Presentazione del 16_gennaio

Buone regole
Precauzioni da adottare in laboratorio:
-non mangiare nè bere
-indossare il camice
-indossare sempre i guanti quando si
maneggiano i tubini, i gel, le
micropipette
-nel dubbio, chiedere!
LEGGERE BENE IL PROTOCOLLO PRIMA DI INIZIARE
Iniziare pulendo bancone, rack e micropipette
ed organizzando la postazione
Utilizzare un puntale nuovo ogni volta che si pipetta, per
evitare contaminazioni tra diversi campioni
Lo studio delle radiazioni assorbite da una sostanza
(SPETTRO DI ASSORBIMENTO) può essere utilizza
A SCOPO ANALITICO
• Il colore delle sostanze è dovuto al fatto che esse
assorbono specifiche radiazioni e ne lasciano
passare o riflettono altre
• SOSTANZA COLORATA: assorbe solo alcune
radiazioni che costituiscono la luce bianca e
lascia passare tutte le altre
• SOSTANZA INCOLORE: non assorbe nessuna
radiazione che costituisce la luce bianca ma
assorbe radiazioni a lunghezza d’onda comprese
nell’ultravioletto o nell’infrarosso
Il massimo dell’assorbimento dipende dai gruppi
funzionali presenti nelle molecole ed identifica
LO SPETTRO DI ASSORBIMENTO
Spettri di di assorbimento della luce da parte dei
comuni nucleotidi, gli spettri sono quasi identici,
per effettuare misure di assorbimento viene usata
la luce a 260 nm
ASSORBIMENTO DELLA
LUCE ULTRAVIOLETTA
DA PARTE DEGLI Aa
AROMATICI
Il triptofano e la tirosina
Assorbono la luce
ultravioletta, ciò spiega
perché la maggior parte
delle proteine hanno un
caratteristico
assorbimento della luce
ad una lunghezza d’onda
di 280nm
Quantificazione di DNA
-la concentrazione del DNA (in µg/µl) (sapendo che in una cuvetta con un cammino
ottico di 1cm, il DNA a doppio filamento alla concentrazione di 50µg/ml ha A=1 a
260nm, si ottiene che la concentrazione del DNA (µg/ml) è = A260 x 50 µg/ml x il
fattore di diluizione);
-- il rapporto delle letture a 260 e 280 nm (A260/A280). Tale rapporto deve essere ≥
1.8 per una preparazione pura di DNA. Se il rapporto è < 1.8, significa che è presente
una contaminazione da parte di proteine
- partendo dal valore di concentrazione ottenuto, calcolare quanto DNA totale è
presente nella preparazione di partenza.
Purificazione di DNA plasmidico
Sali ed alcol sono aggiunti alla soluzione
acquosa di DNA
L’acqua è una molecola polare.
Il DNA interagisce con l’acqua con interazioni elettrostatiche, venendo dissolto nell’acqua (è idrofilico)
grazie ai gruppi fosfato (PO3-) dello scheletro zuccheri-fosfati.
I sali neutralizzano le cariche sullo scheletro zuccheri-fosfati. Vengono comunemente usati Sodio Cloruro
(NaCl) o Sodio Acetato. In soluzione questo è presente come ioni Na+ e [CH3COO]-.
Gli ioni Na+ neutralizzano le cariche negative PO3- del DNA, rendendo la molecola meno idrofilica, e
quindi meno solubile in acqua.
Perchè gli alcol?
Le interazioni elettrostatiche tra ioni Na+ e PO3- in soluzione sono regolate dalla costante dielettrica della
soluzione (Legge di Coulomb). L’acqua ha una costante dielettrica alta, il che rende difficile l’interazione tra
Na+ e PO3-.
Etanolo o isopropanolo hanno una costante dielettrica minore, consentendo a Na+ di interagire con PO3- ,
schermarne la carica e rendere l’acido nucleico meno idrofilico, causandone la precipitazione.
Elettroforesi su gel
• Permette la separazione di acidi nucleici in funzione delle loro
dimensioni, della carica e della forma
• E’ una tecnica fondamentale per:
l’analisi (elettroforesi analitica)
la purificazione degli acidi nucleici (elettroforesi preparativa)
catodo
anodo
-
+
RNA e DNA sono
carichi negativamente
Gli acidi nucleici sono carichi negativamente ed in un campo elettrico migrano
dal polo negativo verso il polo positivo.
Effetto “setaccio” in un gel uniforme
Nell’elettroforesi gli acidi nucleici vengono sottoposti ad un campo elettrico
(vengono “fatti migrare” o “correre”) all’interno di una matrice (gel di agarosio o
poliacrilammide).
-
+
ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO
L’agarosio
L’agarosio
è un polisaccaride
polisaccaride,,
isolato da un’alga, costituito da
residui alternati di D-galattos
galattosiio e
3,6-anidro
anidro--L-galattosi
galattosio.
L’elettroforesi in gel di agarosio
consente la separazione di
molecole di grandi dimensioni
(100-20.000 paia basi).
Concentrazione
di agarosio
0.8% :
2% :
Risoluzione
0.5 – 20 kb
0.1 – 3 kb
Come si prepara un gel d’agarosio
•Si scioglie l’agarosio in polvere in una soluzione tampone a 100
100°
°C
•Alla soluzione d’agarosio si aggiunge Etidio Bromuro (EtBr
EtBr))
ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO
generatore di corrente
100V
tampone
elettroforetico
0,2A
Polo Polo +
scatola elettroforetica
gel di agarosio 1.2%
ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO
100V
0,2A
Polo Polo +
Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel
gel.. Contiene glicerolo, Blu di
bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocità diversa.
diversa.
ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO
ON
100V
0,2A
Polo Polo +
Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel
gel.. Contiene glicerolo, Blu di
bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocità diversa.
diversa.
ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO
ON
100V
0,2A
Polo Polo +
Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel
gel.. Contiene glicerolo, Blu di
bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocità diversa.
diversa.
Visualizzazione
Il DNA è visualizzato grazie al Bromuro di Etidio, un catione formato da più anelli
aromatici che si intercala tra le basi del DNA. L’EtBr è fluorescente quando esposto
agli UV, e la sua fluorescenza aumenta quando è intercalato.
Luce chiara
Luce UV
Attenzione! Il bromuro di etidio è mutageno:
usare sempre i guanti, evitare inalazione,
contatto con pelle e mucose
Per frammenti lineari di DNA
e/o RNA la distanza di
migrazione è inversamente
proporzionale alle dimensioni
della molecola (ovvero alla sua
lunghezza in basi)
Conoscendo la distanza di
migrazione di frammenti di
dimensione nota (M) posso
“interpolare” la lunghezza
delle molecole A e B
A = 2.5 kb
B = 6 kb
Dai Geni ai Genomi
-EdiSES-
Per acidi nucleici non lineari, la velocità di migrazione è funzione non solo del
rapporto carica/massa, ma anche della forma.
La velocità con cui le molecole
migrano aumenta in funzione
dell’aumentare del numero di
superavvolgimenti della
molecola.
Analisi per restrizione
Il codice della vita
Il DNA, o acido desossiribonucleico, è costituito da lunghe
catene di nucleotidi;
ogni nucleotide è composto da uno zucchero (deossiribosio), un
gruppo fosfato, una base azotata purinica o pirimidinica.
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Il codice della vita
Purine: adenina (A) e
gunina (G);
pirimidine: citosina (C) e
timina (T).
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La struttura del DNA
Watson e Crick nel
1953 dedussero, anche
grazie al lavoro di
Rosalind Franklin e
Maurice Wilkins, che il
DNA è una doppia elica
lunga e spiralizzata.
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La struttura del DNA
Le purine si appaiano con le pirimidine;
tra adenina e timina ci sono due legami a
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idrogeno; tra citosina e guanina ce ne
sono tre;
i filamenti sono antiparalleli: hanno due
direzioni opposte indicate per
convenzione 5’- 3’ e 3’- 5’.
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I cromosomi
I procarioti hanno un
unico cromosoma
circolare costituito da una
sola molecola di DNA.
Gli eucarioti hanno più
cromosomi nei quali l’unica
molecola di DNA lineare è
associata alle proteine,
hanno sequenze ripetute
con funzione sconosciuta.
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La cromatina
È l’insieme di DNA e proteine e ne esistono due tipi:
eterocromatica più condensata e compatta;
eucromatina più dispersa per consentire la trasmissione
di informazioni durante l’interfase.
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Il nucleosoma
La cromatina è formata da
istoni carichi positivamente e
perciò attratti dal DNA;
ci sono 5 tipi di istoni sui
quali si avvolge il DNA
formando il nucleosoma;
ogni nucleosoma è costituito
da 8 molecole di istoni (due
per tipo), l’istone H1 si trova
lungo il DNA.
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Stati di ripiegamento
I nucleosomi si uniscono in una struttura a collana di perle che
si avvolge in anse e quindi in spirali condensate fino a formare
il cromosoma.
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