Presentazione di PowerPoint - Università degli studi di Pavia

I canali ionici consistono in macromolecole singole o
organizzate in complessi, che costituiscono la parete del canale
- o poro – che attraversa la membrana plasmatica e connette
l’interno della cellula con l’esterno.
In generale, i canali ionici si aprono in seguito ad un
cambiamento conformazionale, che può avvenire:

in seguito all’attivazione della componente recettoriale del canale da
parte di una specifica molecola messaggero (canale chemiodipendente);
trasmissione chimica
alle sinapsi:

neurotrasmettitore
chiuso
aperto
oppure in seguito ad una variazione del potenziale di membrana
captata da una parte specifica del canale, il sensore del voltaggio
(canali voltaggio-dipendenti).
trasmissione elettrica
negli assoni:
chiuso
campo elettrico
aperto
Era noto da lungo tempo che attraverso la membrana
plasmatica è possibile un rapido scambio di ioni. Tuttavia,
Neher e Sakmann furono i primi a mostrare l’esistenza di
canali ionici specifici
La tecnica del patch clamp
Erwin Neher & Bert Sakmann Premi Nobel
per la medicina nel 1991 per lo sviluppo della
tecnica del patch-clamp rendendo possibile la
caratterizzazione di singoli canali ionici
Per chiarire come funziona un canale ionico,
cioè come esso si apre e si chiude, è necessario
poter registrare la corrente che lo attraversa.
Antecedentemente all’era del patch-clamp ciò
appariva elusivo in quanto la corrente ionica
attraverso un singolo canale è molto piccola.
Con la tecnica del patch-clamp si poterono
superare tali difficoltà.
Il setup per il patch-clamp
microscopio
microelettrodo
micromanipolatore
computer
preparato
oscilloscopio
amplificatore
gabbia di Faraday
La configurazione di cell-attached
Registrazione di una corrente elettrica che
fluisce attraverso un singolo canale ionico
Amplificatore
Elettrodo di registrazione:
micropipetta di vetro  10-6 m
Resistenza della saldatura: >1 GW
Con un opportuno equipaggiamento
elettronico e opportune condizioni
sperimentali è possibile misurare
questa corrente “microscopica”
Quando un singolo canale si apre,
gli ioni si muoveranno attraverso il
canale come una corrente elettrica
Quale tipo di informazioni è
possibile ottenere dalla registrazione
di correnti di singolo canale?
E’ possibile misurare l’ampiezza media della corrente
che fluisce attraverso un singolo canale
La distribuzione delle correnti di singolo
canale è gaussiana
0.5 pA
10 ms
Quale altro tipo di informazione può dare
l’analisi delle correnti di singolo canale?
1. Il numero degli stati in cui il canale può esistere
2. Il tempo medio di permanenza in ciascun stato
3. La probabilità che un canale ha di trovarsi in
quello stato
4. Le velocità di transizione tra gli stati
Regolazione della funzione dei canali ionici
Meccanismi potenziali di modulazione di un canale ionico
Enzima
effettore
2o messaggero
Recettore
?
canale
ionico
Possibile meccanismo di regolazione di un canale mediante
produzione di un 2o messaggero citoplasmatico
agonista
canale
fosforilaz.
proteina
regolatrice
Possibile meccanismo di regolazione di un canale mediante
interazione diretta con una proteina G
Recettore
G proteina
canale
agonista
agonista
canale
X
recettore
proteina G
Certi canali K+ sono effettori di Gi/o
Recettore
G proteina
i q s t
effettore
canale
enzima
La tecnica del patch-clamp, nelle sue varie
configurazioni, ha dato un contributo fondamentale a
chiarirne il meccanismo d’azione
Utilizzo della configurazione di cell-attached
per lo studio dei canali al K+ muscarinici

Nella modulazione di tale canale
non è coinvolto un secondo
messaggero intracellulare
diffusibile
Inside-out patch
Amplificatore
vescicola
trazione
esposizione
all’aria
Cellula
Cell-attached
patch
Inside-out
patch
Nella configurazione di insideout la parte intracellulare della
membrana viene a contatto
con l’ambiente esterno
Certi canali K+ sono effettori di Gi/o
Recettore
G proteina
i q s t
effettore
canale
enzima
trasmettitore
GTP
n = 1 (aperto)
+ neurotr.
n = 0 (chiuso)
L’attivazione di Gi/oporta
al rilascio di Ga e Gbg
Certi canali K+ sono effettori di Gi/o
Recettore
G proteina
i q s t
effettore
canale
enzima
trasmettitore
Gbg
GTP
no GTP no G*
n= 0 (chiuso)
n = 1 (aperto)
+Gbg
n = 0 (chiuso)
Nessuna apertura del canale
La configurazione di
“inside-out” permette
l’accesso alla superfice
interna della membrana
Meccanismo di attivazione dei canali GIRK