TESI COLON 2 - Oncoematologia Pediatrica
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Risultati 4.2. Quantificazione dei livelli di espressione genica di MYCN in linee di cancro colorettale Per quantificare l’espressione genica dell’oncogene MYCN nelle linee cellulari di cancro colorettale è stata utilizzata l’analisi quantitativa PCR RealTime (qPCR) al fine di confrontare i dati ottenuti tramite FISH. L’analisi è stata realizzata normalizzando la media dei Ct di MYCN sui valori di Ct del gene housekeeping, la β-actina, utilizzato come controllo endogeno perché normalmente espresso in maniera quasi costante in tutte le cellule dell’organismo. I dati sono stati ottenuti confrontando l’espressione basale del gene MYCN e MYC nelle linee cellulari di cancro colorettale utilizzate. Ct ESPRESSIONE BASALE DI mRNA DI MYCN 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 MYCN MYC media housekeeping SW 0 48 SW 0 62 CO LO 5 20 CA CO 2 Vo Lo VA CO 5 SW 8 94 16 29 T1 HT HC CELL LINES Grafico 1. Ct delle linee cellulari di cancro colorettale usate negli esperimenti. Inoltre è stato valutato il LogRatio che esprime la quantità relativa d’espressione del gene MYCN nelle linee cellulari di cancro colorettale Risultati relativamente alla linea cellulare di riferimento H526, linea di Small Cell Lung Cancer che sovraesprime MYCN (Ct=24). Log Ratio Espressione MYCN 0 -2 -4 -6 -8 -10 -12 -14 -16 CO 5 20 LO 0 48 SW 29 HT 8 94 SW 0 62 SW 2 CO CA Vo Lo 5 CO VA 16 T1 HC Cell lines Grafico 2. Espressione basale di mRNA di MYCN nelle linee cellulari di CRC. Analogamente a quanto fatto per l’oncogene MYCN, si è valutata l’espressione dell’oncogene MYC relativamente alla linea di riferimento H82, linea di Small Cell Lung Cancer, che sovraesprime MYC (Ct=18,1) (Grafico 3). Log Ratio Espressione MYC 0 -2 -4 -6 -8 -10 -12 -14 -16 -18 CA CO 2 SW 94 8 HT 29 Lo Vo CO LO 20 5 VA CO 5 HC T1 16 SW 62 0 SW 48 0 Cell lines Grafico 3. Espressione basale di mRNA di MYC nelle linee cellulari di CRC. 4.3. Western Blot: valutazione dell’espressione dell’oncoproteina N-Myc Per verificare l’effettiva corrispondenza tra livelli genici e proteici relativi all’oncogene MYCN si è valutata, mediante Western Blot, Risultati l’espressione basale della proteina N-Myc nelle diverse linee cellulari di cancro colorettale utilizzate (fig. 9-10). Verificata l’espressione di tale proteina nelle linee cellulari, si è una seconda proteina, la β-actina, in quanto quest’ultima viene valutata costitutivamente espressa nelle cellule per cui rappresenta un utile mezzo di controllo al fine di esaminare che sia stata caricata un uguale quantità di proteine sul gel (fig. 9-10). SW480 SW620 SW948 LoVo 65 kDa N-Myc 50 kDa β-actina Fig. 9 Visualizzazione dell’oncoproteina N-Myc e della proteina β-actina nelle linee di CRC VACO5 COLO205 CACO2 HT29 HCT116 65 kDa N-Myc 50 kDa β-actina Fig. 10 Visualizzazione dell’oncoproteina N-Myc e della proteina β-actina nelle linee di CRC 4.4. Trattamento con PNA anti MYCN: valutazione mediante qPCR Dopo aver analizzato i livelli basali d’espressione relativi agli oncogeni MYCN e MYC si è passato al trattamento alle 12 ore con PNA anti-MYCN Risultati sulla linea COLO 205 per testarne l’effetto sul trascritto. Come si può notare in grafico 4, non si riscontra alcuna significativa risposta nè a seguito del trattamento con PNA mutato nè dopo trattamento di PNA anti-MYCN (i valori di LogRatio inferiori all’unità sono infatti trascurabili). LIVELLO DI ESPRESSIONE DI N-MYC E C-MYC DOPO TRATTAMENTO CON PNA 12 ore 0,8 LOG RATIO 0,6 0,4 0,2 N MYC C MYC 0 -0,2 -0,4 -0,6 PNA PNA mutato Grafico 4. Livello di trascritto degli oncogeni MYCN e MYC nella linea COLO205 alle 12 ore dopo trattamento con PNA. 4.5. Trattamento con siRNA anti-MYCN e anti-MYC: valutazione mediante qPCR Dopo aver valutato gli effetti del trattamento con il PNA, si è passati al trattamento con siRNA anti-MYCN e anti-MYC sulla linea COLO 205 per testarne l’effetto sul trascritto. Come si può notare nei grafici 5 e 6, vi è una significativa inibizione per MYCN e MYC specifica in relazione al tipo di siRNA utilizzato. Il trattamento con il siRNA anti-MYCN è stato condotto a diverse concentrazione e a diversi tempi (24 e 48 ore). Di seguito sono riportati i risultati: Risultati LIVELLI DI EPRESSIONE DI MYCN DOPO TRATTAMENTO CON siRNA anti-MYCN 0 LOG RATIO -0,5 -1 24h -1,5 48h -2 -2,5 -3 siRNA NMYC 100nM siRNA NMYC 250nM siRNA NMYC 500nM siRNA NMYC 1μM scramble Grafico 5. Analisi dell’attività dei siRNA anti-MYCN in funzione delle dosi e dei tempi di trattamento. Le concentrazioni 100nM, 250nM, 500nM e 1μM evidenziano una significativa risposta in termini di calo del trascritto; quella che meglio di tutte esplica l’effetto inibente è la concentrazione 1μM, con un buon effetto già alle 24 ore e un incremento dell’azione alle 48 ore (LogRatio rispettivamente di 1,8 e -2,4). Analogamente per i siRNA anti-MYC sono state saggiate varie concentrazioni alle 24 e 48 ore. LIVELLI DI EPRESSIONE DI MYC DOPO TRATTAMENTO CON siRNA anti-MYC 0,5 0 LOG RATIO -0,5 -1 24h -1,5 48h -2 -2,5 -3 siRNA CMYC 100nM siRNA CMYC 250nM siRNA-C MYC 500nM siRNA-C MYC 1μM scramble Risultati Anche in questo caso, è stata determinata la concentrazione a maggiore capacità inibente, che risulta essere la 100nM (con valori di LogRatio pari a 1,1 e -2,5 rispettivamente alle 24 e 48 ore). Come visibile nei grafici 5 e 6, sono stati usati siRNA a sequenza casuale (scrambled) come verifica della specifica azione dei siRNA progettati su MYC e MYCN. Tale specificità è inoltre verificata dal fatto che il trattamento con siRNA anti-MYCN non porta al silenziamento di MYC e la stessa cosa vale anche per il siRNA anti-MYC (Grafico 7 e 8). Grafico 6. Analisi dell’attività dei siRNA per MYC in funzione delle dosi e dei tempi di trattamento. LOG RATIO LIVELLI DI EPRESSIONE DI MYC DOPO TRATTAMENTO CON siRNA anti-MYCN 0,4 0,2 0 -0,2 -0,4 -0,6 -0,8 -1 -1,2 -1,4 -1,6 -1,8 -2 24h 48h siRNA NMYC 100nM siRNA NMYC 250nM siRNA NMYC 500nM siRNA NMYC 1μM scramble Grafico 7. Analisi dell’effetto su MYC dei siRNA anti-MYCN LOG RATIO LIVELLI DI EPRESSIONE DI MYCN DOPO TRATTAMENTO CON siRNA anti-MYC 0,8 0,6 0,4 0,2 0 -0,2 -0,4 -0,6 -0,8 -1 -1,2 -1,4 -1,6 -1,8 -2 24h 48h siRNA CMYC 100nM siRNA CMYC 250nM siRNA-C MYC 500nM siRNA-C MYC 1μM scramble Grafico 8. Analisi dell’effetto su MYCN dei siRNA anti-MYC Risultati Il trattamento con i siRNA è stato effettuato anche sulle linee cellulari SW480 e SW620 alle 24 ore a diverse concentrazioni con i seguenti risultati: Grafico 9. Analisi dell’attività dei siRNA anti-MYCN in funzione della dose sulla linea SW480 Grafico 10. Analisi dell’attività dei siRNA anti-MYC in funzione della dose sulla linea SW480 Le concentrazioni che mostrano efficacia sulla linea cellulare SW480 sono sono la 100nM per il siRNA anti-MYCN, mentre per il siRNA anti-MYC Risultati la concentrazione inibente è la 500nM (con un LogRatio rispettivamente di 2,5 e-1,5). Per la linea SW620, invece, le concentrazioni efficaci sono la 100nM per il siRNA anti-MYCN e le 250 e 500 nM per il siRNA anti-MYC (con un LogRatio rispettivamente di -1,3, -1,2 e -1,5) Grafico 11. Analisi dell’attività dei siRNA anti-MYCN in funzione della dose sulla linea SW620 Grafico 12. Analisi dell’attività dei siRNA anti-MYC in funzione della dose sulla linea SW620 Risultati 4.6. Effetto del trattamento con siRNA anti MYCN e antiMYC sulla proliferazione cellulare Le cellule sono state piastrate (circa 15000 per pozzetto) e sono state trattate con siRNA anti-MYCN ed anti-MYC a diverse concentrazioni. Ad una prima analisi delle cellule al microscopio ottico è già visibile l’effetto del trattamento; si può infatti notare una ridotta densità cellulare nel caso dei trattati se confrontati con le cellule di controllo (non trattate), che tendono a formare aggregati con presenza di cellule morte (Fig.11-12). Fig 11. A.Cellule di controllo alle 24 ore. B.Cellule di controllo alle 48 ore Fig 12.A. Cellule trattate alle 24 ore. B.Cellule trattate alle 48 ore Risultati Per valutare l’effettiva vitalità cellulare è stato fatto il saggio ATPlite e, come evidente dal grafico 13, per le concentrazioni efficaci l’effetto del trattamento è già visibile alle 24 ore e raggiunge un picco di intensità alle 48 ore, per poi iniziare a decadere. 24h Effetto siRNA su COLO205 72h 10 00 YC 50 0 si M YC 25 0 si M YC 10 0 si M si M N YC YC 10 00 50 0 N si M si M YC N 10 0 YC N si M YC si M AM SC R 25 0 100 80 60 40 20 0 BL E % proliferazione 48h siRNA Grafico 13. Percentuale di proliferazione nei tre giorni dopo trattamento con siRNA anti-MYCN e anti-MYC a diverse concentrazioni La percentuale d’inibizione maggiore per i siRNA anti-MYCN è quella osservata alla concentrazione di 1μM che risulta del 26% alle 24 ore per arrivare al 55% alle 48 ore e calare al 39,5% alle 72 ore. Tuttavia sono particolarmente significativi anche i dati osservati per le concentrazioni 100nM, 250nM e 500nM che raggiungono rispettivamente il picco del 46% 38%, 52,5% di inibizione alle 48 ore. Risultati Curva di crescita 280000 240000 CTRL siMYCN 100 siMYCN 1000 siMYCN 250 siMYCN 500 SCRAMBLE 200000 Cps 160000 120000 80000 40000 0 24h 48h 72h Tempo (h) Grafico 14. Curva di crescita nei tre giorni dopo trattamento con siRNA anti-MYCN a diverse concentrazioni Per ciò che concerne i siRNA anti-MYC l’unica concentrazione efficace risulta essere la 100nM che porta ad un calo della proliferazione del 31% alle prime 24 ore fino al 49% alle 48 ore. Curva di crescita 280000 240000 Cps 200000 CTRL siMYC 100 siMYC 1000 siMYC 250 siMYC 500 160000 120000 80000 40000 0 24h 48h 72h Tempo (h) Grafico 15. Curva di crescita nei tre giorni dopo trattamento con siRNA anti-MYC a diverse concentrazioni Risultati 4.7. Il silenziamento causa un differente profilo d’espressione genica Effettuato il trattamento sulle cellule COLO 205 con gli siRNA antiMYCN alle diverse concentrazioni e osservato il decremento a livello trascrizionale di MYCN, sono stati analizzati alle 24 e 48 ore dopo il trattamento i profili di espressione di alcuni geni importanti nella regolazione del processo apoptotico. I geni presi in considerazione sono stati DR5, TRAIL, TNF, TNFAIP3, DDIT3, GADD45A e SURVIVINA con i seguenti risultati: . 24 ORE siRNA NMYC 100nM siRNA NMYC 250nM siRNA NMYC 500nM siRNA NMYC 1μM 3 LOG RATIO 2 1 0 RV IV IN A FA IP 3 TR AI L TN TN F 5 DR IT 3 DD 45 A K3 DK AD D G SU BE TA CA TE N -2 IN A CI CL IN A D -1 GENES Grafico 16. Effetto del trattamento con siRNA anti-MYCN alle 24 ore sulla linea cellulare COLO 205. Risultati 48 ORE siRNA NMYC 100nM siRNA NMYC 250nM siRNA NMYC 500nM siRNA NMYC 1μM LOG RATIO 5 3 1 -1 A IN IV RV L AI SU TR 3 IP FA 5 F TN TN DR A 45 3 IT D AD DD G K3 DK D A A IN IN CL N CI TE CA -5 TA BE -3 GENES Grafico 17. Effetto del trattamento con siRNA anti-MYCN alle 48 ore sulla linea cellulare COLO 205. . Alle 24 ore, l’unico gene che mostra una significativa risposta è DR5 che presenta un aumento di espressione superiore alle 2 unità di LogRatio alla concentrazione di siRNA 1μM con una variazione superiore alle 48 ore (LogRatio pari a 3,3). Alle 48 ore anche gli altri geni in analisi modificano in modo significativo la loro espressione. TRAIL mostra una variazione pari a 3,2 unità di LogRatio per i siRNA a concentrazione 100nM e 1μM. Il gene GADD45A mostra un aumento del livello di espressione pari a 2,3 unità per la concentrazione di siRNA 1μM. Il gene DDIT3 (DNA-damage-inducible transcript 3) mostra alle 48 ore un aumento importante che nel caso del siRNA alla concentrazione 1μM è pari a 3,3 unità di LogRatio. Il gene TNF e TNFAIP3 mostrano rispettivamente un incremento e una riduzione nell’espressione dopo il trattamento con un valore di LogRatio rispettivamente di 1,7 e -1,3 alla concentrazione di siRNA 1μM. Risultati Infine la survivina evidenzia un’importante diminuzione del livello di trascritto (con un LogRatio di circa -3 unità per tutte le concentrazioni di siRNA usate). Sono stati inoltre studiati geni che codificano per proteine agenti a diverso livello nel pathway WNT: il gene codificante DKK3, il gene per la beta-catenina e per la ciclina D. La beta-catenina e la ciclina D, mostrano alle 48 ore un’evidente riduzione del trascritto (rispettivamente di -3,3 e -3,8 unità di LogRatio per la concentrazione 1μM); l’antagonista del pathway WNT, DKK3 (Dickkopf homolog 3), mostra invece in risposta al trattamento un incremento di espressione (1,8 unità di LogRatio per la concentrazione 1μM). I dati osservati sono specifici per il trattamento con siRNA anti-MYCN; infatti l’utilizzo del siRNA scrambled non determina alcuna risposta significativa sui geni analizzati (dati non riportati in grafico). Conclusioni CONCLUSIONI Il cancro colorettale rappresenta i due terzi di tutti i tumori maligni gastrointestinali. A monte del processo di tumorigenesi c’è la deregolazione del pathway WNT. Da studi sul neuroblastoma si è visto che tale pathway è collegato con l’oncogene MYCN mediante l’antagonista DKK3. Si può pensare ad un analogo collegamento anche nel CRC e ipotizzare che la sovraespressione di MYCN agisca in questo tumore, in modo sinergico con la ricorrente inattivazione di APC, nel deregolare il pathway WNT. Studi condotti su campioni di colon provenienti da pazienti hanno mostrato che è presente un’amplificazione di MYCN significativamente più comune per frequenza ed intensità nel tessuto tumorale piuttosto che in quello normale ed è inoltre stato osservato che tutti gli adenocarcinomi hanno più alti livelli di proteine Myc rispetto alla normale mucosa del colon. Alcune delle linee usate in questo studio hanno mostrato un’amplificazione e una relativa sovraespressione di MYCN il che le rende un buon modello rappresentativo di quella percentuale di campioni provenienti da pazienti in cui è stata trovata un’amplificazione e una sovraepressione dell’oncogene stesso. In questo lavoro si è focalizzata l’attenzione sulla valutazione e validazione del ruolo degli oncogeni MYC come potenziali bersagli farmacologici per il trattamento del cancro colorettale. Dopo un’iniziale caratterizzazione delle diverse linee cellulari da un punto di vista citogenetico, trascrizionale e proteico si è voluto valutare l’effetto derivante dall’inibizione degli oncogeni di interesse. Lo studio si è inizialmente avvalso dell’utilizzo di una molecola inibitrice, il PNA anti-gene anti-MYCN: la linea COLO 205 è stata sottoposta al trattamento per valutarne gli effetti a livello trascrizionale, tuttavia non si è Conclusioni osservata alcuna risposta. Probabilmente le cellule in questione sono molto resistenti e l'ingresso del PNA è risultato di conseguenza difficoltoso; per questo motivo per saggiare gli effetti di un’inibizione su MYCN si è passati al trattamento con gli siRNA. Le cellule COLO 205 sono state trattate con siRNA anti-MYC e antiMYCN a diverse concentrazioni. È stato valutato l’effetto del trattamento sulla proliferazione e avendo osservato che per le concentrazioni efficaci c’è una riduzione della capacità inibitoria dopo le 48 ore, si è studiata la risposta in termini trascrizionali al trattamento alle 24 e 48 ore, con risultati compatibili con quanto osservato per la crescita cellulare. L’azione degli siRNA è stata inoltre valutata sulle linee SW-480 e SW-620, tale da ottimizzare la concentrazione efficace di siRNA su tali cellule. Si è poi valutato se l’inibizione dell’oncogene MYCN con gli siRNA, oltre a influenzare la crescita cellulare, abbia avuto effetto su altri aspetti cellulari e a tal fine si è analizzata, dopo il trattamento, la risposta trascrizionale di alcuni geni coinvolti nel pathway apoptotico. Da letteratura è stato visto che uno stress chimico indotto da farmaci provoca una transattivazione di alcuni dei geni come DR5, GADD45A e DDIT3, con successivo innesco del pathway apoptotico. I risultati evidenziano che alle 24 ore l’unico gene fra quelli analizzati che subisce una modifica importante in termini trascrizionali è il gene DR5 con un aumento del segnale alle 24 ore e un ulteriore incremento ale 48 ore. Il recettore DR5 (Death receptor 5) è uno dei recettori di TRAIL (tumor necrosis factor-related inducing apoptosis ligand); quest’ultimo è un membro della famiglia di citochine TNF e promuove l’apoptosi in modo mitocondrio dipendente o indipendente. Per gli altri geni si è osservata una variazione in termini di espressione solo alle 48 ore. Lo stesso TRAIL subisce un aumento del trascritto a seguito del trattamento, dopo 48 ore; analogamente, GADD45A presenta valori di Conclusioni LogRatio positivi: i geni GADD45 (Growth Arrest and DNA Damage) sono GADD45B, GADD45A, GADD45G, sensori di stress che modulano la risposta a stress di varia natura e il loro livello trascrizionale tende ad aumentare a seguito di condizioni stressorie o dopo il trattamento con agenti danneggianti il DNA. DDIT3 è il principale protagonista indotto da stress a livello del reticolo endoplasmatico e anche in questo caso si osserva un’importante aumento di espressione alle 48 ore. TNF e TNFAIP3 hanno risposte opposte al trattamento: il primo mostra un aumento, mentre il secondo una riduzione del trascritto. TNF è una citochina coinvolta in diversi processi cellulari fra i quali l’induzione dell’apoptosi a seguito del legame al recettore TNF-R1, con successiva attivazione a cascata delle caspasi. TNFAIP3 (TNF alpha-induced protein 3) codifica per una zinc-finger protein responsabile dell’inibizione trascrizionale del gene NF-kB e dell’apoptosi TNF mediata. La survivina, infine, membro della famiglia di geni inibitori dell’apoptosi, risponde al trattamento con un calo dell’mRNA di varie unità. Riassumendo, i geni in analisi, in diverso modo coinvolti nel processo apoptotico, mostrano un’importante risposta a seguito del trattamento, evidenziando una risensibilizzazione delle cellule all’apoptosi. Sono inoltre stati presi in analisi geni relativi al pathway WNT. La βcatenina e la ciclina D mostrano una marcata riduzione a livello trascrizionale a seguito del trattamento, mentre DKK3 risponde con un incremento. Tali osservazioni sono compatibili e supportano la possibilità di una connessione, nel CRC, fra MYCN e il pathway WNT analoga a quella riportata in letteratura per il neuroblastoma. La prospettiva futura è anzitutto quella di investigare l’effettiva motivazione del mancato effetto del PNA sulla linea COLO 205, ad esempio con l’utilizzo di un PNA-NLS rodaminato valutando il suo uptake da parte delle cellule mediante microscopio a fluorescenza. Conclusioni Data la risposta in termini trascrizionali al trattamento con gli siRNA ci si propone di andare a verificare l’efficacia anche a livello dell’oncoproteina. Il prossimo passo sarà inoltre quello di proseguire lo studio sulle linee tumorali che ancora non sono state valutate o sulle quali il lavoro è stato solo iniziato (SW-480 e SW-620) e cercare così di avere un quadro il più completo possibile. Sarà anche importante una caratterizzazione di MYCN nel CRC in funzione dell’avanzamento del tumore con uno studio critico del ruolo dell’oncogene e con una valutazione della sua inibizione in linee cellulari derivate da pazienti a differente stadio oncologico. Il ruolo di MYCN come oncogene nel CRC deve essere dunque ulteriormente esplorato, tuttavia i preliminari risultati ottenuti sono incoraggianti: l’efficacia inibitoria degli siRNA, con conseguente riduzione della proliferazione cellulare e variazione nell’espressione di geni coinvolti in diversi pathway cellulari, rappresentano buoni presupposti per il proseguimento degli studi, schiudendo gli orizzonti alla possibilità di sviluppo di un agente terapeutico basato sull’azione inibente dello siRNA anti-MYCN, orientato al trattamento di quella percentuale di casi che mostrano sovraespressione e amplificazione di tale oncogene. Bibliografia BIBLIOGRAFIA Ballinger, A.B. and C. Anggiansah (2007). Colorectal cancer. BMJ; Volume 335 Fodde, R. (2002) The APC gene in colorectal cancer. European Journal of Cancer 38; 867-871. Arnold, N.C., A.Goel et al. (2005) Molecular pathogenesis of Colorectal Cancer. American Cancer Society; volume 104; number 10 Lamprecht, S.A., M. 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Tomlinson(1996) Genetic pathways in colorectal cancer. Histopathology 28, 389-399. Ringraziamenti RINGRAZIAMENTI Eccoci qua alla fine di queste sudate pagine..eccoci qua alla fine di tutto questo percorso.... malinconia per quanto ormai rimane alle spalle....curiosità per quello che c’è dietro l’angolo.... l’impazienza di gettarsi in ciò che arriverà....malinconia perchè come succede in questi casi è piu forte il ricordo dalle sfumature rosa, quello positivo e dolce del passato che non il pensiero delle difficoltà e delle crisi attraverso le quali inevitabilemnte si è passati.... d’altro canto ci si inizia a chiedere cosa ci aspetti al di là di questo piccolo grande traguardo.... Arrivati a questo punto come poter fare a meno di chiamare in ballo tutte le persone importanti che ci sono state a fianco a me per una piu o meno grande parte di questo lungo percorso e quelle che ancora mi accompagnano, essenziali per me ognuna a suo modo. Anzitutto grazie alla mia famiglia, in particolar modo ai miei genitori e al mio fratellone. Grazie per tutto, grazie perchè in un modo o nell’altro sono sempre presenti nei momenti migliori pronti a condividere con me le gioie ma soprattutto nei momenti più duri pronti a farmi sentire il loro affetto e il loro essenziale e indispensabile supporto. Ringrazio il laboratorio che mi ha “ospitato” per un anno. Anzitutto ringrazio il Prof. Andrea Pession, direttore medico del “Laboratorio di Oncologia ed Ematologia Pediatrica del Policlinico Sant’Orsola – Malpighi” dove ho svolto il tirocinio durante quest’ultimo anno e dove ho imparato tante cose tecniche e non solo. Ringraziamenti Ringrazio il Dott. Roberto Tonelli per avermi seguito con serietà nel lavoro svolto. Ringrazio tutte le persone del laboratorio di Oncoematologia Pediatrica alle quali in un modo o nell’altro devo qualcosa di quello che ho imparato nel corso di questi mesi. Un grazie speciale a Consu, Ester, la Berganza ed Erika che sono riuscite con gran premura ad essermi vicino, ad essere vicino a noi tesisti e che non solo ci hanno supportato nella nostra formazione in laboratorio ma ci hanno offerto tutta la loro disponibilità e il loro affetto, hanno sempre cercato di alleggerire con una risata o con una parola consolatoria il peso di queste ultime settimane. Grazie anche a Valeria per tutte le indimenticabili pause caffè vissute insieme e per tanti tentativi (puntulamente falliti) di organizzzazione di incontri extralab. Ringrazio i miei compagni di avventura Marco, Elena e Antonio per lo scambio e il confronto costante su preoccupazioni dubbi e quant’altro, senza il quale sarebbe stata molto più dura soppportare la fatica soprattutto di quest’ultimo mese. In particolar modo ringrazio Elena per avermi permesso di riscoprirla e di apprendere di lei molte piu cose in questa manciata di mesi piuttosto che negli anni passati e malgrado incomprensioni incontrate lungo la via spero le nostre strade non si tornino a separare e di mantenere il legame con le speciale persona che si è rivelata. Ringrazio Fascio per il reciproco scambio di idee e preoccupazioni, per i pichhi di euforia e i momenti di immensa agitazione condivisi....ringrazio il mio amico perche spesso ha avuto la parola giusta al momento giusto, per avermi in più e più momenti davvero sopportato...grazie Fascio di tutto. Ringraziamenti Un particolare ringraziamento va al Prof. Giorgio Gallinella per la sua immensa umanità e disponibiità e per aver creduto in me ed essere stato capace di infondermi fiducia nelle mie possibiità anche nei momenti in cui ero io per prima a dubitarne. Ringrazio tutti gli amici che si sono susseguiti in momenti diversi per la loro immensa pazienza, per il loro affetto e per essermi stati a fianco in questi ultimi tempi o in qualche modo lungo il cammino. Ringrazio la mia Carmenuzza che dopo così tanti anni c’è ancora, sempre presente allo stesso modo, anche se i chilometri ci sono avversi....sempre e incondizionatamente. Ringrazio Marco, Simone, Saretta Petta, Federica e i piu lontani Alessia Alessandra e Alberto, compagni di tante serate, risate, bevute in compagnia, pomeriggi di studio insieme e di tutti gli altri bei momenti vissuti in questi ultimi anni. Ringrazio Vale, Fra e Sabrina per essermi state vicino in quest’ultimo periodo e avermi sopportato, per aver condiviso con me piacevoli serate e per aver sopportato le mie fasi diciamo di “latitanza”. Ringrazio inoltre persone che mi hanno dato tanto....grazie e Chiara e Anissa con i nostri incontri sporadici ma tanto piacevoli ...ringrazio Nicoletta compare di tanti bei momenti e parte importante di tanti miei bei ricordi di questi anni. Ringrazio Daniela.. così capita che due strade che sembrano imboccare direzioni diverse possano tornare a riavvicinarsi. Ringraziamenti Ringrazio fra gli altri (riportati solo ora ma nn perchè meno importanti) amici che ci sono sempre stati o ultimamente riscoperti ...Carmela, Luigi, Pio, Mariachiara, Roberto, Ilaria. Infine poche parole ma preziose per ringraziare una persona speciale lasciata per ultima perchè particolarmente importante per me...una pesrona che nella sua discrezione mi è stata e mi è immensamente vicina...che a modo suo mi ha supportato in questo periodo davvero più di quanto potessi credere aiutandomi a sentire tutto un pò più leggero, un pò più semplice. Un GRAZIE per esserci e forse ancora un piu grande SCUSA per aver messo a dure prova la tua pazienza....GRAZIE PER TUTTO!! Grazie a tutti!!!!!!! 26 marzo 2009
