Tag and exchange
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Applicazioni genetica umana e molecolare II parte Dr. Stefania Gonfloni [email protected] Studio 4319 BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI Principi e tecniche Terry A. Brown BIOTECNOLOGIA MOLECOLARE Principi e applicazioni del DNA ricombinante Bernard R. Glick Jack J.Pasternak GENETICA UMANA E MOLECOLARE Stracan T. Read A.P. Che cos’è la clonazione dei geni? 1. Frammento di DNA con il gene da clonare viene inserito in un Vettore 2. Il vettore trasporta il gene all’interno della cellula ospite 3. Il vettore si moltiplica all’interno della cellula ospite producendo numerose copie uguali non solo a se stesso ma anche del gene che trasporta 4. Quando la cellula ospite si divie, alla progenie vengono passate copie della molecola di DNA ricombinante ed il vettore si moltiplica ulteriormente 5. Dopo un grande numero di divisioni cellulari, si produce una colonia, o clone costituita da cellule identiche. La PCR Espressione genica con promotori forti e regolabili Vettori per l’espressione dei geni ptac: ibrido funzionale dai promotori trp (-35) e lac (-10) Integrazione del gene clonato nel sito cromosomico b. subtilis Vettore di espressione eucariotico p:unità di trascrizione eucariotica Metodo per ottenere sequenze di cDNA a lunghezza completa Saggio di protezione dalla nucleasi S1 SAGE Screening multiplo dell’espressione genica Immunoblotting (Western blotting) Immunocitochimica Espressione della -tubulina in un cervello di un embrione di topo di 12, 5 giorni Immunofluorescenza Proteina a fluorescenza verde come etichetta fornisce un modo utile per seguire l’espressione delle proteine Identificazione di sequenze di regolazione mediante l’uso di geni Indicatori e le interazioni tra DNA e proteine Analisi delle delezioni nella regionie promotore del gene umano per Il fattore VIII Footprinting mediante DnasiI Saggio di ritardo nel gel I sistemi “a doppio ibrido” e a “singolo ibrido” in lievito Phage display Preparazione di topi transgenici mediante microiniezione nei pronuclei La mutagenesi mirata mediante ricombinazione omologa puo’ inattivare un predeterminato gene cromosomico all’interno di una cellula integra “Hit and run” La mutagenesi mirata con doppia sostituzione può essere usata per introdurre nel DNA piccole mutazioni “Tag and exchange” Il metodo knock-in consente di sostituire l’attività di un gene di un dato cromosoma con quella di un altro gene appositamente introdotto Struttura della sequenza di riconoscimento di loxP Gene trapping Clonazione animale
