elettroforesi

ELETTROFORESI
Gli acidi nucleici migrano sempre verso il polo positivo
per la presenza nella loro molecola di cariche negative
dei gruppi fosfato (PO43- ).
Molecole, come gli aminoacidi, i peptidi, le
proteine, i nucleotidi e gli acidi nucleici,
possiedono gruppi ionizzabili e quindi, ad ogni
valore di pH, sono presenti in soluzione
come specie elettricamente cariche
Soluzione tampone: perché?
• In caso di acidi o basi organiche la loro dissociazione dipende
dal valore di pH. Se ci troviamo in un anfolita (composti che
hanno sia proprietà acide che basiche, es: Aminoacidi) sia la
loro direzione che la loro velocità sono dipendenti dal pH. Per
diminuire le variazioni di pH si usa un tampone.
• Una soluzione tampone consiste in una soluzione elettrolita
composta da un acido e la sua base coniugata. Questa ha una
duplice funzione nel processo, condurre corrente elettrica e,
come scritto sopra, mantenere costante il pH.
Elettroforesi come controllo
• l’elettroforesi può essere utilizzata per
studiare diversi campioni di sostanze quali
proteine, siero, sangue; e per individuare
anomalie nell’organismo, non solo animale ma
anche umano. Questa infatti è utilizzata
durante le analisi del sangue e può mostrare
anomalie tra le quali tumori, disfunzioni
ormonali, malfunzionamento renale o epatico.
Supporti
• La tecnica dell’Elettroforesi può avvenire su
vari supporti. Quelli maggiormente utilizzati
sono:
• 1- Carta (elettroforesi delle globuline del
sangue)
• 2- Fase liquida (all’interno di capillari)
• 3- Su gel
Elettroforesi su gel
• 1) Il gel non contiene cariche in quanto non
sono presenti gruppi ionizzanti
• 2) è possibile avere gel con maglie di
grandezza variabile (in base alla
concentrazione della matrice da usare), per
tale motivo si effettua una separazione non
solo in base alla carica ma anche in base al
peso molecolare.
• 3) si possono facilmente recuperare i campioni
dopo la separazione elettroforetica.
I gel maggiormente utilizzati nei laboratori di biologia
molecolare sono costituiti da :
- poliacrilamide, (PAGE)
- agarosio.
Le due sostanze danno origine ad una gelatina
• Il gel viene preparato in opportuni tamponi :
-TBE (Tris Borato EDTA)
-TAE (Tris Acetato)
• Usualmente per la separazione di molecole :
- a più basso peso molecolare si usa come supporto del
gel l'acrilamide
- a più alto peso molecolare si usa come supporto
l'agarosio
Un po’ di chimica…
• GEL D’AGAROSIO
• L'agarosio è un polimero lineare naturale di
galattosio e 3,6 anidro-galattosio
• GEL D’ACRILAMIDE (PAGE)
• Il gel è formato dalla polimerizzazione di
acrilamide.
In entrambi i supporti Acrilamide o
Agarosio, si assembla il sistema su un
apparecchio per elettroforesi o CELLA
ELETTROFORETICA.
Esistono in commercio un gran numero e
modelli di celle elettroforetiche, di varia :
- forma
- grandezza
- verticali
- orizzontali.
• I gel possono essere polimerizzati in tubicini di
vetro in modo da ottenere cilindretti di
acrilamide di piccolissimo spessore
(elettroforesi capillare) su cui si può
stratificare un singolo campione.
• Comunemente si usano i cosiddetti gel piatti
ottenuti per polimerizzazione del gel tra due
lastre di vetro, che consentono il caricamento
di più campioni.
Vaschette orizzontali
• I sistemi orizzontali offrono il vantaggio di poter in ogni istante
analizzare la corsa elettroforetica in quanto non contemplano
l'assemblaggio delle lastre di vetro alla vaschetta. E' quindi
possibile anche ad intervalli ravvicinati rimuovere il
gel(solitamente di agarosio perché più resistente alle varie
manipolazioni) ed analizzare la migrazione delle bande.
• Tutte le celle elettroforetiche sono costituite da 2 vaschette
contenenti il tampone (TAE o TBE) ed in comunicazione tra
loro alle quali sono collegati il polo negativo e positivo tra cui
si genera una d. d. p.
Come avviene…
• Il sistema è collegato ad un alimentatore in
grado di creare il campo elettrico.
• Grazie al campo elettrico generatosi la miscela
di frammenti comincerà a migrare verso il polo
positivo in base al loro diverso peso
molecolare: quelle più pesanti (a maggior PM)
migreranno più lentamente rispetto a quelle
più leggere (a minor PM), che a loro volta
migreranno più velocemente.
VERTICALE
ORIZZONTALE
Cosa si ottiene…
• Il risultato della corsa elettroforetica
consisterà in una serie di bande.
• Sul gel si depone anche una miscela di
frammenti a PM noto (MARKER) che servirà
per il calcolo della lunghezza in basi delle
bande incognite
Come si evidenzia…
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E' possibile visualizzare la corsa elettroforetica grazie a coloranti inerti:
-BPB (Blu di bromofenolo)
-XC ( Xilene cianolo )
che si muovono nel campo elettrico come molecole a PM noto,
Terminata la corsa è possibile evidenziare il pattern elettroforetico
mediante una colorazione specifica dovuta alla presenza di ETIDIO
BROMURO (EtBr),un agente intercalante che si frappone tra le basi
azotate ed è evidenziabile alla luce UV, colorando le bande di DNA di
arancione.
• E' possibile quindi calcolare il PM e quindi la grandezza in paia di basi dei
frammenti misurando la distanza in cm percorsa da ciascun frammento
(mobilità elettroforetica) a partire dal pozzetto fino al termine della
corsa.
Un po’ di matematica…
• Dopo la corsa si costruisce una retta di taratura su
un grafico semilogaritmico utilizzando le bande
del MARKER, una miscela di frammenti a PM
noto, riportando in ascisse la migrazione in cm ed
in ordinata il logaritmo del peso molecolare
(espresso come paia di basi).
• Interpolando sulla retta di taratura la migrazione
dei frammenti incogniti si può risalire alla
grandezza di ogni frammento.
• Infatti la mobilità elettroforetica è inversamente
proporzionale al log del peso molecolare.