CROMATOGRAFIA DI INTERAZIONE IDROFOBICA
La complessità delle proteine fa si che spesso nella loro
struttura vi siano porzioni idrofiliche con altre più
idrofobiche: queste ultime sono in genere almeno
parzialmente protette dalla disposizione tridimensionale
della molecola, presente in ambiente acquoso
Questo tipo di cromatografia sfrutta la presenza di parti
idrofobiche nella struttura terziaria delle proteine,
suscettibili di interazioni con altri gruppi idrofobici disposti
su una matrice utilizzata come fase stazionaria
cromatografica
Per avere successo, l’interazione idrofobica necessita di
concentrazioni saline medio-alte nella fase mobile
Cromatografia per interazione idrofobica (HIC)
Separazione delle proteine sulla base della loro idrofobicita‟ di superficie
I sali ad alta concentrazione riescono ad esporre le regioni idrofobiche,
sottraendo le molecole d‟ acqua ordinate le proteine tendono cosi‟ ad
interagire fra loro (“salting out”). Nella HIC queste regioni cosi‟ esposte
tendono ad interagire con una fase stazionaria costituita da gruppi idrofobici
E‟ una cromatografia che è possibile applicare ad esempio dopo il
frazionamento con ammonio solfato
L‟ eluizione puo‟ essere effettuata diminuendo la forza ionica oppure per
„spiazzamento‟ con detergenti non ionici come ad es. Tween 20, Triton X-100
Fase stazionaria: matrice rivestita di gruppi idrofobici
Fase mobile: solventi polari
Eluente : soluzioni con detergenti non ionici, variazioni di pH,
riduzione della polarità della fase mobile
LIGANDO
Porzione
idrofobica
Molecole d'acqua
legate in modo ordinato
alla superficie idrofobica
Proteina
Molecole d'acqua
liberate in seguito alla
interazione idrofobica
alla superficie idrofobica
LIGANDO
Porzione
idrofobica
Proteina
O
O
CH3
OH
O
http://www.you
tube.com/watch
?v=v6SPK6Zovg
A
Butil Sefaroso
CH3
O
Octil Sefaroso
OH
Fenil Sefaroso
O
O
OH
Alchil Sefaroso
O
O
OH
CH3
CH3
CH3
CROMATOGRAFIA LIQUIDA A FASE
INVERSA
fase stazionaria e’ costituita da catene idrocarburiche
apolari (butile, ottile, ottadecile) che formano un film
liquido legato al supporto di silice
fase mobile è un solvente polare (puo’ essere un
tampone acquoso, metanolo, acetonitrile o miscele)
La fase stazionaria è essenzialmente inerte ed instaura
solo interazioni apolari (idrofobiche) con gli analiti.
La separazione cromatografica avviene principalmente
sulla base delle caratteristiche della fase mobile
In HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) si
utilizzano resine con un diametro inferiore rispetto a
quelle usate nella cromatografia classica
numero più alto di piatti teorici
aumenta anche la resistenza al flusso dell'eluente
(aumento di pressione)
colonna cromatografica rivestita in acciaio
Gli analiti polari eluiscono per primi
e quelli non polari per ultimi
SCELTA DELLA FASE MOBILE
Non tutti i solventi possono essere utilizzati in HPLC
Devono possedere determinate caratteristiche:
• devono essere miscelabili in diverse proporzioni
• non devono interagire chimicamente con gli analiti o gli
altri solventi
• devono avere una bassa viscosità
La fase mobile più comune in HPLC a fase inversa
(RP-HPLC) è costituita da acqua miscelata con
metanolo o acetonitrile
SDS-PAGE
SDS = Sodio Dodecil Solfato
PAGE = PoliAcrilammide Gel Elettroforesi
Metodo ANALITICO per separare le proteine in base
alla loro grandezza e determinare
il GRADO DI PUREZZA delle proteine
ELETTROFORESI
migrazione di particelle cariche
sotto l’influenza di un campo elettrico
Molte molecole di interesse biologico possiedono gruppi
ionizzabili che, ad un certo valore di pH, sono presenti in
soluzione come specie elettricamente cariche
Sotto l’influenza di un campo elettrico queste molecole
cariche migrano verso il catodo o l’anodo, a seconda che
possiedano una carica positiva (cationi) o negativa (anioni)
Elettroforesi
catodo
anodo
-
+
- +
+ +
-
Velocità di
Migrazione
+
Direttamente proporzionale alla CARICA NETTA
Inversamente proporzionale alla GRANDEZZA
Elettroforesi
-
+
- +
+ +
+
Velocità di
Migrazione
Direttamente proporzionale al rapporto
CARICA / MASSA
Elettroforesi su GEL: quando il campo elettrico
viene annullato le proteine restano nel punto che
avevano raggiunto
Elettroforesi su GEL: quando il campo elettrico
viene annullato le proteine restano nel punto che
avevano raggiunto
+
+
+
+
+
+
+
-
Elettroforesi su GEL: quando il campo elettrico
viene annullato le proteine restano nel punto che
avevano raggiunto
+
+
+
+
+
+
+
-
Il tampone deve mantenere costante lo stato di ionizzazione
delle molecole che devono essere separate
Elettroforesi su GEL: quando il campo elettrico
viene annullato le proteine restano nel punto che
avevano raggiunto
Aggiunta del Fissativo
APPARECCHIATURA PER ELETTROFORESI
COMPONENTI PRINCIPALI
Alimentatore
Cella elettroforetica
1. Per elettroforesi su gel verticale
2. Per elettroforesi su gel orizzontale
ELETTROFORESI DI PROTEINE
Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di
pH diverso dal loro punto isoelettrico (pI)
sottoposte ad un campo elettrico le proteine migreranno
verso l’elettrodo di carica opposta
Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso
nell’intervallo 3-10 e la maggioranza di esse ha un pI<8
Ne consegue che ad pH= 8 la maggioranza delle proteine
ha una carica netta negativa e migrerà verso l’anodo
(elettrodo positivo)
ACRILAMMIDE
mezzo di supporto utilizzato per l’elettroforesi di
proteine e acidi nucleici
L’acrilammide polimerizzata si presenta sotto
forma di gel
La porosità del gel di poliacrilammide può essere
regolata variando la percentuale di acrilammide
e/o il grado di legami trasversali tra le catene di
acrilammide
NORME DI SICUREZZA
•L’acrilammide è una potente neurotossina come polvere e in
forma liquida
•Indossare una maschera quando si pesa o utilizza la polvere
•Indossare guanti in tutte le operazioni che prevedono
l’utilizzo di acrilammide
•Le soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate
prima di essere eliminate
•Ogni liquido versato deve essere assorbito immediatamente
con tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un
recipiente apposito per rifiuti tossici
•Una volta polimerizzata l’acrilammide perde tossicità
POLIMERIZZAZIONE
Acrilammide
Bis-acrilammide
•Copolimerizzazione dei monomeri di acrilammide in presenza di
piccole quantità di N,N’-metilene bisacrilammide (bis-acrilammide)
•La bis-acrilammide, composta da due molecole di acrilammide
legate da un gruppo metilene, è utilizzata come agente in grado
di formare legami crociati
•I monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda e
occasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammide
In tal modo nella catena è introdotto un secondo sito per
l’estensione
formazione di una matrice con legami
crociati a struttura ben definita
Catalisi radicalica
Acrilammide
metilenbisacrilammide
(estere disolfato di H2O2, iniziatore)
+ TEMED (catalizzatore)
GEL di
POLIACRILAMMIDE
(molto idrofilico =>
Trattiene grosse quantità di acqua)
