Esami in laboratorio
Colorazione
di Gram
Esami
colturali
Biologia
molecolare
(?)
Colorazione di Gram
Fasi della colorazione
Struttura della parete
Gram-positivi
Gram-negativi
Esame colturale per batteri
Gram-negativi
• agar McConkey (Enterobatteri)
• agar sangue (G. vaginalis)
• agar cioccolato (Gonococco)
Gram-positivi
• agar sale mannite (Stafilococchi)
• agar sangue (Streptococchi )
Identificazione microbica
Batteri Gram-negativi
Prove biochimiche:
TSI agar
Indolo e/o
Mobilità in
SIM agar
Gallerie API 20 E
Gallerie API 20 NE
Gallerie API NH
Colorazione di Gram
1884 Hans Christian Gram
-Tecnica basata sulle proprietà fisiche
della pareta cellulare
Identificazione microbica
Staphylococcus aureus
Mannite+ e Coagulasi+
Test coagulasi
Test catalasi
Gallerie API Staph (bioMérieux)
Lieviti: esame colturale
Sabouraud dextrosio agar
(Incubazione a 37° per 2-5 gg)
Diversità morfologica dei microrganismi
DIVERSITà MORFOLOGICA DELLE COLONIE
IMPORTANZA DEI PIGMENTI
E DEI MARGINI DELLE COLONIE
PANORAMA SULLA DIVERSITA MORFOLOGICA: LE COLONIE
DIVERSITà METABOLICA
DALLA
COLONIA
Test biochimici
identificativi
DIVERSITà METABOLICA
Controllo dello sviluppo
microbico
• Per controllo dello sviluppo microbico
si possono intendere diverse cose: si
può volere inibire e non uccidere i
microrganismi,
oppure
si
vuole
eliminare totalmente la popolazione
microbica su soggetti inanimati o su
superfici viventi.
• Si usano diversi metodi e diverse
terminologie ne indicano le finalità.
Controllo dello sviluppo
microbico
• Sterilizzazione: è il processo in cui
vengono distrutte o rimosse tutte le
cellule viventi (includendo le spore, i virus
e i viroidi) da un determinato habitat o
da oggetti inanimati;
• Disinfezione: uccisione o inibizione di soli
microrganismi patogeni e disinfettanti
sono gli agenti chimici che vengono
usati nei processi di disinfezione;
• Sanificazione: la carica microbica viene
ridotta entro limiti considerati sicuri per gli
standard di sanità pubblica;
Controllo dello sviluppo
microbico
• Antisepsi: è la pratica in grado di
prevenire una infezione e si dicono
antisettici i composti chimici utilizzati;
• Antibiotici e chemioterapici: rientrano
nelle categorie dei composti in grado
di controllare lo sviluppo microbico.
Il modello di morte
microbica
• La distruzione di una popolazione
microbica non avviene istantaneamente
con l’esposizione ad un agente letale.
• Dopo che la popolazione ha subito una
marcata riduzione, il tasso di mortalità
rallenta e ciò consente la sopravvivenza
di ceppi microbici più resistenti.
• E’ molto difficile stabilire il punto di morte
dei microrganismi: quando avviene?
Generalmente quando una cellula,
inoculata in brodo fresco, non dà più
origine ad una progenie.
• COLTURE DI MICRORGANISMI
La coltivazione dei batteri in laboratorio richiede
l'impiego dei cosiddetti "terreni" o "mezzi di coltura", con i
quali si cerca di riprodurre artificialmente un ambiente in
grado di soddisfare le esigenze metaboliche del microrganismo
che si desidera coltivare. Il terreno, prima della semina, deve
essere sterile e contenuto in recipienti sterili dotati di un
sistema di chiusura che garantisca la sterilità del contenuto.
Tutte le operazioni relative alla semina devono essere condotte
osservando precauzioni necessarie a evitare la contaminazione
del terreno ad opera dei batteri presenti nell'ambiente.
Colture di microrganismi
RIPRODUCENDO LE CARATTERISTICHE
DELL’AMBIENTE DI ORIGINE è POSSIBILE OTTENERE
DELLE COLTURE E MANTENERE I MICROOGANISMI IN
LABORATORIO PER STUDIARNE LE CARATTERISTICHE
FISIOLOGICHE, L’ATTIVITà ANCHE AL FINE PER
APPLICAZIONI BIOTECNOLOGICHE.
Microbiologia : analisi delle acque
- Solo implicazioni di tipo sanitario, ricerca di germi indicatori di
inquinamento
MEZZI (TERRENI) DI COLTURA
solido
liquido
I terreni di coltura
• Per coltivare i batteri dobbiamo ricreare
l’ambiente adeguato alla crescita e la
mistura adatta a questo è chiamata
terreno di coltura.
• Il terreno provvede i nutrienti più adatti
per quella specie, nonché un ambiente
controllato dal punto di vista del pH
I terreni di coltura
• Liquidi – vengono chiamati brodi
• Solidi – vengono solidificati
mediante l’aggiunta di un
polisaccaride colloidale derivato
dalle alghe rosse e chiamato agar
• L’agar non è idrolizzabile dai batteri
I terreni di coltura
• Terreni complessi
• Terreni chimicamente definiti
• Terreni di isolamento
• Terreni di arricchimento
• Terreni di identificazione e
differenziali
Brodo nutritivo
Costituenti
Peptone
Quantità g/L
5
Estratto di carne 3
Agar MacConkey
Costituenti
Idrolizzati pancreatici
di gelatina
Quantità g/L
17,0
Idrolizzati pancreatici
di caseina
1,5
Idrolizzati peptici di
tessuto animale
1,5
Lattosio
10,0
Sali biliari
1,5
Cloruro di sodio
5,0
Rosso neutro
0,03
Cristal violetto
0,001
Agar
13,5
d DI COLTURA
MEZZI (TERRENI)
i
u
m
The Staphylococcus aureus ferments
mannitol and turns the medium yellow.
The Serratia marcescens does not grow
because of the high salt content.
Esempio di Terreno selettivo:
y
e
l
l
o
w
. Streptococcus agalactiae does not grow on
MSA because of the high salt content.
Staphylococcus epidermidis grows but
does not ferment mannitol.
T
h
e
MANNITOL SALT AGAR
S
Selettivo per Staphylococcus spp. e Micrococcaceae;
e
r
r
a
t
i
TERRENO DI COLTURA: differenziale
Sodium Chloride
5.0gm
Sodium Acetate
2.0gm
Monoammonium
Phosphate
1.0gm
Dipotassium
Phosphate
1.0gm
Magnesium Sulfate
0.1gm
Bromothymol Blue
0.08gm
Agar
20.0gm
Final pH 6.7 +/- 0.2 at 25 °C.
Escherichia coli
Formazione di colonie su
Acetate Differential Slant.
Incubazione in aerobiosi.
24 h at 35°C
Shigella flexneri
Inibito dall’ acetato.
Assenza di crescita Acetate
Differential Slant.
Incubazione in aerobiosi .
24h a 35 °C
Terreni sintetici e chimicamente definiti
Esempio terreno sintetico per E.coli
Glucosio
1,0 g/L
Na2HPO4
16,4
KH2PO4
1,5
(NH4)2SO4
2,0
MgSO4
200 mg
CaCl2
10 mg
FeSO4
0,5 mg
pH finale 6.8-7.0
Microscopia ottica ed elettronica
Concetti chiave
1. Ingrandimento
2. Potere risolutivo: capacità di mostrare due punti adiacenti come distinti.
- occhio umano 75-100 µm
- microscopio ottico: 0.2 µm (200 nm)
- microscopio elettronico: 0.2-2 nm
Il potere risolutivo dipende dalla caratteristiche fisiche del mezzo (lucefascio di elettroni)
Schema: microscopio composto
OCULARETubo metallico
GENERALMENTE
BINOCULARE !!
Ruota obiettivi
Braccio
OBIETTIVO 10X
OBIETTIVO 40X
OBIETTIVO 100X
Tavolino
Porta campione
Ganci
Vite macrometrica
Condensatore
Diaframma
Vite micrometrica
Sorgente di luce
Base microscopio
MESSA A
FUOCO
Principi di base: microscopio composto
Sistema di lenti convergenti:
1. Oculare ed 2. Obiettivo all’estremità di un tubo metallico (160 mm)
-
Campione (oggetto) davanti l’ obiettivo → immagine reale-capovolta ed
ingrandita
- Immagine reale, capovolta ed ingrandita davanti all’oculare →immagine virtuale,
capovolta ed ingrandita
Principi di base: microscopio composto
INGRANDIMENTO
FISSO
10X oculare
10X, 40X,100X
obiettivi
Ingrandimento
totale=
Ingr. oculare X
Ingr. obiettivo
OBIETTIVO ED OCULARE
LAVORANO INSIEME
PER RISOLVERE L’IMMAGINE
L’oculare “risolve” l’immagine “reale”
risolta dall’obbiettivo
Microscopio composto: obiettivo 100X ad immersione
- L’obiettivo 100X è sempre ad
immersione
- L’obiettivo 100X è retrattatile
- L’olio ha lo stesso indice di rifrazione
del vetro dell’obiettivo
Osservazione in vivo e le colorazioni
1. Osservazione in vivo:
- vetrino + goccia campione+ coprioggetto
- vetrino + goccia campione + inchiostro di china+ coprioggetto
- vetrino + goccia campione+ coprioggetto
2. Le colorazioni. I coloranti sono composti organici con differenti affinità
per specifiche componenti cellulari.
Distinguiamo :
A: Coloranti cationici (basici) [ strutture cellulari cariche negativamente, acidi nucleici e
polisaccaridi acidi, COO-] : blu di metilene, safranina e cristal violetto
B. Coloranti anionici: (acidi )[ strutture
cellulari citoplasmatiche].
Eosina, Rosso congo, Fucsina acida.
La colorazione di Gram
1. Aggiunta del cristal violetto
2. lavaggio
La colorazione di Gram
3. Aggiunta della soluzione di
iodio (Lugol)
4. lavaggio
La colorazione di Gram
5. Dopo la decolorazione con
alcool-acetone il passaggio
finale è la colorazione di
contrasto con safranina
La colorazione di Gram
Un Gram positivo
Un Gram negativo
Un Gram positivo
Diversità morfologica dei microrganismi
Numero e
disposizione dei
flagelli in rapporto
alla cellula
Monotrico
Anfitrico
Flagello/i non
visibile al
microscopio!!!
Lofotrico
MORFOLOGIA CELLULARE
Peritrico
