topi transgenici
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Confronto tra procedure di microiniezione Embrione precoce embrione Uovo fertilizzato Embrione 500 mm 50 mm Cellule polari Microiniezione del gene di interesse inserito nel vettore nelle cellule polari Microiniezione del gene di interesse come DNA lineare nel pronucleo maschile Si introducono embrioni microiniettati in madri adottive pseudogravide . . . Alcuni embrioni si svilupperanno e avranno nelle loro cellule germinali il gene di interesse Nelle cellule somatiche delle progenie può essere evidente il DNA inserito ( se per esempio è un gene per il colore del mantello) È necessario un ulteriore incrocio per identificare i topi in cui il DNA si è inserito nella linea germinale e può quindi essere trasmesso a tutta la progenie stabilmente TOPI TRANSGENICI che avranno copie in tandem del gene inserite a caso in un cromosoma Tutte le Drosophile saranno incrociate per verificare la presenza del gene di interesse Drosophile TRANSGENICHE che avranno una singola copia del gene di interesse inserita in un cromosoma Uso delle cellule embrionali staminali (ES) per ottenere topi transgenici Cellule ES Prelievo di cellule embrionali staminali da una blastocisti di topo Trasformazione delle cellule ES con DNA da inserire Cellule ES trasformate con DNA di interesse e controllate per PCR o per Southern per verificare l’inserimento (si possono anche SELEZIONARE le cellule con il costrutto di interesse) Progenie chimerica Impianto in una madre pseudogravida Dopo un incrocio si ottiene il topo fondatore Un vantaggio di questo sistema è che Inserimento di cellule ES trasformate in una inserendo come marcatore selezionabile il blastocisti gene neoR insieme al gene da inserire, si possono selezionare direttamente le cellule ES che hanno integrato il DNA esogeno, facendole crescere su terreno con G418 Knock out di geni di topo Una delle applicazioni più frequenti della produzione di topi transgenici sono gli studi di Cellule staminali con il GENOMICA FUNZIONALE -> l’identificazione della funzione di una sequenza di DNA gene non funzionale mediante disattivazione del gene a funzione non nota ed analisi del (una fenotipo copia) e derivanti Gene di interesse da topi con il colore NERO del mantello ingegnerizzato neoR Inserimento in cellule ES Cellule con il gene alterato neoR Cellule con il gene normale Appaiamento e crossing over P gene normale RICOMBINAZIONE OMOLOGA P Embrione derivante da un topo con il colore bianco del pelo neoR Il gene inserito nelle cellule ES non è più funzionale Impianto in una madre adottiva con pelo bianco Progenie chimerica, le parti che si sono sviluppate dalle cellule staminali sono nere L’incrocio delle chimere con omozigoti bianchi produce i topi fondatori, questi topi sono ETEROZIGOTI per il gene non funzionale. Incrociando gli eterozigoti tra loro si ottengono omozigoti per il gene mutato e si controlla il genotipo
