8.clos - e

Clostridi

Bacilli Gram-positivi
 Sporigeni
 Le
spore sopravvivono
nell’ambiente per molto tempo
 Metabolismo strettamente
fermentativo
 Anaerobi obbligati
Clostridi


Abili fermentatori produttori di acidi
butirrico, acido acetico, butanolo e
acetone
Produzione di enzimi extracellulari:
ruolo ambientale nel ciclo del carbonio
ruolo nell’invasione e nella patologie
Clostridi



La maggior parte sono saprofiti.
Quelli patogeni per l’uomo, innanzitutto
saprofiti in natura e in un certo senso possono
essere considerati patogeni opportunisti.
C. perfrigens, C. difficile, Clostridium tetani, C.
botulinum,
Clostridium perfrigens
Clostridium perfrigens

Produce una grande quantità di esotossine ed
invasine responsabili infezioni chirurgiche.

Agente eziologico della gangrena gassosa e di
gravi infezioni uterine.


Emolisine e enzimi extracellulari ( proteasi, lipasi
collagenasi e ialuronidasi contribuiscono al
processo invasivo del microrganismo
Produzione di un enterotossina responsabile di
intossicazione alimentare (cibo in scatola
sterilizzato in maniera impropria)
C. perfringens: enterite necrotizzante
Ingestione di alimenti contaminati da ceppi di tipo
C
tossina beta
necrosi emorragica della
mucosa intestinale.
E’ frequente in individui con un basso livello di
enzimi proteolitici intestinali (inattivazione della
tossina)
Sintomatologia: dolori addominali, diarrea profusa e
presenza di sangue nelle feci.
Periodo di incubazione: 5-6 ore dall’ingestione di
alimenti contaminati
Tasso di mortalità: 15-25 dei casi non trattati.
C. perfringens: Diagnosi
Forme colturali
Campione clinico: ferita, sangue, feci o alimenti contaminati
AGAR SANGUE a 45°C in anaerobiosi, colonie con emolisi
Evidenza di doppio alone di emolisi dovuto a:
Tossina alfa: grande alone emolisi
incompleto
Tossina teta: alone interno di emolisi completa
Clostridium perfringens su agar sangue dopo 48 h
di incubazione in anaerobiosi a 45°C
Ricerca dell’enterotossina
-Tests immunoenzimatici
-Tecniche molecolari: evidenza del gene
codificante la tossina
Clostridium perfringens su SFP dopo 48 h
di incubazione in anaerobiosi a 37°C
Clostridium difficile

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
Patogeno che causa AAD (diarrea
associata ad antibiotici) e patologie
intestinali più serie come colite e colite
pseudomembranosa.
Le patologie in questione, di solito, non
interessano soggetti sani.
Fattori predisponenti: prolungato uso di
antibiotici, età, interventi chirurgigi gastrointestinali, immuno-compromessi.
Clostridium difficile

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

Due fattori di virulenza: Tossina A e B
Tossina A è un enterotossina che causa
accumulo di fluidi nell’intestino.
Tossina B ha un’ azione citopatica con effetto
estremamente letale.
Le tossine sono molto instabili, degradano a
temperatura ambiente dopo due ore.
Problemi diagnostici se si ricercano nelle feci
dopo tale tempo.
C. difficile: diagnosi
Campione clinico: feci
Terreno selettivo contenente cicloserina, cefoxitina e fruttosio
anaerobiosi per 48h.
C. difficile colonies on blood agar
Ricerca delle tossine in campioni di feci
Colture cellulari (HeLA, VERO, Hep-2)
inoculate con filtrati fecali
Effetto citopatico
Tests immunoenzimatici
Clostridium tetani
Clostridium tetani
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
Agente eziologico del tetano.
Il microrganismo vive nel suolo concimato e nel
tratto intestinale e nelle feci di vari animali.
Portatori sani nell’uomo (0-25%) probabile
transiente della flora intestinale dopo ingestione.
Produce spore nella parte terminale della cellula
Tipica cellula gram positiva anche se la
colorazione da risultati contrastanti specialmente
nei riguardi di cellule vecchie.
Tetano



Malattia con alta mortalità (40-78%).
Responsabile della patologia una potente
neurotossina (Tossina tetanica o
tetanospasmina) prodotta dopo germinazione
sporale in seguito ad accesso delle spore in una
ferita.
Moltiplicazione batterica locale con effetti tossici
lontano dal sito di infezione
Tetano

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
Meno di 150 casi/anno negli U.S. grazie
all’ immunizzazione di numerosi tossoidi.
Molti di questi casi riguardano persone
sopra i 60 anni.
Più di 300.000 casi/anno a livello mondiale
Tetano
patogenesi
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
Piccole punture o ferite lacero contuse vengono
contaminate dalle spore di C. tetani, che germinano
e producono la tossina.
Infezione localizzata spesso con minimo danno
infiammatorio.
La tossina prodotta risale i nervi periferici e agisce
a livello del sistema nervoso centrale.
Sintomi clinici: forti dolorosi spasmi e rigidità dei
muscoli volontari.
Lockjaw, rigidità e spasmi muscolari del tronco e
degli arti.
Tetano
patogenesi


Spasmi dei muscoli della faringe causano
difficoltà nell’inghiottire.
La morte avviene ,quasi sempre, per
problemi che interferiscono con i
meccanismi della respirazione
Tossina tetanica
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
11 ceppi di C. tetani differenti sulla base di
antigeni flagellari distinguibili per diversa
abilita’ nel produrre la tossina.
Tutti, però, producono una tossina identica
dal punto di vista antigenico e
farmacologico
La tossina (Tetanospasmina) e codificata
da un plasmide.
Tossina tetanica



Una delle tre sostanze più tossiche in
natura (difterica e botulinica).
Prodotta durante lisi cellulare.
Dopo inoculazione di spore nelle ferite, e
richiesta una piccola quantità
germinazione sporale e replicazione
cellulare per la produzione della tossina.
Tossina tetanica



La tossina è sintetizzata come singolo
polipeptide di 150kDa
Attivata da una proteasi batterica in due
frammenti B ( heavy chain 100kDa), A (
light chain 50kDa) uniti da un ponte
disulfito.
Anomalia della natura? (nessun vantaggio
per il microrganismo nella patogenesi)
Azione tossina tetanica
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

Tetanospasmina lega i nervi periferici.
Trasportata all’interno degli assoni e attraverso
le giunzioni sinaptiche al SNC.
Si fissa ai recettori gangliosidici delle
terminazioni nervose e, una volta fissata, la
sua azione, consiste nel blocco dei mediatori
chimici dell'inibizione muscolare (glicina, acido
amino-butirrico).
L’impulso nervoso non e’ più sotto il controllo del
meccanismo inibitorio.
Produzione di spasmi muscolari generalizzati.
Azione tossina tetanica
 La
tetanospasmina taglia in maniera
specifica un componente proteico
delle vescicole sinaptiche la
sinaptobrevina II interferendo con lo
stimolo dei neuroni inibitori e di fatto
prevenendo il rilascio dei
neurotrasmettitori dalla cellula.
C. tetani: diagnosi
Si effettua su base clinica
Esame microscopico (materiale da ferite)
Esame colturale: 37°C; anaerobiosi
Agar sangue: colonie beta-emolitiche
con alone di sciamaggio
Ricerca della tetanospasmina: test di
neutralizzazione con antisieri specifici
(topo).
C. tetani: terapia e profilassi
Individui non vaccinati
Individui in cui è stata
somministrata una dose
di richiamo del vaccino
da più di 10 aa
250-500 UI Immunoglobuline
umane antitossina.
neutralizzare la tossina non
legata alle cellule nervose
Vaccino antitetanico
Benzodiazepine per ridurre o
prevenire gli spasmi muscolari.
PROFILASSI
Vaccino: tossina tetanica purificata e trattata con formolo a 37°C.
In Italia si somministra prima di 7 aa e a distanza di 4-5 anni dal
primo ciclo di vaccinazione. Ogni 10 anni si somministra una dose di
richiamo.
Clostridium botulinum
Clostridium botulinum
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
Grande bacillo anaerobio sporigeno.
Ampiamente presente nell’ambiente
Occasionalmente flora transiente del tratto
intestinale di uccelli, mammiferi e pesci.
Esistono 7 tipi tossigenici ognuno produttore di
una immunologica diversa forma di tossina
botulinica (A, B, C1, D, E, F e G).
C e D, conversione lisogena. G, plasmide.
Negli U.S. il tipo A e’ responsabile del 62% dei
casi
Clostridium botulinum


Agente eziologico del botulismo, una
intossicazione alimentare determinata dalla
tossina botulinica che assorbita dal duodeno
e digiuno arriva attraverso il torrente
circolatorio alle sinapsi neuromuscolari
periferiche.
Intossicazione non infezione.
(S. enterotossico)
Clostridium botulinum

Cibi a rischio: carne cruda contaminata
dalla tossina resistente al calore,
soprattutto in scatola per l’ambiente
anaerobico prodotto dalla tecnica
dell’inscatolamento e eventuale impropria
sterilizzazione.
C. botulinum: patogenesi
Fattori di virulenza: neurotossina
Manifestazioni cliniche:
Botulismo alimentare: neurotossina ingerita con
l’alimento contaminato da spore
germinazione
replicazione delle cellule vegetativa con
produzione della tossina.
Tossina è inattivata a 100°C per 10 minuti
bollitura dei cibi contaminati ne determina
l’inattivazione.
Tossina non è inattivata dal pH acido e dagli enzimi
proteolitici dello stomaco.
Botulino



I sintomi clinici iniziano 18-36 ore
dall’ingestione della tossina (debolezza,
vertigini, secchezza delle fauci)
Segni neurologici appaiono molto presto
(visioni offuscate, difficoltà ad inghiottire,
a parlare, crescente debolezza dei muscoli
scheletrici, paralisi respiratoria.
La tossina botulinica può raggiungere
attraverso le fibre nervose il SNC anche se
il SNC raramente risulta coinvolto.
C. botulinum: patogenesi
Botulismo da ferita: spore penetrano attraverso le lesioni cutanee
germinazione crescita e produzione della tossina nella ferita
diffusione della tossina a livello sistemico
botulismo alimentare.
stessa sintomatologia del
Botulismo da inalazione: neurotossina come arma batteriologica.
Botulismo infantile o neonatale: ingestione di spore
germinazione,
moltiplicazione batterica e produzione di tossina nell’intestino del
neonato
paralisi.
Tossinfezione dovuta alla flora microbica intestinale del neonato non
ancora ben sviluppata incapace di competere con C. botulinum.
Botulismo senil-infantile: si manifesta in individui adulti sottoposti a
prolungata terapia antibiotica o con alterata anatomia gastrointestinale.
C. botulinum: epidemiologia
Botulismo alimentare: ingestione di alimenti preparati in casa o
artigianali (verdura in scatola, conserve di pesce) e di carne
conservata.
Italia: 20-50 casi/anno
Epidemia: 1996 (mascarpone)
Est-Europa: elevata incidenza in Armenia, Azerbaijan e Georgia
a causa del consumo elevato di verdure inscatolate e conservate
in casa.
Botulismo infantile: rari casi in Italia mentre negli Stati Uniti
vengono stimati in media 110 casi/anno (attribuita a consumo di
miele contaminato da spore di C. botulinum).
Tossine botulinica

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
Le tossine botuliniche sono simili per struttura e
funzione alla tossina tetanica.
Differiscono dalla tetanica per l’effetto clinico
dovuto al targhet su cellule diverse del sistema
nervoso.
L’azione tossica riguarda il sistema nervoso
periferico riflettendo l’azione della tossina nei
confronti dei neuroni eccitatori a livello delle
giunzioni neuromuscolari.
Paralisi flaccida
Azione della tossina botulinica



Specifica per le terminazioni nervose
periferiche nel punto dove il neurone
stimola il muscolo.
Legame della tossina con il neurone e
blocco del rilascio di acetilcolina attraverso
le vescicole sinaptiche.
Differenti tossine sembrano utilizzare
recettori diversi.
Azione della tossina botulinica



La regione di legame del frammento B e localizzata
vicino la parte carbossi-terminale.
La tossina entra nella cellula mediante endocitosi
mediata dal recettore.
All’interno della cellula i diversi tipi di tossina
differiscono nei meccanismi per i quali inibiscono il
rilascio di acetilcolina anche se e’ stato riportato
anche un meccanismo simile alla tetanospasmina.
Azione della tossina botulinica


Al momento non e’ del tutto chiaro come
la tossina previene il rilascio di acetilcolina.
Recenti evidenze suggeriscono che sia la
tossina botulinica che la tetanica sono
endopeptidasi zinco dipendente che
tagliano proteine coinvolte nel rilascio dei
neurotrasmettitori (sinaptobrevine, snap
25, sintaxina).
C. botulinum: diagnosi
Ricerca della tossina botulinica nel siero, feci,
contenuto gastrico.
Somministrazione del campione clinico non trattato
e trattati al calore nel topo
paralisi flaccida.
Esame colturale in anaerobiosi di feci.
C. botulinum: terapia
Somministrazione di antisiero trivalente
contenente anticorpi verso le tossine A, B ed E.
Vaccinazione con anatossina: non viene praticata.