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UNIVERSITA’ DEGLI STUDI NAPOLI FEDERICO II
LAUREA SPECIALISTICA IN
BIOTECNOLOGICHE DEL FARMACO
INSEGNAMENTO DI
FARMACOLOGIA APPLICATA
Titolare
Dr. Roberto Russo
[email protected]
Metodi di studio di farmaci
analgesici
Metodi di studio di farmaci
analgesici
Esistono diverse categorie di f. analgesici:
F. morfino-simili (azione centrale)
FANS (azione periferica e centrale)
Anestetici locali (azione periferica)
F. non oppioidi ad azione centrale
• L’informazione nocicettiva nasce nei sensori periferici
(nocicettori) e arriva ai neuroni del corno posteriore del
midollo spinale.
• Il dolore vero e proprio è la presa di coscienza delle
informazioni nocicettive integrate a livello corticale e
limbico.
• Struttture coinvolte nel dolore:
–
–
–
–
–
–
–
–
–
Corteccia anteriore cingolata
Corteccia somatico sensoriale
Corteccia prefrontale
Corteccia insulare
Ipotalamo
Talamo
Sostanza grigia periacqueduttale
Cervelletto
Gangli della base
SISTEMA
OPPIOIDE E
CONTROLLO
DEL DOLORE
Trasmissione e modulazione del dolore
La percezione del dolore può essere distinta in tre fasi:
1) “Apprezzamento” del dolore nei tessuti periferici a seguito di attivazione
dei sensori del dolore (nocicettori) da parte di mediatori
2) Trasmissione dell’informazione dai nocicettori stimolati al midollo spinale
(corna dorsali) attraverso le fibre afferenti sensitive (C e Aδ)
3) Passaggio dell’informazione ai centri cerebrali superiori (neuroni del
tratto spinotalamico) e attraverso le vie discendenti inibitorie
(mesencefalo e midollo allungato) al midollo spinale
Oppioidi
Oppioidi
Controllo spinale del dolore
Teoria del cancello di Melzack e Wall (1965)
A livello delle corna dorsali del midollo spinale, nell’area definita
sostanza gelatinosa (cellule della lamina II e III), si trova la
prima stazione di controllo delle afferenze nocicettive.
In questa sede si realizza un vero e proprio cancello di accesso
(gate control) alle afferenze nocicettive.
Un ruolo di primo piano è esercitato dagli interneuroni
oppioidergici (soprattutto encefalinergici) che inibiscono il rilascio
di neurotrasmettitori eccitatori dalle terminazioni delle fibre Ad
(mielinizzate, alta velocità di conduzione; l’attivazione determina
dolore pungente e localizzato) e C (non mielinizzate, bassa velocità
di conduzione; l’attivazione determina dolore sordo e continuo).
e recettori
Agonisti dei recettori oppioidi
Effetti farmacologici
Potente effetto analgesico
Gli effetti analgesici sono dovuti alla
capacità di inibire direttamente la
trasmissione ascendente degli impulsi
nocicettivi dalle corna dorsali del midollo
spinale e di attivare i circuiti di controllo
del dolore che scendono dal talamo alle
corna dorsali
PAG = sostanza grigia periacqueduttale
NRPG = nucleo reticolare paragigantocellulare
Meccanismi dell’analgesia mediata da Agonisti
oppioidi
Diversi effetti dell’attivazione dei
recettori oppioidi presenti in sede
post- o presinaptica.
L’attivazione dei recettori m, in sede
postsinaptica, aumenta la conduttaza
al K+ determinando l’insorgenza di
potenziali postsinaptici inibitori
(IPSP) e conseguente riduzione della
scarica dei neuroni diretti ai centri
superiori.
L’attivazione dei recettori m, k, d sui
terminali presinaptici delle fibre
afferenti nocicettive, riduce il
rilascio di trasmettitori eccitatori
coinvolti nel dolore (glutammato,
sostanza P, acetilcolina, etc).
Meccanismo dei recettori per gli oppioidi a
livello centrale
Scelta del test
1) validità del test:
il test deve poter dare un’indicazione su un eventuale utilizzazione
clinica del farmaco;
2) affidabilità del test:
i risultati ottenuti devono essere riproducibili nel tempo;
3) semplicità del test:
lo stimolo doloroso standard deve essere ben definito per ottenere
una risposta dell’animale ben evidente;
4) sensibilità del test usato:
con il test scelto deve essere possibile discriminare tra dosi diverse
della stessa sostanza.
Attività analgesica centrale
Dolore Acuto
Metodo del calore radiante (tail flick) nel topo/ratto
Questa metodica è impiegata per valutare il cambiamento di
sensibilità al calore indotta dall’analgesico oppioide nella coda
dell’animale
E’ un test utile per discriminare f. analgesici oppioidi e non
oppioidi
PROCEDURA
Per ogni dose di f. da testare si usa un gruppo di 10 topi (18-22 g)
Prima della somministrazione del farmaco (veicolo/ controllo positivo)
viene valutata la risposta normale dell’animale allo stimolo termico.
Il topo viene posto in un cilindro di vetro
da cui fuoriesce la coda
L’operatore, tenendo la coda, pone una luce
(fonte di calore) diretta
circa ad 1/3 della lunghezza della coda.
La reazione del topo sarà quella di:
-allontanare la coda dalla fonte di calore (I)
-di scappare dalla gabbia (II)
Tali reazioni sono attese entro 30 secondi dall’inizio della
radiazione, topi che non reagiscono entro tale tempo
vengono scartati dallo studio.
Il farmaco (veicolo/ controllo positivo) sono somministrati sia
per os che s.c. con diversi regimi posologici
Dopo 30, 60 e 120 minuti i topi vengono sottoposti al test
Valutazione dei risultati
La media dei tempi di reazione a 30, 60 e 120 minuti dopo la
somministrazione del F. è paragonata a quella ottenuta al
tempo zero.
Standard: morfina (2 mg/kg/sc), codeina (ED50 12mg/kg/sc)
DERIVATI DELL’OPPIO
SISTEMA NERVOSO CENTRALE
analgesia  soglia dolorifica  reattività al dolore
euforia attivazione dei recettori µ
convulsioni inibizione rilascio del GABA
sedazione depressione del locus ceoeruleus
depressione respiratoria  sensibilità alla CO2
miosi eccitazione parasimatica
emesi attivazione della CTZ
antitosse inibizione del centro della tosse
EFFETTI DEGLI OPPIACEI
SISTEMA GASTROINTESTINALE
Stomaco
 secrez. HCl e motilità
Intestino
 secrezioni
 attività peristaltica
 riduzione velocità di transito
Haffner’s tail clip (pinzettamento della coda)
Questa metodica è impiegata per valutare l’effetto
dell’analgesico oppioide sul dolore meccanico provocato sulla
coda dell’animale
Procedura
Per ogni dose di f. da testare si usa un gruppo di 7-10 topi
(18-22 g)
Prima della somministrazione del farmaco (veicolo/ controllo
positivo) è valutata la risposta normale dell’animale allo
stimolo meccanico
Si pone una clip alla base della coda del topo e si osserva
entro quanto tempo l’animale reagisce (innalzamento della
coda)
Haffner’s tail clip
Il farmaco (veicolo e controllo positivo) è somministrato
per os o per s.c.
Dopo 15, 30 e 60 minuti viene applicata la clip sulla coda (1
cm dal corpo dell’animale). Il tempo di reazione del topo
viene valutato con un cronometro in grado di misurare
variazioni di 1/10 di secondo.
Valutazione dei risultati
Il valore medio del tempo di reazione nel gruppo di
controllo è considerato come riferimento (per ogni
intervallo di tempo dalla somministrazione del f.)
Ogni valore ottenuto maggiore di tale tempo è considerato
positivo e quindi indice di analgesia.
(F. di riferimento: morfina e codeina)
HOT PLATE TEST
HOT PLATE TEST
Temperatura ~ 55°C
Cut off time 60s
Test ad intervalli di 15 min.
Standard morfina (7.5 mg/kg/sc) o codeina (30 mg/kg/sc)
Sedativi, miorilassanti o psico-mimetici causano falsi positivi
Con piastra a 55.5°C si valuta l’effetto di agonisti-antagonisti oppioidi
TAIL IMMERSION
Bagno d’acqua termostatato a 55°C
Cut-off time 15 sec.
Reazione animali naive 1-5.5 sec.
Morfina ha un ED50 di 3.5 mg/kg/sc
Attività analgesica periferica
I f. analgesici ad azione periferica generalmente hanno
anche azione antinfiammatoria (talvolta antipiretica).
Per molti di essi il meccanismo d’azione si basa sull’inibizione
della COX con conseguente riduzione della sintesi di PGs
TEST DELLA FORMALINA
Modello di dolore cronico
Ratti adulti, 200-300 g (0.05 ml di formalina al 10% nella zampa
anteriore + somm. del F s.c. o x os)
Letture effettuate a 30 e 60 minuti
L’animale reagisce leccando e mordendo la zampa iniettata e
sollevandola da terra
Standard morfina (1.7 mg/kg/sc)
Questo test identifica F ad az. analgesica centrale, analgesici ad az.
periferica risultano inefficaci
WRITHING TEST
0.25 ml i.p. di fenchinolone 0.02% in 1% di carbossimetilcellulosa
(0.1 ml acido acetico 0.6%; Acetilcolina, bradichinina e prostaglandina
E1)
N = 6/gruppo
L’animale reagisce al dolore con degli spasmi chiaramente visibili
(writhing)
L’iniezione fatta 5 min prima di iniziare il conteggio, che dura 15
minuti
stiramenti gruppo controllo (C) - stiramenti gruppo trattato x 100%
stiramenti C
Test statistico: analisi della varianza per misure non parametriche (i
campioni non si distribuiscono come una gaussiana)
ED50 indometacina (1.0 di mg/kg p.o.)
ED50 acido acetilsalicilico (30 mg/kg p.o.)
WRITHING TEST
A seconda dell’agente irritante impiegato nel writhing si ha un
maggiore coinvolgimento di un mediatore rispetto ad un altro:
a.acetico 0.6%
si verifica un abbassamento del pH (assimilabile ad un ulcera perforata)
che stimola le fibre nervose
caolino
promuove il rilascio di bradichinina
MgSO4
promuove il rilascio di NO
DOLORE VISCERALE NEL RATTO
Un catetere con un palloncino dilatabile di 7.5 mm introdotto nel duodeno a 15-20
mm dal piloro
La distensione del duodeno determina uno stiramento tipico del writhing.
Lo score si calcola nel seguente modo:
0= comportamento normale dell’animale;
1= comportamento modificato leggermente definito dalla cessazione di esplorazione,
eccessiva pulizia facciale, tremore dei denti e respiro profondo;
2 = comportamento modificato definito come immobilità e/o stiramento degli arti
posteriori (scompare con la rimozione dello stimolo)
3 = intensa attività visceromotoria definita come ripetitivo allungamento del corpo,
estensione degli arti posteriori e del bacino.
morfina ed indometacina sono attive, ma non altri farmaci coinvolti nell’inibizione
delle prostaglandine, come l’acido acetilsalicilico
DOLORE CRONICO
• DOLORE NEUROPATICO
– Legatura o taglio del nervo
• Iperalgesia ed Allodinia
• Artrite ed osteoartrite
• Iperalgesia da carragenina
TEST DI RANDALL SELITTO (ratto/topo)
Questo metodo si basa sul
principio
che
l’infiammazione
amplifica la sensibilità al dolore.
Tale
sensibilità
può
essere
modificata dagli analgesici non
narcotici .
L’infiammazione riduce la soglia
del dolore percepito. Il f.
analgesico tende a riportare tale
soglia alla normalità
TEST DI HARGREAVES
•Stimolazione dei termocettori applicazione di raggi IR
sulla zampa interessata
•Si valuta il tempo (secondi) di resistenza allo stimolo
termico
•Su topi (25-30g) o ratti (200-250g)
•In modelli di dolore neuropatico
Von Frey
Per valutare l’Allodinia meccanica
si utilizza il von frey test
Von Frey Hairs (with grid)
Dynamic Plantar Aesthesiometer (DPA)
Dolore Osteoarticolare
P.A.M. Pressure Application Measurement
Incapacitance Tester
Distruzione del peso sulle zampe: l’animale con dolore (neuropatico o
infiammatorio cronico) tende a poggiarsi su una delle due zampe
(quella “sana”)
FINE