Confronto tra procedure di microiniezione
Embrione
precoce
embrione
Uovo fertilizzato
Embrione
500 mm
50 mm
Cellule polari
Microiniezione del gene di
interesse inserito nel vettore
nelle cellule polari
Microiniezione del gene di
interesse come DNA lineare
nel pronucleo maschile
Si
introducono
embrioni
microiniettati in madri
adottive pseudogravide
.
.
.
Alcuni embrioni si svilupperanno e
avranno nelle loro cellule germinali il
gene di interesse
Nelle cellule somatiche delle progenie può essere evidente il DNA inserito
( se per esempio è un gene per il colore del mantello)
È necessario un ulteriore incrocio per identificare i topi in cui il DNA
si è inserito nella linea germinale e può quindi essere trasmesso a
tutta la progenie stabilmente
TOPI TRANSGENICI che avranno copie in
tandem del gene inserite a caso in un cromosoma
Tutte le Drosophile
saranno incrociate per
verificare la presenza
del gene di interesse
Drosophile TRANSGENICHE che avranno una singola
copia del gene di interesse inserita in un cromosoma
Uso delle cellule embrionali staminali (ES) per ottenere topi transgenici
Cellule ES
Prelievo di cellule embrionali
staminali da una blastocisti
di topo
Trasformazione delle cellule ES con
DNA da inserire
Cellule ES trasformate con
DNA di interesse e controllate
per PCR o per Southern per
verificare l’inserimento
(si
possono anche SELEZIONARE
le cellule con il costrutto di
interesse)
Progenie chimerica
Impianto in una madre pseudogravida
Dopo un incrocio
si ottiene il
topo fondatore
Un vantaggio di questo sistema è che Inserimento di cellule ES
trasformate
in
una
inserendo come marcatore selezionabile il blastocisti
gene neoR insieme al gene da inserire, si
possono selezionare direttamente le cellule
ES che hanno integrato il DNA esogeno,
facendole crescere su terreno con G418
Knock out di geni di topo
Una delle applicazioni più frequenti della produzione di topi transgenici sono gli studi di
Cellule staminali con il
GENOMICA FUNZIONALE -> l’identificazione della funzione di una sequenza
di DNA
gene non funzionale
mediante disattivazione
del gene a funzione non nota ed analisi del (una
fenotipo
copia) e derivanti
Gene di interesse
da topi con il colore
NERO del mantello
ingegnerizzato
neoR
Inserimento in cellule ES
Cellule con il
gene alterato
neoR
Cellule con il
gene normale
Appaiamento e crossing over
P
gene normale
RICOMBINAZIONE OMOLOGA
P
Embrione
derivante
da un topo con il
colore bianco del pelo
neoR
Il gene inserito nelle cellule ES non è più funzionale
Impianto in una madre
adottiva con pelo bianco
Progenie
chimerica, le parti
che
si
sono
sviluppate
dalle
cellule
staminali
sono nere
L’incrocio delle chimere con omozigoti bianchi produce i topi
fondatori, questi topi sono ETEROZIGOTI per il gene non funzionale.
Incrociando gli eterozigoti tra loro si ottengono omozigoti per il gene
mutato e si controlla il genotipo
