Tecniche
microbiologiche
1
MICROSCOPIO OTTICO
2
Microscopio ottico
3
Ingrandimento
Ingrandimento oculare X
Ingrandimento obbiettivo =
Ingrandimento totale
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Ingrandimento
L’ingrandimento dell’oggetto da osservare è determinato dal
prodotto del potere di ingrandimento dell’oculare (6-10x) per il
potere di ingrandimento dell’obbiettivo (10-100x)
Gli obbiettivi anche in base all’ingrandimento sono definiti a
secco o ad immersione
L’ingrandimento dell’oggetto dovuto alle lenti dell’obbiettivo è
un’immagine reale, ingrandita e rovesciata, viene ingrandita
dall’oculare determinando una immagine virtuale diritta ed
ingrandita
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L’immagine oltre che ingrandita
Deve essere:
Sufficientemente e convenientemente illuminata
Priva di aberrazioni cromatiche e di sfericità
Nitida permettendo la discriminazione di due
punti dell’immagine vicinissimi (potere di
risoluzione dell’obbiettivo)
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Il potere di risoluzione (R) di un
obbiettivo
La capacità di distinguere chiaramente due punti vicinissimi tra
loro è rappresentato da un numero che indica il diametro
dell’oggetto più piccolo perfettamente distinguibile
Più piccolo è il numero migliore risulta il potere risolvente
Il potere di risoluzione è dato dalla seguente formula R=0.61
λ/NA
Λ lunghezza d’onda della luce
NA è l’apertura numerica (n x sen α)
n è l’indice di rifrazione del mezzo interposto tra obbiettivo e
l’oggetto
α è la metà dell’angolo di apertura dell’obbiettivo
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Osservazione a secco
8
OBIETTIVO AD IMMERSIONE
9
Indice di rifrazione
Negli obbiettivi a secco il mezzo interposto è l’aria
l’indice di rifrazione è = 1, tali obbiettivi danno
ingrandimenti non elevati con scarso potere di
risoluzione e apertura numerica inferiore ad 1
Negli obbiettivi ad immersione il mezzo interposto è
l’olio di cedro con indice di rifrazione tra 1,51-1,53,
danno ingrandimenti elevati (100x) con apertura
numerica superiore ad 1
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Microscopio a contrasto di fase
Permette di differenziare meglio le strutture interne dei
microrganismi a fresco in base alla differente rifrazione delle
strutture rispetto al protoplasma circostante
È composto da un diaframma anulare che è formato da un
anello cavo centrale attraverso il quale passano i raggi luminosi
situato al di sotto del condensatore e da una lamina di fase
costituita da materiale trasparente e provvista di un solco
circolare meno spesso corrispondente all’anello cavo del
diaframma situata dietro la lente frontale dell’obbiettivo con
funzione ritardatrice
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MICROSCOPIO A CONTRASTO DI FASE
PIANO DELL’IMMAGINE
OCULARE
ANELLO
DI FASE
OBIETTIVO
CAMPIONE
CONDENSATORE
LUCE
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Osservazione diretta di
preparati non colorati
Preparazione in soluzione fisiologica:
Materiali: NaCl 0,85%, vetrini portaoggetto, paraffina
Tecnica: stemperare una quantità di campione in una
goccia di soluzione fisiologica. Osservazione
Scopo: osservazione preliminare
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Preparazione del vetrino per la
colorazione
Preparazione del materiale
Distensione
Essiccamento
Fissazione
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Fissazione
Al calore: si preserva la morfologia ma non le
strutture intracellulari
Fissazione chimica: protegge le strutture
intracellulari e la morfologia di microrganismi più
grossi e delicati
Meccanismo: il fissante chimico penetra nella cellula
e reagisce con i componenti cellulari (diventano
insolubili ed immobili) Composizione: etanoloacido acetico-formaldeide
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Colorazione semplice
Colorazione con blu di
metilene
Scopo: per l’osservazione
dei batteri (forma,
dimensione)
16
Colorazione di Gram
17
Colorazione di GRAM
Colorazione differenziale
Cristal violetto e lugol si combinano a
formare grosse molecole che precipitano sulla
cellula
Alcool ed acetone dissolvono la membrana
esterna il sottile strato di peptidoglicano è
incapace di trattenere il colore
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Colorazione di Gram
19
Conta delle colonie
20
Assorbanza
21
Metodo per diluizione
22
Metodo per diluizione
23
Metodo per diluizione
24
Metodo per diluizione
25
Numero di cellule
105
106
107
26
Conta microbica utilizzando penna
conta colonie
Conta microbica utilizzando
lente d’ingrandimento
27
CONTACOLONIE ELETTRONICO
28
SEMINA SU PIASTRA PER
ISOLAMENTO COLONIE
29
PRELIEVO DA PIASTRA
30
Prelievo colonia
31
Tecnica per l’isolamento
32
Tecnica di isolamento
33
COLONIE MISTE
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Colture pure e caratteri colturali:
popolazioni microbiche naturali
I microrganismi, quando crescono su un terreno di
laboratorio, sono chiamati coltura.
Colture miste
Differenti specie microbiche
abitano varie parti del corpo
(orale, intestinale, cutanea)
e dell’ambiente
(aria, suolo, acqua).
Colture pure
Popolazione di cellule
derivate tutte da
un’unica cellula madre.
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Coltivazione dei batteri
Per studiare i microrganismi devono poter essere coltivati
in laboratorio.
Per questo scopo si devono conoscere quali sostanze
nutritizie e quali condizioni fisiche essi richiedono.
Queste informazioni hanno consentito di sviluppare
numerosi terreni di coltura.
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Terreni di coltura
Selettivi inibiscono la crescita di un gruppo di
microrganismi mentre permettono la crescita di
altri
Differenziali contengono sostanze che
permettono di evidenziare una determinata
reazione chimica con cambiamento di colore
Arricchiti contengono sostanze (sangue, siero,
emoglobina ) che permettono la crescita di
alcuni microrganismi
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Preparazione dei terreni colturali
1.
Dissoluzione degli ingredienti in volume di H2O.
2.
Determinazione del pH ed eventuale correzione.
3.
Distribuzione in contenitori idonei.
4.
Sterilizzazione.
38
TERRENO A BECCO DI CLARINO
39
TERRENO LIQUIDO
40
Terreni batteriologici
semisolido (+Agar 0,5%)
Solido (+Agar 2%)
41
Terreni solidificabili
Possibilità di aggiungere sostanze termolabili
Mezzi per il conteggio dei batteri.
Mezzi per la caratterizzazione batterica
Terreni di mantenimento.
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Agar
Sostanza polisaccaridica (estere solforico di una molecola
lineare di galattano) di alghe rosse marine della famiglia
delle Geliciaee. La solidificazione varia a seconda del tipo
alga da cui deriva. Non presenta alcuna caratteristica
nutritiva per i microbi.
Componenti fisiche:
punto di fusione 85°C;
stato di soprafusione fino a 42°C;
stato solido <42°C.
43
Terreni solidi: colonia
Capacità di una singola cellula di formare una colonia
Masse visibili di cellule formate dalle successive
divisioni di una o piu’ cellule
Numero di cellule 107-108
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Colonie batteriche
45
Valutazione delle colonie
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
osservazione del terreno attorno alle
colonie (attività metaboliche)
dimensioni (diametro)
margine o bordo.
rilievo
colore
superficie
trasparenza
consistenza.
46
Valutazione delle colonie
S.aureus:
convessa, bordo regolare,
diametro 2-3mm,
cremosa, giallastra,
beta emolisi
E.coli:
cupoliforme,
opaca, grigia,
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EMB agar
Crescita di Batteri Gram-.
Gram+ sono inibiti dall’eosina
e dal blue di metilene, E. coli
produce colonie scure
Enterobacter produce
colonie larghe, violacee
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AGAR SANGUE
Emolisi
49
MANNITOL SALT AGAR
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SENSIBILITA’ AGLI AGENTI
ANTIMICROBICI
Disk Diffusion Test
Determination of MIC
Str
Tet
8
4
2
1
0
Tetracycline (g/ml)
MIC = 2g/ml
Ery
Chl
Amp
51
Definizioni
Concentrazione Minima Inibente (MIC)
E’ la concentrazione più bassa di a.a. in
grado di inibire la crescita microbica
Concentrazione Minima Battericida (MBC)
La più bassa concentrazione di a.a. che determina
la morte del 99,9% dei batteri presenti
52
Determinazione delle sensibilita’ agli agenti antimicrobici mediante
prova per diluizione in terreno liquido. Calcolo della Minima
Concentrazione Inibente (MIC) e della Minima Concentrazione
Battericida (MBC)
53
Determinazione delle sensibilita’ agli agenti antimicrobici mediante
prova per diluizione in terreno liquido. Calcolo della Minima
Concentrazione Inibente (MIC) e della Minima Concentrazione
Battericida (MBC)
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ANTIBIOGRAMMA
55
METODO PER DIFFUSIONE (ANTIBIOGRAMMA)
56
ANTIBIOGRAMMA
57
58
59
RILEVAZIONE BASATA SU PARTICOLARI
PROPRIETA’ DEL VIRUS mediante
EMOAGGLUTINAZIONE
Si basa sulla capacità della proteina emoagglutinina di
legarsi ai recettori presenti sugli eritrociti di alcune specie
animali (emazie di pollo) o su eritrociti umani 0 Rh+.
La reazione di emoagglutinazione causa una aggregazione
(formazione di un reticolo) delle emazie visibile ad occhio
nudo.
Usato per la titolazione del virus influenzale e del virus parainfluenzale
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Emoagglutinazione
Diluizioni seriali 1/2 del campione in multiwell da 96 pozzetti. Aggiunta di uguale
volume di eritrociti diluiti in tampone allo 0.5%. Incubazione a Temperatura ambiente
per circa 1 ora.
Formazione del reticolo dove è presente il virus.
Formazione di un precipitato bottone rosso in
assenza di virus.
Titolo emoagglutinante è rappresentato dall’ultima diluizione che da’
Emoagglutinazione completa
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RILEVAZIONE BASATA SU PARTICOLARI
PROPRIETA’ DEL VIRUS mediante
EMOADSORBIMENTO
Principio identico all’emoagglutinazione ma tecnica eseguita
su colture cellulari. Le cellule infettate esprimono sulla
membrana plasmatica l’emoagglutinina virale.
Vengono aggiunti eritrociti alla coltura cellulare e si attende la
formazione di rosette costituite da una singola cellula infetta
circondata da eritrociti.
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RILEVAZIONE DELL’INFETTIVITA’ mediante
SAGGI BIOLOGICI
Il campione viene posto su colture cellulari
uova embrionate di pollo
animali da esperimento
La moltiplicazione virale può essere valutata tramite:
Visualizzazione effetto citopatico indotto dal virus
Metodiche descritte in precedenza
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Colture cellulari
Colture primarie cellule ottenute da espianto di
tessuto prelevato da un organismo vivente. Durata
1-2 replicazioni cellulari.
Colture continue cellule ottenute da colture
primarie trasformate. Possono essere propagate
indefinitamente.
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Cappa sterile a flusso laminare verticale
Terreno di coltura
Ricco di sali, aminoacidi, vitamine
Fiasca sterile
Incubatore a CO2
Siero fetale bovino
Ricco di fattori di crescita
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RILEVAZIONE DELL’INFETTIVITA’ mediante
VISUALIZZAZIONE EFFETTO CITOPATICO
INDOTTO DAL VIRUS
Valutazione del monostrato cellulare infettato al
microscopio ottico a contrasto di fase
Cellule MDCK
Cellule VERO
Controllo
Infettate con virus influenzale
Controllo
Infettate con virus erpetico
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RILEVAZIONE DELL’INFETTIVITA’ mediante
METODO DELLE PLACCHE
Diluizioni seriali 1/10 del campione su monostrati confluenti di cellule sensibili
all’infezione. Dopo l’infezione aggiunta di uno strato di agar molle e piastre lasciate
in incubatore da 24 a 72 ore per permettere la formazione delle placche (zone
circoscritte di effetto citopatico). Colorazione con coloranti vitali (es. cristalvioletto).
PLACCA teoricamente la progenie virale contenuta in una placca è la
progenie di un singolo clone.
Usato per la titolazione di diversi virus fra cui virus influenzale, virus erpetico,
rhinovirus, coronavirus
TITOLAZIONE
n° di placche/ml = p.f.u./ml
67
