VII Lezione 16-17
annuncio pubblicitario
CROMATOGRAFIA DI INTERAZIONE IDROFOBICA La complessità delle proteine fa si che spesso nella loro struttura vi siano porzioni idrofiliche con altre più idrofobiche: queste ultime sono in genere almeno parzialmente protette dalla disposizione tridimensionale della molecola, presente in ambiente acquoso Questo tipo di cromatografia sfrutta la presenza di parti idrofobiche nella struttura terziaria delle proteine, suscettibili di interazioni con altri gruppi idrofobici disposti su una matrice utilizzata come fase stazionaria cromatografica Per avere successo, l’interazione idrofobica necessita di concentrazioni saline medio-alte nella fase mobile Cromatografia per interazione idrofobica (HIC) Separazione delle proteine sulla base della loro idrofobicita‟ di superficie I sali ad alta concentrazione riescono ad esporre le regioni idrofobiche, sottraendo le molecole d‟ acqua ordinate le proteine tendono cosi‟ ad interagire fra loro (“salting out”). Nella HIC queste regioni cosi‟ esposte tendono ad interagire con una fase stazionaria costituita da gruppi idrofobici E‟ una cromatografia che è possibile applicare ad esempio dopo il frazionamento con ammonio solfato L‟ eluizione puo‟ essere effettuata diminuendo la forza ionica oppure per „spiazzamento‟ con detergenti non ionici come ad es. Tween 20, Triton X-100 Fase stazionaria: matrice rivestita di gruppi idrofobici Fase mobile: solventi polari Eluente : soluzioni con detergenti non ionici, variazioni di pH, riduzione della polarità della fase mobile LIGANDO Porzione idrofobica Molecole d'acqua legate in modo ordinato alla superficie idrofobica Proteina Molecole d'acqua liberate in seguito alla interazione idrofobica alla superficie idrofobica LIGANDO Porzione idrofobica Proteina O O CH3 OH O http://www.you tube.com/watch ?v=v6SPK6Zovg A Butil Sefaroso CH3 O Octil Sefaroso OH Fenil Sefaroso O O OH Alchil Sefaroso O O OH CH3 CH3 CH3 CROMATOGRAFIA LIQUIDA A FASE INVERSA fase stazionaria e’ costituita da catene idrocarburiche apolari (butile, ottile, ottadecile) che formano un film liquido legato al supporto di silice fase mobile è un solvente polare (puo’ essere un tampone acquoso, metanolo, acetonitrile o miscele) La fase stazionaria è essenzialmente inerte ed instaura solo interazioni apolari (idrofobiche) con gli analiti. La separazione cromatografica avviene principalmente sulla base delle caratteristiche della fase mobile In HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) si utilizzano resine con un diametro inferiore rispetto a quelle usate nella cromatografia classica numero più alto di piatti teorici aumenta anche la resistenza al flusso dell'eluente (aumento di pressione) colonna cromatografica rivestita in acciaio Gli analiti polari eluiscono per primi e quelli non polari per ultimi SCELTA DELLA FASE MOBILE Non tutti i solventi possono essere utilizzati in HPLC Devono possedere determinate caratteristiche: • devono essere miscelabili in diverse proporzioni • non devono interagire chimicamente con gli analiti o gli altri solventi • devono avere una bassa viscosità La fase mobile più comune in HPLC a fase inversa (RP-HPLC) è costituita da acqua miscelata con metanolo o acetonitrile SDS-PAGE SDS = Sodio Dodecil Solfato PAGE = PoliAcrilammide Gel Elettroforesi Metodo ANALITICO per separare le proteine in base alla loro grandezza e determinare il GRADO DI PUREZZA delle proteine ELETTROFORESI migrazione di particelle cariche sotto l’influenza di un campo elettrico Molte molecole di interesse biologico possiedono gruppi ionizzabili che, ad un certo valore di pH, sono presenti in soluzione come specie elettricamente cariche Sotto l’influenza di un campo elettrico queste molecole cariche migrano verso il catodo o l’anodo, a seconda che possiedano una carica positiva (cationi) o negativa (anioni) Elettroforesi catodo anodo - + - + + + - Velocità di Migrazione + Direttamente proporzionale alla CARICA NETTA Inversamente proporzionale alla GRANDEZZA Elettroforesi - + - + + + + Velocità di Migrazione Direttamente proporzionale al rapporto CARICA / MASSA Elettroforesi su GEL: quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto Elettroforesi su GEL: quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto + + + + + + + - Elettroforesi su GEL: quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto + + + + + + + - Il tampone deve mantenere costante lo stato di ionizzazione delle molecole che devono essere separate Elettroforesi su GEL: quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto Aggiunta del Fissativo APPARECCHIATURA PER ELETTROFORESI COMPONENTI PRINCIPALI Alimentatore Cella elettroforetica 1. Per elettroforesi su gel verticale 2. Per elettroforesi su gel orizzontale ELETTROFORESI DI PROTEINE Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso dal loro punto isoelettrico (pI) sottoposte ad un campo elettrico le proteine migreranno verso l’elettrodo di carica opposta Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nell’intervallo 3-10 e la maggioranza di esse ha un pI<8 Ne consegue che ad pH= 8 la maggioranza delle proteine ha una carica netta negativa e migrerà verso l’anodo (elettrodo positivo) ACRILAMMIDE mezzo di supporto utilizzato per l’elettroforesi di proteine e acidi nucleici L’acrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gel La porosità del gel di poliacrilammide può essere regolata variando la percentuale di acrilammide e/o il grado di legami trasversali tra le catene di acrilammide NORME DI SICUREZZA •L’acrilammide è una potente neurotossina come polvere e in forma liquida •Indossare una maschera quando si pesa o utilizza la polvere •Indossare guanti in tutte le operazioni che prevedono l’utilizzo di acrilammide •Le soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima di essere eliminate •Ogni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente apposito per rifiuti tossici •Una volta polimerizzata l’acrilammide perde tossicità POLIMERIZZAZIONE Acrilammide Bis-acrilammide •Copolimerizzazione dei monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantità di N,N’-metilene bisacrilammide (bis-acrilammide) •La bis-acrilammide, composta da due molecole di acrilammide legate da un gruppo metilene, è utilizzata come agente in grado di formare legami crociati •I monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda e occasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammide In tal modo nella catena è introdotto un secondo sito per l’estensione formazione di una matrice con legami crociati a struttura ben definita Catalisi radicalica Acrilammide metilenbisacrilammide (estere disolfato di H2O2, iniziatore) + TEMED (catalizzatore) GEL di POLIACRILAMMIDE (molto idrofilico => Trattiene grosse quantità di acqua)
