ADENO_07_ - Università degli Studi di Roma "Tor Vergata"

ADENOVIRUS
1953 identificazione di un virus come causa del processo
degenerativo di colture cellulari derivate da adenoidi
umane
1954 dimostrazione di effetto citopatico in colture di tessuto
infettate con secrezioni dell’apparato respiratorio
1956 studi epidemiologici confermano l’origine virale
dell’agente eziologico delle malattie acute dell’apparato
respiratorio.
Virus simili causano congiuntiviti e gastroenteriti infantili
ADENOVIRIDAE
più di 100 membri
Adenovirus umani
Sottogruppi
Tropismo cellulare
Sierotipi
A
tratto GI
12, 18, 31
B
polmoni, tratto urinario
3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 50
C
alte e basse vie dell’apparato respiratorio 1, 2, 5, 6
D
tratto GI, occhi
8,10, 13, 15, 17, 19, 20, 22,30,
32, 33, 36,39, 42,49, 51
E
tratto respiratorio
4
F-G
tratto GI
40, 41
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virus generalmente poco patogeni
infezioni lievi ed autolimitanti
STRUTTURA DEGLI ADENOVIRUS
70-100 nm
Core : ds DNA
- covalentemente legato alla proteina TP
- complessato alla proteina VII
proteina X (proteasi)
proteina V
core
proteasi
Capside (252 capsomeri)
240 esoni : trimeri di proteina II
12 pentoni : Base (pentameri di proteina III)
Fibra (trimeri di proteina IV)
proteina IIIA
proteina IX
esoni che circondano i pentoni
esoni delle facce
70-90 nm
proteina VI ancora l’anello di esoni che circondano ipentoni con il core
proteina VIII ancora gli esoni delle facce al core
Il GENOMA degli ADENOVIRUS
(ds DNA: 30-36 Kb)
ITR
SEQUENZE ITR (100bp)
regione ORI (replicazione del genoma)
regioni di controllo trascrizionale
siti di legame per fattori trascrizionali e proteine enhancer
cellulari : NF-I e Oct-I
sequenza di impacchettamento
ITR
Penetrazione di
Adenovirus
•
entrata mediata da endocitosi clatrinadipendente
•
Perdita delle fibre
Lisi della membrana degli endosomi
mediato dalla proteina della base dei
pentoni
•
A livello dei pori nucleari la struttura
capsidica subisce un disassemblaggio
parziale :
- perdita dei pentoni III e della
proteina IIIa
- dissociazione della proteina VIII
-
degradazione proteolitica
della
proteina
VI da parte della proteasi
presente nel virione (adenina)
- perdita della proteina IX
pH
PENETRAZIONE
DEL GENOMA
liberazione del DNA
virale complessato
alla proteina VII
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ESPRESSIONE GENICA degli ADENOVIRUS
geni precoci
geni tardivi
E- geni precoci
L- geni tardivi
50 proteine
I GENI PRECOCI
ITR E1A/B
E2A/B
E3
E4 ITR
GENE E1A
mRNA 13S proteina 289R
mRNA 12S proteina 243R
trans-attivatori trascrizionali
di geni virali e cellulari
progressione del ciclo cellulare
- legame con pRb (Retinoblastoma tumor suppressor protein)
induzione di apoptosi
- stabilizzazione di p53
Ruolo di pRb
nella regolazione della proliferazione cellulare
E1A
E1A
p14
GENE E1A
mRNA 13S proteina 289R
mRNA 12S proteina 243R
trans-attivatori trascrizionali
Alterano la progressione del ciclo cellulare:
Stimolano la replicazione del DNA virale
Bloccano la risposta ci difesa cellulare:
- inibizione di STAT1
- inibizione di IKK
Proteine E1B
55 kDa - lega, inibisce e induce la degradazione di
p53
19 kDa -
omologo di Bcl2 (inibisce oligomerizzazione di
Bax
Stabilizzazione, esporto e traduzione
preferenziale dei trascritti virali.
Inibizione della
cellula ospite.
sintesi
proteica
della
MECCANISMO DI
TRASFORMAZIONE
CAR
integrine
E1A
pRB
geni proliferativi
E1A
E1B
19kd
IB
NF-B
risposta
innata
E1B
55kd
p53
geni pro-apoptotici
ESPRESSIONE GENICA
ITR
E1A/B
VA
E2A/B
L1 L2 L3 L4
E3
E4
ITR
L5
E2A - ssDBP)
E2B - pTP (80KDa) e DNA polimerasi virale
replicazione del DNA
trascrizione dei geni late in sinergia con fattori trascrizionali
ESPRESSIONE GENICA
ITR
E1A/B
VA
E2A/B
L1 L2 L3 L4
E3
E4
ITR
L5
proteine che regolano la risposta della cellula ospite all’infezione
ESPRESSIONE GENICA
ITR
E1A/B
VA
E2A/B
L1 L2 L3 L4
E3
E4
ITR
L5
proteine che regolano la trascrizione del virus e promuovono lo shut-off
della sintesi proteica cellulare
Virus-Associated (VA) RNA
1 o 2 trascritti
lunghezza: 200 basi
codificati dalla Polimerasi III
della cellula ospite
inibizione della
dimerizzazione di PKR
- mantenimento della sintesi proteica
- inibizione delle difese anti-
VAI
VA
Qu i c k T i m e ™ e u n d e c o m p re s s o re T IF F ( No n c o m p re s s o ) s o n o n e c e s s a ri p e r v i s u a l i z z a re q u e s t' i m m
decompressore Photo - JPEG.
occorre QuickTime™ e un
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CICLO
DI
REPLICAZIONE
REPLICAZIONE DEL DNA DI ADENOVIRUS
la sequenza Ori
La sequenza Ori:
sequenza ricca di AT per facilitare lo srotolamento del DNA
localizzata vicino a regioni di legame di fattori trascrizionali
(aumento dell’efficienza di replicazione)
proteina TP legata al terminale 5’ di ogni filamento
REPLICAZIONE DEL DNA DI ADENOVIRUS
la sequenza Ori
reclutamento della Polimerasi virale e
della proteina pre-TP sulla sequenza
core
il legame di NF-1 e Oct-1 alla sequenza
ausiliaria facilita la formazione del
complesso
- la Polimerasi forma un legame
fosfodiesterico tra dCMP e pre-TP
- il 3’OH di dCMP serve da
innesco per la sintesi del DNA
complementare
Replicazione del DNA
l’elica di DNA dislocata forma un
“panhandle” via gli “inverted
terminal repeats”
associazione Pol-pre-TP e ……
sintesi del filamento
complementare
From Flint et al. Principles of Virology (2000), ASM Press
I geni intermedi o precoci-ritardati
gene IX = proteina IX
stabilizzazione del capside virale
trimeri di pIX
QuickTi me™ e un decompre ssore TIFF (Non com press o) so no n ece ssari per vi sual izza re qu est'imm agin e.
esone
gene IVa2 = proteina IVa2
transattivazione del promotore dei geni L in
associazione con L1 52/55 ed E1A
incapsidamento del DNA virale nei capsidi neoformati
ESPRESSIONE DEI GENI TARDIVI
ITR
E1A/B
VA
E2A/B
E3
L1 L2 L3 L4
E4
ITR
L5
unico trascritto viene processato per formare circa 18 mRNA con
estremità 5’ identiche, divisi nei 5 gruppi L
proteine strutturali
proteine scaffold
proteasi
MLTF
E1A
promotore MLP
52 kd
IVa
L1
L2
L3
L4
L5
TRADUZIONE PREFERENZIALE DI mRNA L
trasporto facilitato
blocco del trasporto di mRNA cellulari al citoplasma
accumulo citoplasmatico di mRNA virali
E1B
55KDa
RNA
binding
E4orf6
(34KDa)
NES
?
fattore cellulare
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TRADUZIONE PREFERENZIALE
nelle fasi tardive dell’infezione
blocco della sintesi proteica della cellula ospite
Ad virus
(shutoff proteins :
L ed E proteins)
m7G
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eIF4F
TRADUZIONE PREFERENZIALE
tutti gli mRNA Late contengono una sequenza
di 200 nucleotidi al 5’ (tripartite leader) che
permette il ribosome shunting
L1 - polipeptidi 52/55 kDa e IIIa
L2 - polipeptide III (base dei pentoni)
L3 - polipeptide II (esoni) e proteasi
L4 - polipeptide 100 kDa
L5- polipeptide IV (fibre)
Assemblaggio di adenovirus
proteine
singole
(no poliproteina)
ruolo critico della
proteina L1
(funzione scaffold ?)
citoplasma
- formazione dei trimeri
di proteina II (esoni).
Funzione
essenziale
della proteina L4.
nucleo
- formazione dei pentameri
di proteina III (pentoni)
- formazione dei trimeri di
proteina IV (fibre)
formazione di capsidi vuoti
RILASCIO DEL
VIRUS
disaggregazione del citoscheletro della cellula ospite (L3 proteasi)
E3 - death protein (meccanismo sconosciuto)
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Adenovirus
terapeutici
TERAPIA
GENICA
introduzione del gene esogeno nella cellula “malata”
espressione della proteina
- correzione del difetto genetico
- trasformazione di pro-drug
- blocco del processo tumorale
si degrada velocemente
SistemiIl DNA
di veicolazione
del DNA
Per proteggere il DNA è necessario utilizzare dei sistemi di veicolazione
Meccanismi non virali
liposomi
polimeri cationici
elettropazione
micro-iniezione
buona protezione del DNA
bassa efficienza,
nessuna specificità
assenza di rischio e di
reazioni immunitarie
Meccanismi virali
ottima protezione del DNA
buona efficienza e specificità
possibile rischio di infezione
reazioni immunitarie
ADENOVIRUS
infezioni lievi
sicurezza (assenza di integrazione e/o oncogenicità)
infezione di cellule in divisione e resting
facile manipolazione
VETTORI PER TERAPIA GENICA
1) sicurezza
2) alta infettività e selettività
3) espressione sostenuta del gene terapeutico
VETTORI ADENOVIRALI
inserimento del gene terapeutico mediante ricombinazione omologa
(quantità massima di DNA trasportato :2-3 kb)
VA
ITR Y E1A/B
E2B
L1 L2 L3 L4
transgene
ITR Y E1A/B
ITR Ytransgene
E3
E4
L5
ITR
genoma virale
vettore navetta
ricombinazione
genoma virale
VA
E2B
L1 L2 L3 L4
E3
E4
L5
ITR
vettore adenovirale
La produzione dei vettori adenovirali
avviene in cellule della linea cellulare HEK293)
E1A
293 cell
E1B
VA
ITR Ytransgene
E2B
E3
L1 L2 L3 L4
E4
L5
nucleo
ITR
VETTORI ADENOVIRALI
Trials iniziali per il trattamento della fibrosi cistica (CF)
- bassa efficienza di transfezione
(le cellule transfettate - distrutte dall’infezione virale)
-bassa efficienza di espressione genica
- potente risposta immunitaria
-un esito mortale
(danno cerebrale dovuto a reazione infiammatoria
scatenata dalle elevate quantità di vettore virale
somministrato)
Attualmente non sono utilizzati in trials
di terapia genica nell’uomo
VETTORI ADENOVIRALI
però………
la sperimentazione continua
VETTORI ADENOVIRALI VUOTI o AD ALTA CAPACITA’
Y promoter transgene
ITR
loxP
vettore navetta
VA
E2A/B
Y
genoma virale plasmidico
L1 L2 L3 L4
E4
L5
ITR
ricombinazione in cellule 293
ITR
Y
promoter transgene
VA
E2A/B
E4
L1 L2 L3 L4
ITR
L5
taglio mediato da Cre
ITR
Y
E2B
promoter transgene
ITR
La replicazione dei vettori adenovirali ad alta capacità
avviene in presenza di un costrutto “helper”
ITR
ITR
Y promoter
E2B
transgene
VA
E2A/B
L1 L2 L3 L4
E4
L5
ITR
ITR
VETTORI ADENOVIRALI AD ALTA CAPACITA’
Limitazioni:
contaminazione da helper (in produzioni su larga scala)
bassa resa
scarsa stabilità
Vantaggi:
infezioni lievi
sicurezza (assenza di integrazione e/o oncogenicità)
infezione di cellule in divisione e resting
facile manipolazione
alta capacità (35 kbp)
espressione sostenuta del gene terapeutico (circa 80 giorni)
TERAPIA GENICA CON VETTORI ADENOVIRALI
AD ALTA CAPACITA’
Qui ckTime™ e un decompressore TIFF (N on compresso) sono necessar i per visual izzare q uest' immag ine.
Distrofia muscolare
(sindrome di Douchen)
Fibrosi cistica
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ADENOVIRUS
ONCOLITICI
ADENOVIRUS Onyx - 015
(dl1520)
* non esprime E1B 55K
ITR
*
E1A/B
VA
E2A/B
L1 L2 L3 L4
E3
E4
L5
– delezione di 827-bp nel gene E1B
e parte della regione E3 (gp19K)
ITR
genoma Ad
ADENOVIRUS dl1520
replica solo in cellule difettive per p53
p53 è inattiva nel 50% dei tumori umani
e nel 70% dei tumori della testa e del collo
trials clinici in fase III per carcinomi squamosi della testa e
del collo (somministrazione del mutante virale nella massa
tumorale)