate in modo estensivo e in monocoltura. Incremento del rischio di malattie epidemiche Le malattie limitano in modo significativo la produttività e richiedono sostanziali apporti di prodotti chimici. Crop Biotic losses* (% average yield) Maize Wheat Soyabean Sorghum Oat 42% 39% 41% 37% 54% * Biotic losses include diseases, insects and weeds Breeding tradizionale •insetti e funghi sono molto più distruttivi di virus e batteri •In alcuni casi, con il breeding tradizionale si è potuto introdurre geni di resistenza da specie selvatiche a specie coltivate. • Per alcune malattie non sono stati trovati geni di resistenza efficaci e durevoli •Riduzione della suscettibilità ai geni di resistenza continua necessità di ricerca fonti di gene di resistenza Vantaggi delle Transgeniche Nessuna restrizione legata ad incompatibilità sessuale Introduzione di resistenze in specie che in natura non presentano fonti di resistenze Colture GM per resistenza ad insetti e virus sono commercializzate in USA Transgenic insect and viral resistant crops are already grown commercially in US e altri Paesi: - mais, cotone, patata, pomodoro resistente ad insetti - patata, papaya, zucchini resistenti a virus Resistenza ad insetti La resistenza ad insetti è il secondo più importatnte tratto tansgenico nelle colture commerciali GM 19% delle colture GM per resistenza ad insetti contengono il gene Bt Un’altro 7% sono Bt + tolleranza ad erbicidi Crop Trait % of global GM crops Maize Bt 15% Cotton Bt + HT 4% Cotton Bt 3% Maize Bt + HT 3% Tossine Bt Le tossine prodotte da Bacillus thuringiensis uccidono solo gli insetti Diversi ceppi di Bacillus thuringiensis producono diverse tossine, ciascuna attuiva solo per uo o poche specie d’insetti. Le spore batteriche o isolati della tossina sono già disponibili come insetticidi organici Tossine Bt Tossine prodotte nelle spore, e formano cristalli proteici Le tossine codificate da geni Cry Attività della tossina; • protossina è digerita nell’intestino da proteasi + pH alcalino • protossina si lega ad un sito specifico sulla parete intestinale • avvengono ulcerazioni e diminuisce l’appetito • si ha la rottura della parete intestinale, larve muoiono Colture Bt Alcune colture (cotone, mais, patata ecc.) sono state trasformate con diverso geni Cry che producono tossine attive contro alcuni erbivori. Ad oggi sono stati utilizzati più di 40 diversi geni Cry Codon usage modificato per un’efficiente espressione in pianta promotore Bt Cry polyA Sequenze regolatrici riconosciute dalla pianta Colture Bt Regole di conduzione per minimizzare l’insorgenze di resistenza a Bt 1. 20% mais non-BT (50% cotone non-Bt) in campo; 2. Monitoraggio Introduzione di resistenze multiple incremento dei livelli d’espressione impatto con insetti non-target: ‘buffer zone’ di mais non Bt intorno a mais BT ‘Transgenic pollen harms monarch larvae". J.E. Losey et al., Nature 20 May 1999 (correspondence). È stato molto criticato per dati riferiti ad un solo anno, per uso di larve molto suscettibili.I lavori attuali riportano pochi se non effetti nulli, giusta comparazione con campi trattati con insetticidi Resistenza a Virus “RNA-mediated interference”: si basa sull’espressione di geni patogeno-derivati o da frammenti di geni (es. Resistenza patogeno derivata) Interferisce con I normali processi patogenici del microbo sia a livello proteico (resistenza virale e batterica) sia a livello di RNA ( solo resistenza virale). “Protein-mediated interference”: - espressione di una tossina derivata batterica, inattivando l’enzima per controllare specifici Pseudomonas - espressione costitutiva di “coat protein” virali (CPs) o proteine di movimento (MPs) per la protezione di piante a virosi. Non si conosce bene il meccanismo d’interferenza mediata dalle proteine. - necessari livelli di espressione elevati di “coat protein” Papaya ringspot virus (PRV) Questo virus ha avuto un enorme impatto in Hawaii , con forti riduzioni nella produzione di frutti freschi Non esistono in natura geni di resistenza a questo virus, e senza la produzione di papaya transgenica la produzione industriale nelle Hawaii potrebbe essere distrutta. Dal 1996 nelle hawaii si coltiva papaya PRV resistente. Resistenza a PRV in Papaya Il gene della coat protein di viene espresso mediante il promotore 35S CaMV. La papaya è stata trasformata attraverso metodo biolistico. promoter PRV coat protein gene polyA+ Regulatory sequences recognised by plant (either from plant gene or plant virus gene). In this case 35S CaMV promoter and terminator Questo gene conferisce resistenza parziale a PRV in una varietà (‘Rainbow’) e resistenza completa in un’altra (‘SunUp’) Gli agricoltori gestiscono la coltivazione con molta cura per minimizzare la pressione di selezione sui virus per il mantenimento della resistenza. Would it surprise you to know that saving a crop from a virus helped save a community from disaster? Through advancements in plant biotechnology, researchers developed a type of papaya that is resistant to a virus that was destroying Hawaii’s crops. This healthier plant not only kept Hawaiian farming communities in business, it also resulted in an increase in papaya production. And its just one example of how crops enhanced by plant biotechnology could one day help feed an ever-increasing world population. The research is ongoing and the facts are there to be examined. If you want to learn more we invite you to call us or visit our web site: www.whybiotech.com Council for Biotechnology Information Resistenza multipla a virus in zucchini Geni “Coat protein” per 3 virosi (cucumber mosaic virus CMV; zucchini yellow mosaic virus ZYMV; watermelon mosaic virus 2 WMV 2) sono stati introdotti in Cucurbita pepo - tutti espressi dal promotore 35S CaMV ZYMV CP LB nptII Prom CMV CP WMV 2 CP t t Prom Prom = promoter t = terminator protegge contro I 3 virus Prom RB t Resistenza a virus in pianta Transcapsidazione Se la pianta viene infettata da un’altro virus questo potrebbe essere incorporato nel capside codificato dal transgene provocando un mascheramento virale. •La coat protein introdotta sarà sufficiente a produre il mascheramento? •Se ciò si verifica si possono avere nuove proprietà biologiche? Sinergia Se la pianta viene infettatabda un’altro virus, si possono avere manifestazioni di sintomi più gravi a causa della presenza della coat protein? Ricombinazione La frequenza del fenomeno potrebbe ssere incrementata? Si possono avere nuovi ricombinanti? Quale futuro? Miglioramento del valore nutrizionale degli alimenti Modificazioni nutrizionali Miglioramento del contenuto proteico e qualitativo Incremento delle vitamine, antiossidanti, ferro e altri minerali ecc. Rimozione dei fattori antinutrizionali quali inibitori delle proteasi e lecitine. Remove anti-nutritional factors e.g. protease inhibitors, lectins Modificazione del contenuto in grassi saturi. Incremento/decremento di fenoli e fibre Miglioramento qualitativo delle proteine Animali and uomini devono incorporare 10 aminoacidi essenziali attraverso il regime alimentare in quanto incapaci di produrli da se. Il valore nutrizionale delle proeine di riserva delle sementi risulta spesso limitato. posssono deficitare di uno o più aminoacidi essenziali per la salute umana (es. Nei legumi perdita di cisteina e metionina) Il bilanciamento aminoacidico nelle sementi è stato manipolato in laboratorio mediante diverse strategie: - introduzione di proteine di riserva nei semi da altre specie - alterazione in vitro delle sequenze dei geni delle proteine di riserva - manipolazione della pathway della biosintesi degli amino acidi per incrementarne alcuni Strategie simili sono state utilizzate per migliorare il contenuto e la composizione proteica in colture no-food ‘Increased nutritive value of transgenic potato by expressing a nonallergenic seed albumin gene from Amaranthus hypochondriacus’ Chakraborty et al., PNAS 97, 3724-3729 (2000) La patata, la quarta coltura nel mondo, è utilizzata per produrre alimenti, mangimi, amido e alcool. Limitata in lisina, tirosina, metionina e cisteina Patate trasformate con gene di Amaranthus hypochondriacus che codifica per la produzione di albumina nei semi presentano un buon bilanciamento aminoacidico 2 costrutti alternativi. Promotore constitutivo o tuberospecifico p35S CaMV AmA1 pGBSS AmA1 Nos 3’ Nos 3’ pSB8 pSB8G l’espressionei nei tuberi è da 5 a 10 volte maggiore quando si utilizza il promotore GBSS promoter piuttosto chi il 35S Cambiamenti qualitativi proteici nelle patate transgeniche contenuto in aminoacidi essenziali da 3 a 5 volte più elevato Contenuto proteico totale incrementato del 35-45% 8- Fold increase 4- 1D E S G H R T A P Y V M C I L F K Amino acid Le piante producono il doppio rispetto al wild-type L’albunia di Amaranthus non è allergenica : - già utilizzata come farina in Messico e Sud America - test iperallergenici condotti su animali come mangime non evidenziano reazioni allergiche Vitamina A La vitamina A (retinolo) è essenziale alla crescita umana. Il nostro corpo non produce vitamina A, e la possiamo incamerare dalla dieta per due vie: - 50% come pro-Vitamina A dei carotenoidi delle piante che viene convertita il vitamina A nell’intestino. - ingestione diretta da alimenti animnali e supplementi. Tutti I carotenoidi che contendono anelli possono essere convertiti in retinolo, e una delle più importanti pro-vitamine dei carotenoidi è il -carotene Deficenza in vitamina A 400 milioni di persone sono a rischio per deficienza in vitamin A (VAD), in particolare in Asia e Africa. circa 2.5 milioni delle morti annue riguardano bambini sotto i 5 anni VAD rende I bambini particolarmente suscettibili ad infezioni. 0.5 milioni di bambini diventano cieci a causa della VAD Il ricorso a supplementi in vitamina A è riuscito a ridurre I problemi del 50% nelle aree soggette, ma ciò risulta molto oneroso e non utilizzabile in tutte le aree. Pro-vitamina A in pianta -carotene è un pigmento richiesto nella fotosintesi - prodotto in tutti I tessuti verdi della pianta - prodotto anche nell’endosperma del mais giallo e del sorgo Il riso è una coltura fondamentale per la gran parte del modo ma la granella di riso non produce vitamina A o il suo precursore, -carotene La VAD è un problema molto serio nelle regioni in cui il riso è la derrata alimentare principale; più del 70% di bambini sotto I 5 anni ne sono affetti La ricerca di mutanti di riso con -carotene neklla granella è stata un insuccesso. - alcune varietà di riso non lucido “unpolished rice’ (riso bruno e riso rosso) possono produre vitamina A ma la gran parte di riso è lucido con l’aleurone rimosso prima che diventi rancido all’immagazzinamento. Produzione del ‘Golden Rice’ Il progetto riguardante l’introduzione della provitamina A è durato 8 anni Ingo Potrykus and Peter Beyer con fondi dell Rockefeller Foundation e EU inizialmente è stato mostrato che l’ultimo precursore della pathway dei carotenoidi nell’endopserma del riso è il geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP) Può arrichire in -carotene via 4 enzimi: phytoene synthase, phytoene desaturase, -carotene desaturase, lycopene cyclase Questi geni sono stati isolati da narciso ed introdotti in riso ad uno ad uno. Produzione del ‘Golden Rice’ Geranyl geranyl pyrophosphate (GGPP) Phytoene -carotene Lycopene ß-carotene Produzione del ‘Golden Rice’ Geranyl geranyl pyrophosphate (GGPP) 1° esper.mostrava che riso transgenico espirmente PS di narciso era normale, fertile and produceva phytoene Phytoene synthase Phytoene Phytoene desaturase -carotene (1) Si può deviare la pathway verso il -carotene (2) Incanalare la GGPP via da altre pathways nion ha effetti dannosi Erwinia uredovora double desaturase crtI -carotoene desaturase Lycopene lycopene ß-cyclase Daffodil ß-carotene Erwinia ‘Engineering provitamin A (ß -carotene) biosynthetic pathway into (carotenoid-free) rice endosperm’. Ye et al., Science 287,303-305 (2000). Due T-DNAs codificanti per 3 geni della pro-vitamin A (più il gene marcatore selettivo) sono stati introdotti insieme via Agrobacterium attraverso co-transformation LB RB pro Daffodil 1 ter pro LB pro Daffodil 2 Daffodil 1 = phytoene synthase Daffodil 2 = lycopene ß-cyclase pro ter tp Erwinia Hyg resis ter ter RB With own native transit peptides and endospermspecific promoter from rice glutelin (GT1 promoter) Erwinia = Erwinia double desaturase - with added transit peptide, expressed from 35SCaMV promoter La granella del riso transgenico mostrava un colore giallo oro brillante. La migliore linea aveva l’85% di carotenoidi come ß-carotene Produzione del ‘Golden Rice’ Produzione del ‘Golden Rice’ Paine, J.A., Shipton, C.A., Chaggar, S., Howells, R.M., Kennedy, M.J., Vernon, G., Wright, S.Y., Hinchliffe, E., Adams, J.L., Silverstone, A.L. & Drake, R. (2005).Improving the nutritional value of Golden Rice through increased pro-vitamin A content Nature Biotechnology 23:482-487. In molte pathways biosintetiche multi steps esistone degli steps limitanti. Il collo di bottiglia in questo caso era rappresentato dalla attività enzimatica di PSY (gene codificante per la phytoene synthase) . Dopo aver provato diversi gei PSY provenienti da diverse fonti è stato provato che la combinazione gne del mais e del riso davano la migliore combinazione Produzione del ‘Golden Rice’ Golden Rice2 che è stato ottenuto accumulava 37 µg/g di carotenoidi di cui 31 µg/g ß-carotene circa 23 volte quello del Golden Rice precedente. Alimenti funzionali Altre definizioni: •Alimenti supplementati con ingredienti che conferiscono benefici alla salute. •Alimenti che producono effeti benefici al corpo mediante adeguata nutrizione. Esisteno diversi lavori in corso che utilizzano Gm per generare alimenti funzionali quali ad esempio incremento degli antiossidanti, delle vitamine, dei fenoli e delle fibre. Per esempio: La supplementazione della dieta con carotenoidi,lycopene e ß-carotene, reduce le malattie al cuore, alcuni tumori ecc. I pomodori sono la principale fonte di lycopene nella dieta e hanno anche un buon contenuto in ß-carotene Lo stesso gene phytoene desaturase (crtI) di Erwinia che è stato utilizzato nel ‘golden rice’ è stato introdotto in pomodoro per aumentare il ß-carotene Neutraceuticals Ralley, L., Enfissi, E.M.A., Misawa, N., Schuch, W., Bramley, P.M. & Fraser, P.D. (2004). Metabolic engineering of ketocarotenoid formation in higher plants. Plant J. 39 477-486 Astaxanthin, canthaxanthin, and zeaxanthin sono carotenoidi ad alto valore utilizzati nellì’industria come coloranti o supplementi alimentari. Hanno anche un elevato potere antiossidante ed è stato riportato che portano benefici alla salute attraverso un’azione immunologica e prevevendo la formazione dei tumori. Sono state generate piante transgeniche esprimenti I geni del carotenoide 4,4’ oxygenase (crtW) e 3,3’ hydroxylase (crtZ) di Paracoccus, simultanemente Vaccini Cosa sono i vaccini edibili? Un vaccine edibile è una proteina geneticamente ingegnerizzata da un materiale edibile che, una volta alterata geneticamente, viene inserita nel materiale, Ingerita oralmente porta una produzione naturale di anticorpi contro una specifica proteina virale, proprio come gli altri vaccini I vaccini edibili differiscono da quelli tradizionali nel modo in cui essi stimolano la produzione di anticorpi nel ricevente che, nel caso dei vaccini edibili avviene durante la digestione Vaccini “La proteina antigene dovrebbe interagire con la mucosa del tratto gastrointestinale , attivando le cosidette “mucous type of immune protection”. Come risultato l’organismo dovrebbe sintetizzare gli anticorpi contro la proteina virale. Quindi la proteina antigene è l’iniziatore che stimola il corpo a produrre anticorpi necerrari ad una efficace vaccinazione. Oral immunization of mice with transgenic tomato fruit expressing respiratory syncytial virus-F protein induces a systemic immune response Jagdeep S. Sandhu1, Sergei F. Krasnyanski2, Leslie L. Domier3, Schuyler S. Korban2, Mark D.Osadjan1; & Dennis E. Buetow1 Transgenic Research 9: 127–135, 2000. Respiratory syncytial virus (RSV) fruit-based edible subunit vaccine against RSV was developed by expressing the RSV fusion (F) protein gene in transgenic tomato plants. preferentially fruit-expressed E8 promoter Biotech Farm Biotech Farm Biotech Farm Biotech Farm