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IDENTIFICAZIONE DI UN’ATTIVITÀ
ENZIMATICA SU GEL DI POLIACRILAMMIDE E
DETERMINAZIONE DELLA TEMPERATURA
OTTIMALE DI UN ENZIMA
Perchè produrre proteine ricombinanti?
Produzione di grandi quantità di proteine:
 Determinazione della struttura 3D.
 Enzimologia.
 Produzione di anticorpi.
 Usi terapeutici e commerciali
 Biologia cellulare;
 Prodotti di interesse industriale;
 Farmaci e terapia genica;
Come produrre proteine ricombinanti?
 Clonaggio del cDNA eucariotico o del DNA procariotico in un
vettore di espressione.
 Trasfezione/trasformazione in un’opportuna cellula/organismo
ospite.
 Crescita dell’ospite.
 Raccolta delle cellule.
 Caratterizzazione del prodotto.
purificazione della proteina di interesse.
saggi biologici e studi di localizzazione.
Espressione: produrre una proteina codificata
da uno specifico gene
In qualsiasi sistema di espressione......
Clonare il gene in un vettore di espressione.
Trasformazione dell’organismo ospite.
Selezione dei trasformanti.
Produzione delle proteine (es. fermentazione,
colture cellulari).
Tutti i vettori che permettono alta espressione
contengono:
- Elementi Regolatori per controllare la trascrizione
e la traduzione.
- Siti di taglio di endonucleasi di restrizione.
- Una regione che codifica per le funzioni di
replicazione del vettore.
- Un marker di selezione per mantenerela pressione
selettiva sulle cellule che contengono il plasmide.
Sistemi di espressione
Ospiti:
Escherichia coli
Saccharomyces cerevisiae
Pichia pastoris
Baculovirus
Cellule di mammifero in coltura
Animali transgenici (moscerino, topo)
Sistemi specializzati:
oociti di Xenopus
La scelta di un sistema dipende da:
Resa.
Purificazione del prodotto.
Modifiche post-traduzionali.
Manipolazioni genetiche del gene/cDNA.
Costo.
Difficoltà sperimentale.
Sistema di espressione E. coli
Vantaggi:
Resa molto elevata (fino a 500 mg/l di coltura).
Poco dispendioso, tecnologia abbastanza semplice.
Sistemi di espressione ben conosciuti.
Svantaggi:
Assenza
di
modifiche
post-traduzionali
(glicosilazione,
acetilazione, co-fattori etc.).
Dimensione del cDNA clonabile piccola (15 kbp).
Differenze nel “codon usage”.
Espressione in E. coli
•
•
•
•
•
gram negativo
Crescita veloce e alta densità cellulare
Genetica ben conosciuta
Alta disponibilità di vettori e ceppi mutati
nessuna garanzia di produrre una proteina ricombinante
biologicamente attiva.
• Sforzi continui per migliorare questo sistema di
espressione
Proteine di fusione e tags
• Originariamente per rendere la purificazione
semplice (cromatografia per affinità)
• Alcuni partners di fusione facilitano il folding
• Partners di fusione
– maltose binding protein
– glutathione S-transferase (GST)
– DsbA and DsbC
– tioredossina
più
L’ADH catalizza l’ossidazione di diversi alcoli primari (gli alcoli
secondari e terziari non sono buoni substrati) in presenza del
coenzima piridinico NAD+, con un pH ottimale intorno ad 8,0; nella
reazione inversa, numerose aldeidi sono ridotte in presenza di
NADH, con un pH ottimale intorno alla neutralità.
pH 8.0
NAD+
H
H
OH
C
C
H
H
H
NADH + H+
ossidazione
Etanolo
H
H
O
C
C
H
H
Acetaldeide
(Alcool primario)
pH 7.0
L’alcool deidrogenasi di
Bacillus stearothermophilus
(ADH)
L’ADH è un metalloenzima che contiene atomi di
zinco (1 per subunità) che partecipano all’evento
catalitico e stabilizzano la struttura quaternaria
della proteina. Quattro residui di cisteina (1 per
sito attivo) sono essenziali per la catalisi.
Zn2+
37 kDa
Zn2+
Zn2+
Zn2+
148 kDa
punto isoelettrico 4.9
Strutture dell’alcool deidrogenasi
•L’alcool deidrogenasi è stata
prodotta per via ricombinante
nel vettore di espressione
procariotico pTrC99A.
Caratteristiche del plasmide:
•origine di replicazione;
•marker di selezione (amp);
•sito di policlonaggio (MCS);
•lacZ blu-bianco screening;
•promotore e terminatore per
l’espressione trc;
•La sequenza codificante deve
essere inserita nel corretto
codice di lettura.
Attraverso mutagenesi sitospecifica è stata prodotta una
versione mutagenizzata del
gene che a livello proteico
porta alla sostituzione
amminoacidica di carica
Glu11Lys.
gene adh
Pst I
Origine F1
Nco I
Promotore trc
Polilinker
Amp
pTrc99A
4176 cb
Origine pBR322
lac I
Produzione dell’alcool deidrogenasi wild type e
mutante in Escherichia coli
ADH
E.coli
E.coli
pTrcADH
Trasformazione di cellule
competenti di E.coli con i
plasmidi ricombinanti
Piastraggio di E.coli su terreno
LB contenente ampicillina
Inoculo e induzione con IPTG
Raccolta delle cellule e
preparazione degli
estratti cellulari
• Negli estratti di Escherichia coli
trasformati con uno dei due plasmidi è
possibile rivelare l’attività dell’alcool
deidrogenasi eterologa mediante un
dosaggio specifico effettuato ad alta
temperatura.
• Siccome le due proteine (wild-type e
mutata) differiscono soltanto per una
sostituzione di carica (Glu-Lys) esse
possono essere discriminate mediante
elettroforesi
su
gel
nativo
e
colorazione per zimografia.
ELETTROFORESI
migrazione di particelle cariche
sotto l’influenza di un campo elettrico
Molte molecole di interesse biologico
possiedono gruppi ionizzabili che, ad un certo
valore di pH, sono presenti in soluzione come
specie elettricamente cariche
Sotto l’influenza di un campo elettrico
queste molecole cariche migrano verso il
catodo o l’anodo, a seconda che possiedano
una carica positiva (cationi) o negativa (anioni)
Elettroforesi
catodo
anodo
-
+
- +
+ +
-
Velocità di
Migrazione
+
Direttamente proporzionale alla CARICA NETTA
Inversamente proporzionale alla GRANDEZZA
ELETTROFORESI DI PROTEINE
Le proteine hanno una carica netta a
qualunque valore di pH diverso dal loro
punto isoelettrico (pI)
sottoposte ad un campo elettrico le proteine
migreranno verso l’elettrodo di carica
opposta
Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso
nell’intervallo 3-10 e la maggioranza di esse
ha un pI<8
POLIMERIZZAZIONE
Acrilammide
Bis-acrilammide
•Copolimerizzazione dei monomeri di acrilammide in presenza di
piccole quantità di N,N’-metilene bisacrilammide (bis-acrilammide)
•La bis-acrilammide, composta da due molecole di acrilammide
legate da un gruppo metilene, è utilizzata come agente in grado
di formare legami crociati
•I monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda e
occasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammide
In tal modo nella catena è introdotto un secondo sito per
l’estensione
formazione di una matrice con legami
crociati a struttura ben definita
Catalisi radicalica
Acrilammide
metilenbisacrilammide
(estere disolfato di H2O2, catalizzatore)
+ TEMED (iniziatore)
GEL di
POLIACRILAMMIDE
(molto idrofilico =>
Trattiene grosse quantità di acqua)
ACRILAMMIDE
mezzo di supporto utilizzato per l’elettroforesi di
proteine e acidi nucleici
L’acrilammide polimerizzata si presenta sotto
forma di gel
La porosità del gel di poliacrilammide può essere
regolata variando la percentuale di acrilammide
e/o il grado di legami trasversali tra le catene di
acrilammide
La tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecole
proteiche è l’elettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio
dodecil solfato (SDS-PAGE)
• L’SDS-PAGE consente la separazione di molecole con un rapporto
carica/massa identico, ma di dimensioni molecolari diverse
• Nell’SDS-PAGE la matrice del gel è una sostanza reticolata che agisce
come un setaccio, in cui le forze di attrito fanno diminuire la mobilità
elettroforetica delle molecole in relazione alle loro dimensioni
Sodio Dodecil Solfato
CH3(CH2)10CH2OSO3- Na+
proteina
Gel di poliacrilammide
Nella SDS-PAGE la velocità di migrazione è inversamente
proporzionale alle dimensioni della proteina
(il rapporto CARICA/MASSA è uguale per tutte le proteine)
-
+
Gel Impaccatore (Stacking) pH 6.8 (6% di Acrilammide)
Gel Separatore (Resolving) pH 8.8
Dal 12% al 18% di Acrilammide
Xilene cianolo
Blu di bromofenolo
Xilene cianolo
Blu di bromofenolo
• Al termine dell’elettroforesi le proteine
possono essere rivelate mediante colorazione.
• Tutte le proteine possono essere colorate con
il Blue di Coomassie che si lega ai gruppi
peptidici delle proteine.
• la colorazione di attività, o zimografia, sfrutta
invece l’attività biologica della proteina.
Al termine della corsa
elettroforetica il gel è
colorato con una soluzione
contenente acido acetico e
blu di coomassie
L’eccesso di colorante
viene eliminato
decolorando il gel con una
soluzione di etanolo-acido
acetico
Applicazioni dell’SDS-PAGE
Analisi quantitativa delle proteine presenti
nella frazione di interesse
Identificazione del P.M. di proteine
sconosciute
Analisi qualitativa delle proteine presenti
nella frazione di interesse (colorazione con
Blu Coomassie o western blotting)
10 μg di proteine totali del campione da:
Proteina di interesse
Analisi qualitativa e quantitativa
di un SDS-PAGE
1.
2.
3.
4.
5.
STD
Omogenato 5 µl
I purif. 10 µl
II purif. 15 µl
III purif. 20 µl
0,5µg
2,5 µg
Alternativa:
densitometria a scansione
LogPM (Da)
Identificazione del PM di una proteina sconosciuta
mobilità relativa (mm)
Dosaggio di attività enzimatica
L’ADH catalizza l’ossidazione di diversi alcoli primari (gli alcoli
secondari e terziari non sono buoni substrati) in presenza del
coenzima piridinico NAD+, con un pH ottimale intorno ad 8,0; nella
reazione inversa, numerose aldeidi sono ridotte in presenza di
NADH, con un pH ottimale intorno alla neutralità.
pH 8.0
NAD+
H
H
OH
C
C
H
H
H
NADH + H+
ossidazione
Etanolo
H
H
O
C
C
H
H
Acetaldeide
(Alcool primario)
pH 7.0
Esempio di zimografia per analizzare l’espressione di
alcool deidrogenasi in E.coli
1
2
3
4
5
1: controllo negativo
2,3 : ADHmut in E.coli
4,5: ADHwt in E.coli
+
0,9
340nme
assorbimentoto
0,8
NAD+
0,7
0,6
mM
(NADH) = 6,2 mM-1 cm-1
NADH
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
220
230
240
250
260
270
280
290
300
310
320
330
340
350
lunghezza d'onda (nm)
A340 nm
4 mL ADH
2 mL ADH
A= e c l
0
0,5
1
Tempo (min)
360
370
380
Dosaggi di attività enzimatica a differenti temperature
La miscela di reazione è costituita da una soluzione contenente:
2 mM NAD, 30 mM etanolo, tampone 25 mM sodio fosfato pH 8.
Etanolo + NAD
-------------->
Acetaldeide + NADH + H+
Dividendo l’incremento di assorbanza a 340 nm al minuto (DA/min)
per il coefficiente di estinzione millimolare del NADH (6,2 O.D.),
ovvero applicando la legge di Lambert e Beer, si calcolano le
micromoli di NAD ridotto in 1 ml di miscela di reazione (le
Unità Enzimatiche). Tenendo conto dei microlitri utilizzati per il
dosaggio, si calcolano le Unità/ml di soluzione enzimatica.
Il dosaggio è effettuato a differenti temperature e al termine si
riporta in grafico l’attività enzimatica in funzione della
temperatura.
Unità enzimatiche
Grafico termofilia
Temperatura