SOMMARIO
1. INTRODUZIONE .................................................................................................................................................... - 2 2. COME SI È SCOPERTO FOXL2 ......................................................................................................................... - 3 3. ANALISI COMPARATIVA DEGLI ORTOLOGHI DI FOXL2 ............................................................................. - 3 4. LOCALIZZAZIONE ED ESPRESSIONE DI FOXL2 .......................................................................................... - 5 5. TOPI K.O. PER FOXL2.......................................................................................................................................... - 6 6. SPETTRO DELLE MUTAZIONI DI FOXL2 IN PAZIENTI CON BPES ........................................................... - 7 7. ESPANSIONE DEL TRATTO POLIALANINICO E AGGREGAZIONE ........................................................... - 8 7.1 COSA SUCCEDE A FOXL2? .............................................................................................................................. - 10 8. DELEZIONE DEL TRATTO POLI-ALA E AGGREGAZIONE......................................................................... - 14 9. STOP CODON PREMATURI IN FOXL2 E AGGREGAZIONE ...................................................................... - 14 9.1 STOP CODON PREMATURI E NMD ..................................................................................................................... - 14 9.2 TRANSLATION READ-THROUGH ......................................................................................................................... - 16 9.3 EXON SKIPPING.................................................................................................................................................. - 16 9.4 RI-INIZIO DELLA TRADUZIONE A VALLE DELLO STOP CODON PREMATURO ........................................................ - 17 9.5 COSA SUCCEDE A FOXL2?.............................................................................................................................. - 17 10. AGGREGAZIONE E PATOGENESI ................................................................................................................ - 18 11. RIPETIZIONI ED EVOLUZIONE ...................................................................................................................... - 20 11.1. ORIGINI MOLECOLARI DELLA RAPIDA E CONTINUA EVOLUZIONE MORFOLOGICA ........................................... - 20 11.2 VARIAZIONI NELLE RIPETIZIONI POSSONO PORTARE A DRASTICHE MODIFICAZIONI FENOTIPICHE ................. - 22 11.3 FATTORI TRASCRIZIONALI CONTENENTI RIPETIZIONI ....................................................................................... - 22 11.4 CONCLUSIONI ................................................................................................................................................... - 24 13. BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................................................... - 26 -
1. Introduzione
FOXL2 è un gene di 2.7 Kb localizzato sul cromosoma 3q23, costituito da un singolo
esone che codifica per una proteina di 376 aminoacidi, appartenente alla famiglia dei
fattori trascrizionali forkhead/winged helix. Questa famiglia si caratterizza dall’avere un
tipico dominio forkhead di legame al DNA formato da 100 aminoacidi specifici; molti
membri si sa essere coinvolti nell’embriogenesi dei vertebrati e alcuni sono implicati in
disordini dello sviluppo nell’uomo.
Oltre al dominio forkhead, la proteina FOXL2 contiene un tratto di poli-alanina il cui ruolo
non è ancora ben noto.
ATG
stop
Forkhead
polyAla
Questo gene è di particolare interesse poiché recentemente si è scoperto che mutazioni
dominanti sono responsabili della BPES (blefarofimosi-ptosi-epicanto inverso), una rara
sindrome genetica di cui esistono due tipi: il tipo I caratterizzata da malformazioni
craniofacciali, difetti agli occhi e insufficienza ovarica precoce (POF: premature ovarian
failure) e il tipo II caratterizzata da isolate malformazioni craniofacciali. FOXL2 è il primo
gene autosomico umano le cui mutazioni dominanti sono coinvolte nella POF (Cocquet et
al., 2002).
Fig 1 fenotipo classico della sindrome BPES di tipo I; i difetti oculari sono presenti sia nella prima
che nella seconda generazione.
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2. Come si è scoperto FOXL2
Si è arrivati alla scoperta del gene FOXL2 attraverso studi di linkage in famiglie con BPES
di tipo II, i quali hanno portato all’identificazione di una regione localizzata sul cromosoma
3q22-q23; studi successivi sulle famiglie con BPES di tipo I hanno evidenziato come anche
in questo caso il locus responsabile fosse sul cromosoma 3q22-q23, indicando la
possibilità che lo stesso gene mutato sia responsabile di entrambe i fenotipi. Una volta
identificata la regione si è eseguito un clonaggio posizionale, sfruttando l’esistenza di
pazienti con lo stesso fenotipo e portatori di una traslocazione bilanciata t(3:7) e si è
proceduti con la caratterizzazione del gene identificato: FOXL2 (Crisponi et al., 2001).
Fig 2 mappa fisica della regione coinvolta nella BPES. Rappresentazione schematica della
posizione di FOXL2 e del gene a valle C3orf5 nella regione contenente il punto di rottura dei
pazienti con la traslocazione bilanciata.
3. Analisi comparativa degli ortologhi di FOXL2
Per studiare l’evoluzione della regione codificante di FOXL2, la sequenza nucleotidica e
aminoacidica di FOXL2 è stata comparata in uomo, capra, topo e fugu (pesce palla)
(Cocquet et al., 2002). È stato utilizzato il metodo di Li, il quale consiste nell’effettuare una
stima del numero di sostituzioni sinonime per sito sinonimo (Ks) e del numero di
sostituzioni non sinonime per sito non sinonimo (Ka) per poi farne il rapporto Ka/Ks: questo
è un ottimo indicatore della presenza di pressione selettiva a livello della proteina. Ka/Ks
<1 è indice di una forte selezione dominante purificatrice, mentre Ka/Ks>1 indica una
selezione positiva diversificatrice. Due sequenze per volta sono state comparate codone
per codone e sono state contate il numero di transizioni e transversioni per ognuna delle
tre categorie di siti. Successivamente è stato applicato il metodo a due parametri di kimura
come correzione per i multiple hits e si sono calcolate le sostituzioni sinonime e non
sinonime.
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Box1: il metodo a due parametri di kimura
queste correzioni servono per correggere l’andamento della curva che si ottiene mettendo in
grafico la distanza genica con la distanza tra due sequenze; si ottiene infatti una curva a
saturazione che va divisa in tre parti: nella prima è possibile effettuare la ricostruzione della
filogenesi, nella seconda anche, ma a patto di usare delle correzioni, mentre nella parte del
plateau è impossibile a causa delle retromutazioni che diventano sempre più probabili. Queste
correzioni si basano sulla probabilità di osservare una data sostituzione tenendo conto anche di
tutte le altre possibilità che possono essere accadute; se osservo dunque una sostituzione A>T
questa potrà essere frutto di un singolo cambiamento o di due mutazioni distinte A>C>T. Ad
ognuna di queste possibilità viene affibiata una probabilità diversa per correggere l’errore.
La sequenza aminoacidica si è rivelata molto simile tra i mammiferi (circa 96%) e questo è
stato confermato dal rapporto Ka/Ks molto basso ottenuto per l’intero ORF, suggerendo
che FOXL2 è sotto una selezione purificatrice.
Fig 3 analisi comparativa delle sequenze degli ortologhi di FOXL2. nella tabella sono riportati i
rapporti Ka/Ks. Gli asterischi rappresentano i siti maggiormente conservati. Nel fugu il tratto polyala è assente mentre negli altri mammiferila sua lunghezza è molto conservata, indicando che
anch’essa è sotto pressione selettiva.
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4. Localizzazione ed espressione di FOXL2
Il pattern di espressione di FOXL2 è stato studiato sia a livello di mRNA che di proteina in
diverse specie. In uomo, topo e capra FOXL2 è stato trovato solo nello sviluppo delle
palpebre e nell’ovario fetale e adulto mentre non è stato trovato a livello dei testicoli in
nessuno stadio. La sua localizzazione proteica è nucleare, il che è in linea con il suo
putativo ruolo di fattore trascrizionale (Crisponi et al., 2001; Cocquet et al., 2002).
Fig 4 immunoistochimica effettuata con anticorpi contro il C-terminale di FOXL2 su una sezione di
palpebra umana durante il suo sviluppo. FOXL2 è espresso nel mesenchima primordiale
circostante il bulbo oculare suggerendo un ruolo nello sviluppo dei muscoli extra-oculari,
consistente con il fenotipo della BPES (Oley and Baraitser, 1988).
È stato dimostrato che FOXL2 è espressa nello sviluppo delle palpebre nell’uomo: essa è
localizzata nella regione del mesenchima primordiale coinvolto nello sviluppo delle
palpebre (Cocquet et al., 2002). Immagini di risonanza magnetica hanno evidenziato in
pazienti affetti da BPES l’assenza o l’ipotrofia del muscolo levatore superiore della
palpebra (Dollfus et al., 2003). Gli autori suggeriscono che FOXL2 possa essere coinvolto
nello sviluppo di questo muscolo.
L’espressione ovarica di FOXL2 nei mammiferi comincia presto nello sviluppo, prima
dell’inizio della follicologenesi e persiste fino all’età adulta. L’espressione è ristretta alle
cellule somatiche: le cellule follicolari hanno una forte espressione, un po’ meno le cellule
stromali mentre nessuna espressione è presente nelle cellule germinali (Cocquet et al.,
2002). In studi recenti si è visto come l’mRNA di FOXL2 sia presente sia nelle cellule della
granulosa che in alcuni oociti nell’ovario del topo fetale e adulto (Loffler et al., 2003). Bassi
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livelli di mRNA di FOXL2 sono stati trovati nei testicoli di capra e topo ma non è stata
trovata nessuna traccia della proteina (Pailhoux et al., 2001; Cocquet et al., 2002); questo
può essere causa o di livelli troppo bassi per essere rilevati o frutto di modificazioni posttrascrizionali o frutto di regolazione post-traduzionale.
È interessante notare che il trascritto murino di FOXL2 è anche espresso a livello della
pituitaria e sembra essere coinvolto nella sua organogenesi (Treier et al., 1998). Molte
proteine forkhead sono responsabili del differenziamento nello sviluppo per poi essere
riciclati per il controllo del metabolismo nell’adulto.
L’espressione somatica ovarica di FOXL2 nei mammiferi comincia presto nello sviluppo e
persiste fino all’età adulta, suggerendo un duplice ruolo: per prima cosa potrebbe
governare il differenziamento nelle cellule somatiche ovariche, e più avanti potrebbe
essere coinvolto nel mantenimento e nella funzione adulta dell’ovario.
5. Topi K.O. per FOXL2
E’ stato eseguito un doppio knock out per FOXL2 e un knock in di lacZ nello stesso locus
per poter vedere i territori di espressione del gene (Smith et al.,2004). Successivamente si
sono eseguite analisi istochimiche allo stadio di 2, 8 e 16 settimane dalla nascita.
Il fenotipo ovario che emerge in topo in
seguito a knock out per FOXL2 rispetto
al wild type è una totale assenza di
proliferazione
delle
cellule
della
granulosa, le quali erano quelle che
mostravano una più forte espressione
della
proteina;
si
osserva
inoltre
un’apoptosi massiva estesa a tutto
l’ovario.
Fig 5 immagini istologiche rappresentative degli ovari mutanti omozigoti wild type e FOXL2
2, 8 e 16 settimane dalla nascita.
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lacZ
a
6. Spettro delle mutazioni di FOXL2 in pazienti con BPES
Sono state analizzate 53 mutazioni di FOXL2 le quali sono poi state suddivise in classi in
base alla tipologia (De Baere et al., 2003).
Fig 6 spettro delle mutazioni diFOXL2. Il gruppo A-D rappresenta le proteine tronche; A: senza
forkhead domain, B:con dominio parziale, C:con dominio ma senza il tratto poli-ala, D: con dominio
completo e tratto poli-ala. Il gruppo E rappresenta i frameshift, il gruppo F mutazioni in frame, il
gruppo G mutazioni missense. I due hotspots mutazionali sono riquadrati e a fianco sono mostrate
le percentuali: da notare come il 30% sono dovute ad espansione del tratto poli-ala.
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Il 47% (25/53) di tutte le mutazioni di FOXL2 portano a frameshift, il 34% (18/53) sono
mutazioni in frame, di cui la maggior parte dovuta a espansione del tratto poli-ala (16/53). Il
13% sono nonsense e il 6% missense, di cui una parte localizzati nel dominio forkhead.
Inoltre, due microdelezioni contenenti FOXL2 e altri geni sono state riscotrate in pazienti
con BPES, oltre alla traslocazione bilanciata già menzionata. Le famiglie esaminate e
prese in considerazione per questi studi sono estremamente eterogenee a livello di
fenotipo e trasmissione della patologia; ad esempio, riporterò nel dettaglio le mutazioni e i
relativi fenotipi delle prime due classi.
La prima serie di mutazioni appartengono al gruppo D. Di particolare interesse è l’unica e
nuova mutazione 1059C→G trovata in una famiglia in cui la madre, affetta da BPES di tipo
II, trasmette la malattia alla figlia, affetta da BPES di tipo I. questo è il primocaso in cui ci
sono entrambe i tipi di BPES nella stessa famiglia ma causati dalla stessa mutazione
(variabilità fenotipica intrafamiliare).
La seconda serie di mutazioni appartiene al gruppo E. è interessante notare come
l’inserzione 1041-1042insC, che prima veniva riscontrata in una famiglia con BPES di tipo
II, una famiglia con tipo sconosciuto e un paziente con sintomi variabili, sia stata trovata in
una famiglia con BPES di tipo I. Questa è la prima mutazione che porta a entrambe le
forme in famiglie diverse (variabilità fenotipica interfamiliare).
Quanto emerge anche da studi clinici è dunque una sovrapposizione di fenotipo tra le due
forme di BPES e una grande variabilità (De Baere et al., 2001).
7. Espansione del tratto polialaninico e aggregazione
È stata confermata da questi studi l’esistenza di un hotspot mutazionale nella regione
dell’espansione poli-ala, responsabile del 30% delle mutazioni nell’ORF, la quale
porterebbe principalmente al manifestarsi della BPES di tipo II.
Esistono sei altri geni con un tratto poli-ala, la cui espansione oltre una soglia critica
avrebbe come conseguenza lo sviluppo di diverse sindromi.
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Fig 7 Esempi di geni contenenti tratti poli-ala; sono rappresentati inoltre il numero di espansioni e
le relative patologie.
La funzione del tratto poli alaninico non è ancora chiara, tuttavia esistono evidenze di
come il numero di residui di alanina siano strettamente conservati in uomo,capra, topo e
ratto, suggerendo l’esistenza di costrizioni funzionali o strutturali (Cocquet et al., 2002). In
alcuni fattori trascrizionali il tratto poli-ala, che forma α-elica, ha un ruolo repressorio dei
geni target (Han and Manley, 1993). Studi predittivi della struttura secondaria di FOXL2
hanno dimostrato che è presente anche in questo caso una struttura ad α-elica in
corrispondenza del tratto poli-ala. Tuttavia prima di giungere a conclusioni occorrono altri
studi.
Il
fenomeno
dell’espansione
poli-ala
non
è
l’unico:
esistono
infatti
patologie
neurodegenerative associate ad espansioni da triplette in cui la tripletta in questione può
essere diversa. Un esempio è rappresentato dalla Corea di Hungtinton, neuropatologia ad
insorgenza tardiva causata da un espansione di poli glutammina nella proteina hungtintina,
la quale forma aggregati che interferiscono con le normali funzioni celebrali a livello di
spine e dendriti.
Un altro esempio è la distrofia miotonica in cui l’espansione CTG provoca aggregazione
internucleare della proteina coinvolta e accumulo di una proteina CUG-binding protein
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responsabile di alcuni splicing alternativi e relativa alterazione di proteine importanti che
sono responsabile del fenotipo multisistemico.
In molte di queste patologie si assiste al fenomeno dell’anticipazione, ovvero all’aggravarsi
dei sintomi predittivi della patologia nel corso delle generazioni, dovuta all’espansione che
aumenta in modo esponenziale una volta superata una certa soglia di instabilità.
L’espansione è dovuta a fenomeni di slippage replication della polimerasi o ad
appaiamento incorretto.
Polymerase slippage, illegitimate
recombination
Anticipazione
Espansione
Fig 8 Illustrazione schematica del fenomeno dell’anticipazione e della relativa espansione di
triplette.
7.1 Cosa succede a FOXL2?
Le espansioni da triplette sono molto frequenti tra fattori trascrizionali e altre proteine
nucleari, tuttavia la loro funzione resta ancora dubbia. Recenti studi evidenziano come
l’espansione oltre una certa soglia porti a misfolding, aggregazione e degradazione della
proteina, suggerendo che patologie associate all’espansione da triplette possano rientrare
nella classe di disordini causati da proteine misfolded. Il corretto folding è una tappa
cruciale per una corretta attività biologica della proteina ed è sottoposta ad un rigido
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controllo molecolare. Proteine che non foldano correttamente vengono riconosciute e
rapidamente degradate.
Fig 9 chaperoni molecolari possono intervenire nel folding e nella degradazione di proteine
misfolded. Attraverso l’associazione con i gruppi idrofobici esposti, i chaperoni Hsp70/40
promuovono il folding delle proteine neosintetizzate; alternativamente, possono facilitare il
riconoscimento di proteine misfolded e indirizzarle verso la loro ubiquitinizzazione attraverso CHIP
(E3), e successivamente alla degradazione attraverso il proteasoma 26S.
In alcuni casi, tuttavia, le proteine misfolded formano aggregati e/o causano un’attivazione
eccessiva
della
macchina
degradativa,
portando
a
una
disfunzione
cellulare
e,conseguentemente, alla patologia. È stato dimostrato da Caburet (Caburet et al., 2004)
che l’espansione poli-ala nel gene FOXL2 induce la formazione di aggregati intranucleari
e a mislocalizzazione della proteina dovuta all’estensiva aggregazione citoplasmatica.
Hanno transfettato cellule COS-7 con un costrutto contenente un vettore di espressione
per il cDNA di FOXL2 contenente 14 ripetizioni ala (Wt) e uno mutato con 24 ripetizioni
entrambi fusi a GFP e hanno osservato come in entrambe i casi vi fosse localizzazione
intranucleare.
M1
FOXL2 ORF
GFP
GFP
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La fluorescenza nucleare osservata nel wt non è omogenea ma non si può parlare di
aggregati poiché sono state trovate piccoli aggregati puntiformi solo nel 6.9% delle cellule
wt
FOXL2-Ala14
GFP
transfection of COS-7
cells
DAPI
GFP
merge
Nuclear Fluorescence, non homogeneous but not aggregated
Fig 10 aggragazione di FOXL2 con poli-ala espanso. Colonna a sinistra: colorazione del nucleo,
DAPI; centro: proteina di fusione con GFP/FITC; destra: merge.
Nel mutante invece si osservano aggregati nucleari nel 30% dei casi.
FOXL2-Ala24
GFP
dapi
gfp
GFP
Merge
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Il dato più interessante è che, mentre nel wt si è osservata una modesta presenza di
fluorescenza a livello citoplasmatico (< 3%), nel mutato più dell’80% della fluorescenza era
citoplasmatica e sottoforma di aggregati. L’aggregazione di Ala24-GFP, che si pensa inizi
nel citoplasma, è così forte che può venir impedito il trasporto intranucleare, lasciando i
nuclei pressochè privi di fluorescenza.
È stata saggiata la possibilità che vi fosse interferenza della GFP nell’aggregazione di
FOXL2 espanso, perciò sono state eseguite altre trasfezioni simili utilizzando al posto della
proteina di fusione una localizzazione tramite immuno-fluorescenza con anticorpi diretti
contro la proteina. I risultati hanno escluso la possibile interferenza del GFP e hanno
concluso che l’effetto primario dell’espansione del tratto poli-ala di FOXL2 è l’aggregazione
nucleare e la mislocalizzazione di questo fattore trascrizionale a causa degli aggregati
citoplasmatici.
È stato inoltre dimostrato che l’aggregazione citoplasmatica in seguito ad espansione poliala è una caratteristica comune ad altri fattori trascrizionali (Albrecht et al., 2004).
Fig 11 espressione delle proteine Hoxd13, Hoxa13, Runx2 e Sox3 wt e mutate in cellule Cos-1. Le
cellule sono state trasfettate transientemente, le proteine colorate con opportuni anticorpi (verde,
pannello superiore), mentre i nuclei con colorazione DAPI (blu). Il pannello inferiore mostra il
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merge. Le proteine wt localizzanonel nucleo, mentre quelle mutate formano aggregati nel
citoplasma.
Le ripetizioni di alanina brevi (+7) sono prevalentemente localizzate nel nucleo e ben
tollerate dalla cellula, mentre le espansioni più lunghe (> +10) sono tossiche e
principalmente citoplasmatiche. Questo è in accordo con i dati clinici che dimostrano una
correlazione tra lunghezza dell’espansione e gravità del fenotipo e della penetranza.
8. Delezione del tratto poli-ala e aggregazione
È stato dimostrato come, non solo l’espansione del tratto poli-alaninico porti ad
aggregazione, ma anche la delezione dello stesso (Moumnè et al., 2005). Anche questa
volta sono stati fatti studi di trasfezione in cellule cos-7 di mammifero e si è visto che nel
20% dei casi si osservava aggregazione intranucleare, contro il 4% delle trasfezioni con il
gene wt con 14 alanine.
9. Stop codon prematuri in FOXL2 e aggregazione
Un tipo di mutazioni possibili a livello del DNA sono le mutazioni non senso, le quali sono
responsabile della presenza di uno stop codon prematuro nella ORF; a questo proposito
l’organismo può intervenire in diversi modi per cercare di ovviare al problema:
9.1 Stop codon prematuri e NMD
L’NMD (Non-sense Mediated mRNA Decay) è un fenomeno di degradazione di mRNA
contenenti stop codon prematuri; il meccanismo d’azione è rivolto a mRNA spliced ma non
è ancora chiaro nei suoi dettagli poiché, nonostante sia un processo bloccato da inibitori
della traduzione (processo che si ritiene essere citoplasmatico!), i livelli di mRNA sono già
molto bassi nel nucleo. Inoltre, poiché il processo si verifichi, la mutazione PTC (premature
terminator codon) deve essere a più di 50 nucleotidi dall’ultima exon junction e richiede un
introne a valle; questo probabilmente per essere sicuri di non confondersi con lo stop
fisiologico. Ad oggi si ritiene che l’NMD, descritto solo per geni con molti esoni, si verifichi
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a livello della membrana perinucleare, dove avverrebbe una prima scansione dell’mRNA
prima che inizi la traduzione vera e propria.
L’NMD ha un ruolo importante nel prevenire la formazione di proteine tronche anomali
causate dallo stop codon prematuro, le quali potrebbero portare a casi di dominanze
negative; davanti a questa prospettiva, la soluzione migliore per l’organismo è, spesso,
quella di degradare la proteina per evitare potenziali anomalie. Un esempio classico è
quello del locus β-globinico e delle talassemie. Le β talassemie sono patologie causate da
un difetto quantitativo di catene β (esistono anche le α talassemie e riguardano il locus α
globinico) dovuto a mutazioni di diverso genere e sono per la maggior parte recessive. Se
la mutazione è di tipo PTC, a seconda che essa avvenga sull’ultimo esone o prima, c’è la
possibilità di avere forme dominanti di talassemia: se la mutazione è nell’ultimo esone non
porta a NMD e di conseguenza avrò la formazione di un dominante negativo, mentre se
essa avviene prima dell’ultimo esone, l’NMD mi garantisce la degradazione e di
conseguenza la forma recessiva.
Nonsens mutations in the -globin gene
PremRNA
mRNA
protein
mRNA degradation by Nonsens Mediated
Decay (NMD)
Toxic truncated protein = dominant
negative effect
Dominant -thalassemia
No toxic protein = null allele
Recessive -thalassemia
Fig 12 esempio illustrato del fenomeno dell’NMD e della diversa conseguenza patologica nel caso
esso avvenga oppure no.
L’NMD tuttavia in questo caso è stato scartato come possibile ulteriore responsabile
dell’aggragazione dal momento che FOXL2 ha un solo esone.
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9.2 Translation read-through
Anche questo è un meccanismo che può intervenire quando si hanno mutazioni PTC e
consiste nel riconoscere uno stop codon come sense codon permettendo così alla
traduzione di non interrompersi.
AUG
mRNA
Full protein
Fig 13 esempio illustrato del fenomeno della translation read-through
È un processo che avviene principalmente nei virus ma che può essere riprodotto, seppur
con bassa efficienza (< 10%), nell’uomo grazie ad alcuni antibiotici come ad esempio la
gentamicina. L’importanza di questo fenomeno si sta rivelando utile per curare patologie
come la fibrosi cistica o la distrofia di duchanne da stop codon; in questi casi, trattando con
antibiotico, interferisco con le funzioni del ribosoma il quale non riconosce lo stopcodon
come tale, ma come sens codon. Ovviamente verrà inserita una mutazione, ma in questo
modo evito la degradazione dell’mRNA e permetto la produzione di un 3% circa di proteina
che, in questi casi gravi, è comunque già sufficiente.
9.3 Exon skipping
Un altro metodo adottato dall’organismo per aggirare la presenza di uno stop è il NAS
(Non-sense Alterated Spliced). Questo meccanismo sfrutta la possibilità di effettuare
splicing alternativi usando siti criptici o altri siti di splicing diversi dal consensus, con lo
scopo di eliminare l’esone contenente lo stop codon per exon skipping.
Il problema è che spesso l’uso di siti criptici ha come conseguenza la ritenzione di pezzi di
introni o l’eliminazione di pezzi di esoni con la conseguente possibilità di frameshift. questo
fenomeno sicuramente avviene nel nucleo poiché riguarda lo splicing ed è possibile
abolirlo cambiando il frame di lettura. Anche in questo caso la possibilità di avere NAS è
esclusa vista la natura del gene in questione.
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AUG
Pre-mRNA
mRNA
Internally deleted
protein
Fig 14 esempio illustrato del fenomeno dell’exon skippin
9.4 Ri-inizio della traduzione a valle dello stop codon prematuro
Con questo meccanismo si ha un primo inizio di traduzione fino ad incontrare lo stop
codon prematuro; qui la traduzione si interrompe per poi riprendere a valle dello stop
prematuro fino allo stop fisiologico. In questo modo ottengo una proteina che ha solo l’Nterminale e una proteina tronca priva dell’N-terminale. Quest’ultima potrebbe essere
funzionale nella migliore delle ipotesi oppure un’antagonista.
AUG
AUG
mRNA
Peptide N-term
+ protein lacking the
Nterm
Fig 15 esempio illustrato del ri-inizio della traduzione a valle dello stop prematuro
9.5 Cosa succede a FOXL2?
Per un gene come FOXL2, costituito da un solo esone, la presenza di stop codon può
portare a tre conseguenze possibili: 1) formazione di una proteina tronca mancante del Cterminale, 2) read-through, 3) ri-inizio della traduzione a valle dello stop. Il fenomeno del
read-throug porta alla produzione di bassi livelli di proteina full-lenght mentre il
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meccanismo del ri-inizio della traduzione forma un oligopeptide corrispondente all’Nterminale e una proteina mancante dell’N-terminale.
È stata dunque esaminata la possibilità che entrambe i fenomeni potessero intervenire in
caso di mutazioni nonsense in FOXL2 (Moumnè et al., 2005) attraverso esperimenti di
trasfezioni ed è stato dimostrato che viene prodotta una proteina troncata nella parte Nterminale a causa del fenomeno della ri-iniziazione della traduzione.
Sorprendentemente, la proteina troncata formava aggregati nucleari e parzialmente
localizzava nel citosol; inoltre è stato dimostrato che la proteina tronca era in grado di
ritenere una frazione della proteina wt sotto forma di aggregati intranucleari.
Per dimostrare quanto detto, cellule di mammifero cos-7 sono state trasfettate con un
vettore di espressione che portava FOXL2, con uno stop codon prematuro, fusa a GFP al
C-terminale. Osservazioni dirette attraverso microscopio a fluorescenza mostrano che la
proteina di fusione viene prodotta e questo dimostra che la regione a valle dello stop può
venire tradotta. Inoltre, la fluorescenza osservata non era diffusa come previsto, ma
presentava aggregati intranucleari in tutte le cellule trasfettate e decorazioni caratteristiche
a livello citoplasmatico. Il comportamento anomalo di questa proteina ha fatto sospettare
che probabilmente non fosse stata tradotta l’intera sequenza della proteina di fusione ma,
a causa dello stop prematuro, fosse stata tradotta una proteina tronca all’N-terminale.
Questa ipotesi è stata confermata con analisi di western blot; studi sulla sequenza di
FOXL2 hanno evidenziato come vi fossero 8 AUG in frame all’N-terminale perciò è stato
semplice calcolare a priori la putativa lunghezza della proteina tronca e confermarne il
peso attraverso western blot.
Per essere sicuri che la ri-iniziazione della traduzione avvenisse proprio all’AUG65, si è
trasfettato un costrutto con la delezione dei primi 64 codoni di FOXL2 e, come atteso, si
sono osservati aggregati intranucleari e decorazioni citoplasmatiche.
10. Aggregazione e patogenesi
I target fino ad ora conosciuti del fattore trascizionale FOXL2 sono:
1. recettore dell’ormone rilasciante le gonadotropine (Elsworth et al., 2003)
2. STAR – steroid acute regulatory protein (Pisarska et al., 2004)
3. aromatasi (Pannetier et al., 2006).
Per indagare sugli altri potenziali target di FOXL2, sono stati usati DNA chips e PCR
quantitativa per comparare i trascrittomi delle cellule granulosa-like overesprimenti o no
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FOXL2 (Batista et al., 2007). Questa analisi ha rivelato che mediatori infiammatori,
regolatori apoptotici e trascrizionali, geni coinvolti nel metabolismo del colesterolo e geni
codificanti enzimi e fattori trascrizionali coinvolti nella detossificazione dalle specie reattive
dell’ossigeno erano up-regolati. D’altra parte, FOXL2 down-regolava la trascrizione di
diversi geni coinvolti nella proteolisi, nella trasduzione del segnale e nella regolazione
della trascrizione.
È stata successivamente condotta un analisi bioinformatica per discriminare tra i potenziali
promotori target attivati o repressi da FOXL2.
Chemokines
(inflamatory
processes)
Signal
transduction
Keratin-associated
proteins
FOXL
2
Pregnancy-specific
glycoproteins
Peptidases and
metallopeptidases
Transcription factors
Transcription
factors
Fig 16 classificazione funzionale dei potenziali target di FOXL2
Inoltre, è emerso che i promotori di geni fortemente attivati da FOXL2 sono ricchi di siti di
binding per il forkhead domain, suggerendo una possibile interazione diretta di FOXL2. A
questo punto è aperta la speculazione sui possibili ruoli dei geni regolati da FOXL2 per
capire in che modo questi potrebbero essere causa di patologie in caso di alterata
regolazione. È possibile che geni responsabili di processi infiammatori possano essere
legati all’ovulazione, così come geni deputati al metabolismo dei ROS e alla regolazione
dell’apoptosi intervengano nell’invecchiamento dell’ovaio.
Ulteriori studi in questa direzione sono volti a far luce sui reali target in vivo di FOXL2;
saranno necessari esperimenti di Chromatin immuno precipitation (ChIP) e ChIP on chip
- 19 -
sull’intero genoma. Inoltre sarebbe interessante capire cosa succede all’espressione dei
geni target di FOXL2 in caso di mutazioni.
11. Ripetizioni ed evoluzione
11.1. Origini molecolari della rapida e continua evoluzione morfologica
La rapida generazione di nuove specie osservate nel mondo vivente è il risultato di un
incredibile variabilità genetica, specialmente di quei geni coinvolti nello sviluppo
“morfologico”. È stato proposto, in accordo con la comunità scientifica, che mutazioni in cis
di elementi regolatori di geni dello sviluppo è alla base della diversità e della complessità
osservata; l’esempio più classico è rappresentata dai geni della famiglia Hox, i quali
definiscono principalmente il body plan durante lo sviluppo. Tuttavia, l’efficienza di questi
rari eventi di mutazione potrebbe essere questionabile se rapportato alla velocità con cui si
osservano variazioni morfologiche.
Di particolare interesse è il caso delle specie domestiche, dove la selezione artificiale ha
portato ad un incredibile variabilità in poco tempo. Analisi di DNA mitocondriale
suggeriscono come il cane abbia una divergenza rispetto al lupo di circa 135.000 ya (Vila
et al., 1997); da qui sarebbe iniziato un processo a più riprese di separazione e incroci
selettivi tra cane e lupo, probabilmente imposto dal cambiamento di stile di vita dell’uomo,
il quale passò da nomade e sciacallo, ad una vita sedentaria, la quale è culminata con la
scoperta dell’agricoltura. Questa selezione artificiale ha generato più di 200 specie diverse
di cane in un tempo molto breve sulla scala evolutiva.
In un paper recente, Fondon e Garner (Fondon and Garner, 2004) hanno dimostrato
l’esistenza di un metodo genetico alternativo che potrebbe partecipare ad incrementare la
diversità nell’evoluzione: hanno mostrato come la variazione della lunghezza dei tandem
repeats nelle sequenze codificanti di geni dello sviluppo siano associate a cambiamenti
morfologici nelle diverse specie di cane. Nelle sequenze codificanti, la variabilità nella
lunghezza dei tandem repeats produce diversi polimorfismi, i quali sono conseguenza di
una contrazione o espansione di ripetizioni aminoacidiche (Wren et al., 2000). Questo
sarebbe terreno fertile per la selezione naturale, la quale avrebbe molto materiale diverso
su cui agire.
È interessante notare, inoltre, che studi genomici hanno mostrato come proteine
contenenti repeats, specialmente Alanina, Prolina, Glicina e Serina, siano frequentemente
- 20 -
coinvolte nello sviluppo (Nakachi et al., 1997; Karlin et al., 2002). Inoltre, le proteine Hox
costituiscono la famiglia più ricca in poly-alanine repeats del proteoma umano (Lavoie et
al., 2003).
Fondon e Garner hanno ipotizzato che la grossa variabilità nella morfologia dei cani possa
essere il risultato di un’alterazione relativamente recente della lunghezza delle tandem
repeats nei geni dello sviluppo. Per cercare di dimostrarlo, gli autori hanno esaminato le
sequenze di tandem repeats nelle regioni codificanti di alcuni geni dello sviluppo in diverse
specie di cani, e comparato i polimorfismi in queste sequenze con la variabilità morfologica
interspecifica. In assenza di mutazioni “purificatrici” come espansione e contrazione, una
tandem repeat pura andrebbe incontro a “degradazione” per l’accumulo di mutazioni
puntiformi, mentre l’espansione e la contrazione di repeats hanno l’effetto di rimuovere le
imperfezioni dalla sequenza ripetuta.
Evidenze di una recente alterazione nel
numero di ripetizioni in un locus possono
essere
osservate
comparando
la
sequenza di loci ortologhi ripetitivi. Per
fare ciò hanno sequenziato 36 regioni
codificanti contenenti repeats di cani
domestici, ortologhe di 17 geni umani
coinvolti nello sviluppo craniofacciale;
successivamente hanno comparato la
purezza della sequenza con l’omologa
ripetizione nell’uomo. La loro ipotesi è
che, se l’intensa selezione per variazioni
morfologiche nei cani domestici è dovuta
ad
una
recente
variazione
nella
lunghezza delle ripetizioni, si osservi nei
cani
una
maggiore
purezza
nelle
ripetizioni rispetto all’uomo.
Fig 17 la purezza è stata calcolata dividendo il numero di basi che devia dalla canonica unità di
ripetizione per la lunghezza totale della ripetizione e sottraendo da uno.
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Il risultato è che, per 29 dei 36 loci comparati, la sequenza delle ripetizioni nei cani ha
minor interruzioni rispetto all’uomo ed è quindi più pura.
Ora, se parte della capacità di rapida diversificazione morfologica nei cani domestici è
mediata dalla diversa lunghezze delle tandem repeats in alcuni geni, allora si dovrebbe
osservare una variazione interspecifica della lunghezza. Quello che hanno scoperto
Fondon e Garner attraverso altri studi di comparazione è che, effettivamente, la maggior
parte delle variazioni alleliche osservate erano dovute alla diversa lunghezza delle
ripetizioni.
Se un gene può portare diverse ripetizioni, sarebbe interessante vedere se particolari
combinazioni di diversa lunghezza siano in linkage disequilibrium nell’evoluzione come
aplotipi stabili; questi aplotipi potrebbero riflettere diversità fenotipiche selezionabili. La
selezione artificiale e il processo della domesticazione potrebbe aver contribuito a fissare
gli aplotipi responsabili di caratteristiche fenotipiche più consone all’esigenza dell’uomo.
11.2 Variazioni nelle ripetizioni possono portare a drastiche modificazioni fenotipiche
La variazione della lunghezza delle sequenze ripetute nel gene Runx-2, gene chiave nella
regolazione del differenziamento degli osteoblasti, è stato investigato da Fondon e Garner,
i quali hanno trovato un associazione con cambiamenti morfologici quantitativi. Gli autori
hanno costruito un modello 3-D al computer di crani di 20 cani, campionando una grossa
variabilità morfologica. Essi hanno trovato una correlazione tra la morfologia craniofacciale
e la lunghezza delle due ripetizioni omopolimeriche in Runx-2 (poliAla e poliGln); più
precisamente, la correlazione positiva è stata migliorata quando hanno calcolato il
rapporto poliGln/poliAla. Questa correlazione è stata attribuita alla possibile modulazione
dell’attività di Runx-2 attraverso un dominio attivatorio poliGln in opposizione a uno
repressorio poliAla. Interessante notare come il fenotipo più estremo, cioè quello con il
rapporto poliGln/poliAla più basso, è molto simile al fenotipo clinico della displasia
cleidocraniale (CCD), sindrome umana causata da un aploinsufficienza di Runx-2. Inoltre,
una forma intermedia di CCD familiare è causata da una espansione di 10 triplette nella
ripetizione poliAla: questo conferma l’associazione tra una maggior lunghezza della
ripetizione poliAla e una minor attività del gene Runx-2.
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Fig 18 modello ipotetico per spiegare l’impatto della variazione nella lunghezza delle ripetizioni
sull’attività trascrizionale del gene Runx-2. l’attività trascrizionale del gene Runx-2 sarebbe frutto di
un bilancio tra i due domini attivatorio e repressorio; un alto rapporto poliGln/poliAla implica un
aumento della trascrizione per l’effetto attivatorio di poliGln, mentre un aumento di poliAla tende a
diminuire i livelli di Runx-2, probabilmente a causa della formazione di aggregati e alla
conseguente mislocalizzazione del fattore trascrizionale in maniera lunghezza dipendente.
11.3. Fattori trascrizionali contenenti ripetizioni
Nei vertebrati a sangue caldo, le proteine contenenti ripetizioni sono spesso fattori
trascrizionali implicati nello sviluppo (Huntley et al., 2004).
Queste proteine sono arricchite in alcuni aminoacidi come Alanina, Prolina e Glicina e
molti studi hanno confermato che il loro open reading frame ha un elevato contenuto in GC
(Nakachi et al., 2004). È noto che isocore ricche in GC correlano con un elevato tasso di
ricombinazione, oltre che con una replicazione precoce e un alto tasso di geni; questo
potrebbe giocare un ruolo nell’alterazione della lunghezza delle ripetizioni (MontoyaBurgos et al., 2003).
In base a quanto detto, ci sia spetta che fattori trascrizionali altamente trascritti e
contenenti ripetizioni siano codificati da geni in comparti ricchi in GC. Tuttavia, questi geni
appartengono a diversi contesti in mammiferi, rispetto che in pesci per esempio, e
potrebbero evolvere differentemente. Nello specifico, per fattori trascrizionali contenenti
tratti poli-alaninici, è stato dimostrato che la lunghezza media delle repeats è maggiore in
animali a sangue caldo che in quelli a sangue freddo (Lavoie et al., 2003). Probabilmente
nei pesci la vita acquatica impone costrizioni maggiori sulla morfologia, restringendo la
possibilità di mantenere nuovi alleli.
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11.4. Conclusioni
I risultati descritti da Fondon e Garner mostrano come l’espansione e la contrazione delle
ripetizioni in geni coinvolti nello sviluppo possano portare ad una rapida generazione di
nuovi alleli con effetti morfologici. Questi dati, che sembrerebbero essere una
reminiscenza dell’ipotesi di Goldsmith, andrebbero tuttavia interpretati in una chiave di
riconciliazione tra il Darwinismo classico e la teoria degli equilibri punteggiati di Eldredge e
Gould.
Goldsmith, nel 1940, ipotizzò che, ad un certo punto nella storia, per caso nascesse un
mostro fortunato, cioè un individuo che, da una generazione all’altra, avesse acquisito un
carattere vantaggioso in grado di aumentare moltissimo la sua fitness e rendere capace
l’individuo di per sé di dare origine a speciazione. Questo può essere vero in alcuni casi e
per alcuni geni (e il lavoro di Fondon e Garner potrebbe essere un esempio), tuttavia non è
corretto estendere il concetto in generale e pensare che la speciazione inizi a seguito di
singole mutazioni per qualsiasi gene. Le conclusioni tratte da questi studi potrebbero
servire, invece, per trovare il collante tra due visioni apparentemente discordanti, ma che
in realtà così opposte non sono. Secondo il Darwinismo filetico, nuove specie si formano
per lento accumulo di piccole modificazioni (anagenesi), facendo della macroevoluzione
un estensione della microevoluzione. La teoria degli equilibri punteggiati sostiene, invece,
che non ci siano forme intermedie, e che la speciazione proceda discretamente,
alternando lunghi periodi di stasi (l’equivalente dell’anagenesi per Darwin) a periodi di
cambiamento repentino. Per i darwinisti più estremi, la teoria degli equilibri punteggiati
sembra pura eresia, ed è stata a lungo affiancata all’ipotesi di Goldsmith; tuttavia bisogna
tener presente che Eldredge e Gould, essendo paleontologi, ritengono che la
“punteggiatura”, per quanto veloce, si realizzerebbe in una scala di milioni di anni, e non
nell’arco di una generazione, perciò questa visione non è
sovrapponibile a quella i
Goldsmith. Inoltre essi sostengono l’ipotesi di Goldsmith solo per alcuni geni, ad esempio
per i geni Hox e le trasformazioni omeotiche.
Un altro punto rilevante è il ruolo della mutazione e della selezione naturale nell’evoluzione
molecolare. Ad oggi esistono ancora visioni contrastanti sull’effettivo contributo delle
mutazioni nell’evoluzione, per quanto possa sembrarci inaccettabile; inoltre, si sta ancora
cercando di trovare una risposta alla domanda: “quale è la maggior forza che guida
l’evoluzione molecolare?”. Entrare in queste discussioni sarebbe troppo lungo, tuttavia
quello che si può concludere alla luce di quanto discusso in questa relazione è che esiste
una pressione mutazionale sulla composizione aminoacidica; la presenza di zone ricche di
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GC differenti nei diversi vertebrati, può essere interpretata come una mutazione
direzionale, la quale si riflette sul contenuto aminoacidico, ad esempio aumentando i livelli
di proteine come: alanina (GCU, GCC, GCA, GCC) e glicina (GGU, GGC, GGA, GGG),
con le conseguenze viste. Quindi, lo studio dell’evoluzione molecolare ha mostrato che
esiste una più ampia gamma di variabilità a livello molecolare/genetico tra gli organismi su
cui forze evolutive possono agire, e che i livelli su cui si può intervenire nell’evoluzione
sono molteplici; questo permette di avere un panorama che si estende oltre alla sola
selezione naturale, la quale resta comunque la principale forza evolutiva in grado di
dirigere l’evoluzione dei fenotipi degli organismi.
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