IV ESERCITAZIONE: Separazione elettroforetica di proteine su gel di poliacrilammide Il termine elettroforesi descrive la migrazione di molecole dotate di carica sotto l’influenza di un campo elettrico. Molte molecole di interesse biologico (amminoacidi, peptidi, proteine, nucleotidi ed acidi nucleici) possiedono gruppi ionizzabili e, quindi, ad un opportuno valore di pH, sono presenti in soluzione come specie elettricamente cariche. Nel corso dell’elettroforesi molecole cariche sottoposte ad un campo elettrico si separano a causa delle loro diverse mobilità. I fattori che influenzano la mobilità di una molecola sottoposta ad un campo elettrico comprendono la carica della molecola stessa (q) espressa in coulomb, l’intensità del campo elettrico applicato (E) e la resistenza di attrito del mezzo di supporto (f). Il prodotto dei parametri q ed E (F = qE) fornisce la forza, misurata in newton, che spinge una molecola di carica q verso un elettrodo di carica opposta. La forza frizionale (f), la quale rallenta il movimento della molecola carica, dipende dalle dimensioni della molecola in questione, dalla sua forma, dalle dimensioni dei pori del mezzo nel quale avviene l’elettroforesi e dalla viscosità del tampone. La velocità (v) di una molecola carica che si sposta in un campo elettrico è data dalla seguente equazione: v = qE/f. L'apparecchiatura per l'elettroforesi comprende due componenti principali: un alimentatore ed una cella elettroforetica. L'alimentatore fornisce un flusso di corrente costante agli elettrodi applicati alla cella elettroforetica. L’elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di SDS è uno dei metodi maggiormente impiegati per separare le proteine e determinarne il peso molecolare apparente. Tale procedura si basa sulla denaturazione delle proteine ad opera del detergente dodecilsolfato di sodio (SDS). Tale denaturante anionico si lega saldamente alle proteine, le quali si ripiegano a formare una sorta di bacchette estese rivestite di SDS. In presenza di un eccesso di SDS, 1 g di molecole proteiche lega circa 1,4 g di SDS. In tali condizioni tutte le molecole proteiche in soluzione presentano una carica negativa costante per unità di massa. Le miscele di molecole proteiche da sottoporre ad SDS-PAGE sono di solito solubilizzate in un’opportuna soluzione tampone (Tris-HCl a pH 8.8) contenente SDS 0,1%. La stessa soluzione tampone contiene anche un colorante tracciante ionizzabile (blu di bromofenolo), il quale consente di seguire l’andamento della corsa elettroforetica. Sono presenti inoltre saccarosio e glicerolo, i quali hanno la funzione di rendere più densa la soluzione del campione. Agenti riducenti, quali ditiotreitolo e ß-mercaptoetanolo, sono aggiunti al fine di ridurre ponti disolfurici eventualmente presenti nelle molecole proteiche sottoposte all’analisi. La parte superiore del gel di poliacrilammide, nota come gel di impaccamento, ha delle peculiari proprietà che consentono la concentrazione delle proteine del campione in una zona sottile al di sopra del gel di separazione (parte inferiore del gel di poliacrilammide). I gel di poliacrilammide vengono preparati al momento dell'uso facendo copolimerizzare acrilammide e metilen-bisacrilammide, un agente in grado di formare legami crociati. Il processo di polimerizzazione avviene in presenza del catalizzatore persolfato di ammonio e dell’iniziatore TEMED (N-tetrametilendiamina), il quale catalizza la decomposizione dello ione persolfato con conseguente formazione del corrispondente radicale libero: S2O82- + 1e- -----> SO4 2-+ SO4 . . Il radicale libero formatosi (R ) trasferisce l'elettrone spaiato sulla catena nascente di acrilammide (M = monomero di acrilammide) secondo lo schema seguente: . . R + M RM . . RM + M RMM . RMM + M RMMM . Le dimensioni medie dei pori di un gel di poliacrilammide possono essere regolate variando la quantità di monomero (acrilammide) o aumentando il grado di legami trasversali determinati dalla metilenbisacrilammide per ottenere gel con pori più stretti. 2 Esercitazione:elettroforesi su gel di poliacrilammide in SDS Scopo: visualizzare le proteine presenti nelle frazioni picco ottenute nel corso della cromatografia eseguita nella seconda esercitazione Procedura sperimentale Preparazione del gel separatore (acrilammide al 15%) Volume della miscela: 10 ml Reagenti volume concentrazione finale Tris-HCl 1.5 M pH 8.8 2.5 ml 0,375 M SDS 20% 50 µl 0.1 % Acrilammide 30% 4.0 ml 15 % Temed 10 µl 0.1 % APS 100 µl 0.1 % H2O 3.34ml Preparazione del gel impaccatore (acrilammide al 6%) Volume della miscela: 10 ml concentrazione Reagenti volume Tris-HCl 0.5 M pH 6.8 2.5 ml 0.125 M SDS 20% 50 µl 0.1 % Acrilammide 30% 2.0 ml 6% Temed 10 µl 0.1 % APS 100 µl 0.1 % H2O 5.34 ml 3 finale Tampone di corsa (da diluire 1:10 al momento dell’utilizzo) concentrazione Reagenti finale Tris base 30 g 0.25 M Glicina 144 g 1.9 M SDS 10 g 1% H2 O ad 1 litro Campioni: I campioni sono sciolti nel tampone di carico Tris-HCl 0.125 M, pH 6.8, SDS al 2%, glicerolo 10%, blu di bromofenolo 0.02%, xilene cianolo 0.02%. Il volume finale dei campioni è di 15 µl. L’ordine di carico del gel è il seguente: # 1. Miscela di proteine ricombinanti a peso molecolare noto: 50, 75, 100, 150 e 200 kDa # 2. RNasi A pura # 3. campione sottoposto a gel filtrazione # 4. frazione n° # 5. frazione n° # 6. frazione n° # 7. frazione n° # 8. frazione n° # 9. frazione n° # 10. frazione n° 4 L’elettroforesi è eseguita applicando un campo elettrico di 100-150 mV per circa 1 h. Al termine della corsa elettroforetica, il gel è sottoposto a colorazione con il colorante Coomassie Brilliant Blue R-250 (30 min in agitazione) ed a successiva decolorazione in una soluzione di acido acetico e metanolo. Risultato: indicare il PM delle proteine presenti nei vari canali e commentare il risultato della cromatografia ad esclusione molecolare eseguita nel corso della seconda esercitazione. #3= #4= #5 = #6 = #7= #8= #9= #10= 5