IV ESERCITAZIONE:

IV ESERCITAZIONE:
Separazione elettroforetica di proteine su gel di poliacrilammide
Il termine elettroforesi descrive la migrazione di molecole dotate di carica sotto
l’influenza di un campo elettrico. Molte molecole di interesse biologico (amminoacidi,
peptidi, proteine, nucleotidi ed acidi nucleici) possiedono gruppi ionizzabili e, quindi,
ad un opportuno valore di pH, sono presenti in soluzione come specie elettricamente
cariche. Nel corso dell’elettroforesi molecole cariche sottoposte ad un campo elettrico si
separano a causa delle loro diverse mobilità.
I fattori che influenzano la mobilità di una molecola sottoposta ad un campo
elettrico comprendono la carica della molecola stessa (q) espressa in coulomb,
l’intensità del campo elettrico applicato (E) e la resistenza di attrito del mezzo di
supporto (f). Il prodotto dei parametri q ed E (F = qE) fornisce la forza, misurata in
newton, che spinge una molecola di carica q verso un elettrodo di carica opposta. La
forza frizionale (f), la quale rallenta il movimento della molecola carica, dipende dalle
dimensioni della molecola in questione, dalla sua forma, dalle dimensioni dei pori del
mezzo nel quale avviene l’elettroforesi e dalla viscosità del tampone.
La velocità (v) di una molecola carica che si sposta in un campo elettrico è data
dalla seguente equazione: v = qE/f.
L'apparecchiatura per l'elettroforesi comprende due componenti principali: un
alimentatore ed una cella elettroforetica. L'alimentatore fornisce un flusso di corrente
costante agli elettrodi applicati alla cella elettroforetica.
L’elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di SDS è uno dei metodi
maggiormente impiegati per separare le proteine e determinarne il peso molecolare
apparente. Tale procedura si basa sulla denaturazione delle proteine ad opera del
detergente dodecilsolfato di sodio (SDS). Tale denaturante anionico si lega saldamente
alle proteine, le quali si ripiegano a formare una sorta di bacchette estese rivestite di
SDS. In presenza di un eccesso di SDS, 1 g di molecole proteiche lega circa 1,4 g di
SDS. In tali condizioni tutte le molecole proteiche in soluzione presentano una carica
negativa costante per unità di massa. Le miscele di molecole proteiche da sottoporre ad
SDS-PAGE sono di solito solubilizzate in un’opportuna soluzione tampone (Tris-HCl a
pH 8.8) contenente SDS 0,1%. La stessa soluzione tampone contiene anche un colorante
tracciante ionizzabile (blu di bromofenolo), il quale consente di seguire l’andamento
della corsa elettroforetica. Sono presenti inoltre saccarosio e glicerolo, i quali hanno la
funzione di rendere più densa la soluzione del campione. Agenti riducenti, quali
ditiotreitolo e ß-mercaptoetanolo, sono aggiunti al fine di ridurre ponti disolfurici
eventualmente presenti nelle molecole proteiche sottoposte all’analisi.
La parte superiore del gel di poliacrilammide, nota come gel di impaccamento, ha
delle peculiari proprietà che consentono la concentrazione delle proteine del campione
in una zona sottile al di sopra del gel di separazione (parte inferiore del gel di
poliacrilammide). I gel di poliacrilammide vengono preparati al momento dell'uso
facendo copolimerizzare acrilammide e metilen-bisacrilammide, un agente in grado di
formare legami crociati. Il processo di polimerizzazione avviene in presenza del
catalizzatore persolfato di ammonio e dell’iniziatore TEMED (N-tetrametilendiamina),
il quale catalizza la decomposizione dello ione persolfato con conseguente formazione
del corrispondente radicale libero: S2O82- + 1e- -----> SO4 2-+ SO4
.
.
Il radicale libero formatosi (R ) trasferisce l'elettrone spaiato sulla catena nascente
di acrilammide (M = monomero di acrilammide) secondo lo schema seguente:
.
.
R + M  RM
.
.
RM + M  RMM
.
RMM + M  RMMM
.
Le dimensioni medie dei pori di un gel di poliacrilammide possono essere regolate
variando la quantità di monomero (acrilammide) o aumentando il grado di legami
trasversali determinati dalla metilenbisacrilammide per ottenere gel con pori più stretti.
2
Esercitazione:elettroforesi su gel di poliacrilammide in SDS
Scopo: visualizzare le proteine presenti nelle frazioni picco ottenute nel corso della
cromatografia eseguita nella seconda esercitazione
Procedura sperimentale
Preparazione del gel separatore (acrilammide al 15%)
Volume della miscela: 10 ml
Reagenti
volume
concentrazione
finale
Tris-HCl 1.5 M pH 8.8
2.5 ml
0,375 M
SDS 20%
50 µl
0.1 %
Acrilammide 30%
4.0 ml
15 %
Temed
10 µl
0.1 %
APS
100 µl
0.1 %
H2O
3.34ml
Preparazione del gel impaccatore (acrilammide al 6%)
Volume della miscela: 10 ml
concentrazione
Reagenti
volume
Tris-HCl 0.5 M pH 6.8
2.5 ml
0.125 M
SDS 20%
50 µl
0.1 %
Acrilammide 30%
2.0 ml
6%
Temed
10 µl
0.1 %
APS
100 µl
0.1 %
H2O
5.34 ml
3
finale
Tampone di corsa (da diluire 1:10 al momento dell’utilizzo)
concentrazione
Reagenti
finale
Tris base
30 g
0.25 M
Glicina
144 g
1.9 M
SDS
10 g
1%
H2 O
ad 1 litro
Campioni:
I campioni sono sciolti nel tampone di carico Tris-HCl 0.125 M, pH 6.8, SDS al 2%,
glicerolo 10%, blu di bromofenolo 0.02%, xilene cianolo 0.02%. Il volume finale dei
campioni è di 15 µl. L’ordine di carico del gel è il seguente:
# 1. Miscela di proteine ricombinanti a peso molecolare noto: 50, 75, 100, 150 e
200 kDa
# 2. RNasi A pura
# 3. campione sottoposto a gel filtrazione
# 4. frazione n°
# 5. frazione n°
# 6. frazione n°
# 7. frazione n°
# 8. frazione n°
# 9. frazione n°
# 10. frazione n°
4
L’elettroforesi è eseguita applicando un campo elettrico di 100-150 mV per circa 1 h.
Al termine della corsa elettroforetica, il gel è sottoposto a colorazione con il colorante
Coomassie Brilliant Blue R-250 (30 min in agitazione) ed a successiva decolorazione in
una soluzione di acido acetico e metanolo.
Risultato:
indicare il PM delle proteine presenti nei vari canali e commentare il risultato della
cromatografia ad esclusione molecolare eseguita nel corso della seconda esercitazione.
#3=
#4=
#5 =
#6 =
#7=
#8=
#9=
#10=
5