DIAGNOSTICA ENZIMATICA GLI ENZIMI SI DOSANO SU DIVERSI LIQUIDI BIOLOGICI: -­‐ PLASMA O SIERO -­‐ URINE, SALIVA, ESSUDATI, ecc. I CONTESTI DIAGNOSTICI IN CUI SI USANO QUESTI DOSAGGI SONO DUE: 1. Valutazione aDvità di produzione dell’enzima: malaDe geneMco-­‐metaboliche con ↓ dell’aDvità enzimaMca (per es., fenilchetonuria, glicogenosi, ecc.) 2. Valutazione della quanMtà di enzima rilasciata dalle cellule nei liquidi biologici per iperproduzione o danno cellulare: ↑ dei valori (per es. infarto del miocardio, tumori, ecc.) Generalmente per misura di un enzima si intende la misura della sua a:vità enzima@ca che si oDene misurando la quanMtà di substrato che l’enzima presente nel campione trasforma nel prodoXo nell’unità di tempo. Enzimi di valore diagnosMco I dosaggi enzimaMci comunemente usaM a scopo diagnosMco sono numericamente limitaM: solo una decina sono di impiego rouMnario e quesM oggi cosMtuiscono circa il 30% del carico di lavoro di un comune laboratorio diagnosMco. ENZIMI DI INTERESSE DIAGNOSTICO GLI ENZIMI PRESENTI NEL SANGUE POSSONO ESSERE CLASSIFICATI IN -­‐ ENZIMI SPECIFICI (per es., quelli coinvol@ nella coagulazione del sangue) -­‐ ENZIMI SECRETI O RIASSORBITI (svolgono la loro funzione in altri tessu@) -­‐ ENZIMI CELLULARI (che svolgono funzioni intracellulari e sono riversa@ nel sangue nel turnover cellulare) CARATTERISTICHE DEGLI ENZIMI usa@ a scopo diagnos@co Gli aumen@ o le diminuzioni di a:vità enzima@che sieriche sono sempre correla@ ad alterazioni della funzionalità cellulare ORGANI DIVERSI ESPRIMONO UN PATTERN ENZIMATICO DIVERSO • Organi diversi hanno una diversa dotazione enzimaMca (differenze metaboliche) • Ci sono enzimi organo-­‐specifici: glutammatodeidrogenasi (GLDH o GD) è l’enzima organo-­‐specifico del fegato, mentre la crea@na chinasi (CK) lo è del muscolo ORGANI DIVERSI ESPRIMONO ISOENZIMI DIVERSI •
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Gli isoenzimi, o isozimi, sono forme mulMple di un enzima che catalizzano la stessa reazione, ma differiscono nella struXura o nella composizione in subunità. Ad esempio, la laTato deidrogenasi (LDH) è una proteina tetramerica cosMtuita da due differenM catene polipepMdiche, M ed H. Dalle diverse combinazioni delle due catene si hanno cinque isoenzimi: M4, M3H, M2H2, MH3, H4. La creaMnachinasi (CK) è una proteina dimerica cosMtuita da due differenM catene polipepMdiche, B e M. Dalle diverse combinazioni di queste due catene si hanno tre isoenzimi: BB, BM e MM. •
Hanno caraXerisMche fisiche (i.e., massa), chimiche (i.e., composizione, pI) e biochimiche (pH oDmale, costanM cataliMche (Km, Vmax)) diverse, e sono pertanto discriminabili con tecniche analiMche specifiche. •
Sono presenM in tessuM diversi. Per es., la M4 è prevalentemente espressa nel muscolo scheletrico, mentre la forma H4 è presente solo nel miocardio. Altro esempio, la fosfatasi alcalina acida è presente nella prostata, la fosfatasi alcalina basica è presente nel fegato e nelle ossa. •
Poiché gli isoenzimi sono distribuiM in maniera differente nei vari organi, l'analisi quanMtaMva di quesM consente di risalire all'organo bersaglio della patologia. Dunque livelli alteraM di quesM sono indici specifici di alcune malaDe come quelle cardiache, muscolari, ossee, etc., per questo sono di grande uMlità diagnosMca. ISOENZIMI DELLA CK Crea@na chinasi (CK) LaTato deidrogenasi (LDH) FOSFATASI ALCALINA (ALP) La ALP è presente sopraXuXo nel fegato (canalicoli biliari) e nelle ossa (osteoblasM), placenta e rene. La ALP aumenta nelle: • Affezioni del sistema epato-­‐biliare (poco in cirrosi, epaMte); • Alterazioni della sostanza ossea (rachiMsmo, metastasi ossee, Morbo di Paget); • IperparaMroidismo • Patologie infiammatorie croniche intesMnali UMlità diagnosMca della misura dell’aDvità della ALP nel sangue Un aumento elevato (5 volte superiore ai valori di riferimento) può essere dovuto a situazioni come: •
cirrosi biliare •
ostruzione delle vie biliari •
morbo di Paget •
altre patologie Un aumento moderato (3 -­‐ 5 volte superiore ai valori di riferimento) può essere dovuto a situazioni come: •
epatopaMe •
mononucleosi infeDva •
altre patologie Un aumento lieve (fino a 3 volte superiore ai valori di riferimento) può essere dovuto a situazioni come: •
epaMte virale •
fraXure •
gravidanza Una diminuzione può essere dovuta a situazioni come: •
ipoMroidismo •
scorbuto •
cachessia •
anemie Valori di riferimento • I valori dell’aDvità nel sangue della fosfatasi alcalina normalmente variano • fra 110 e 700 UI/l nei bambini fino a un anno, • fra 110 e 550 UI/l da 1 anno a 10 anni, • fra 130 e 700 UI/l da 10 a 15 anni, • fra 50 e 220 UI/l negli adulM. Metodi Enzima@ci di Analisi Analisi Enzima+ca di Substra+ Gli enzimi vengono usaM spesso per idenMficare e/o per quanMficare sostanze chimiche specifiche in soluzione. I vantaggi sono derivaM dal faXo che le reazioni enzimaMche sono veloci e molto specifiche per la natura dei substraM e che, anche in condizioni molto blande, catalizzano reazioni che raramente procedono a velocità significaMve. La specificità degli enzimi può superare la necessità di rimuovere materiali interferenM dai campioni. Saggi di A:vità Enzima@ca È possibile determinare la quan@tà di enzimi par@colari in fluidi biologici misurandone l’a:vità con substra@ specifici. Per queste determinazioni si misura la velocità di conversione di un par@colare substrato in prodoTo invece del grado a cui procede la reazione. La cine@ca della maggior parte delle reazioni enzima@che è descriTa dalla equazione di Michaelis-­‐Menten: La velocità di una reazione enzimaMca aumenta con l’aumentare della [S] fino a raggiungere un limite oltre il quale non aumenta più (saturazione = tuXo “E” è legato a “S” soXoforma di complesso ES) ma resta costante a meno che non si aumenta [E] Per valutare l’a:vità enzima@ca, viene impiegata una concentrazione di substrato [S] >> KM in modo che la V0 misurata corrisponda con buona approssimazione alla Vmax: Queste condizioni sperimentali sono note come cine@ca di ordine zero: non c’è alcuna dipendenza dalla concentrazione del substrato, la velocità osservata è proporzionale alla concentrazione di enzima. Unità di a:vità enzima@ca e dosaggio degli Enzimi Catal (kat): è la quan@tà di enzima che converte 1 mole di reagente nel prodoTo in 1 secondo nelle condizioni di reazione standard (o:mali). L’Unità internazionale (U o UI): corrisponde alla quan@tà di enzima che converte 1 µmole di reagente nel prodoTo in 1 minuto. Poiché 1 µmole /min = 1.67 ×10-­‐8 moli/s quindi U = 1.67 ×10-­‐8 kat. La concentrazione enzima@ca è espressa come UI/L o soTomul@pli UI/mL (in alcuni casi anche UI/mg). FaTori che influenzano le reazioni catalizzate dagli enzimi Inibitori Mol@ enzimi sono inibi@ da varie sostanze, pertanto bisogna tenere conto di ques@ faTori e usare controlli appropria@. Per es., agen@ chelan@, come citrato e altri compos@ capaci di formare complessi bidenta@ con metalli sono spesso inibitori poten@ di alcuni enzimi metallo-­‐dipenden@ come le chinasi. pH Temperatura CofaTori (co-­‐enzimi e cofaTori metallici) ESERCITAZIONE: Misurazione sperimentale dei parametri cine@ci della fosfatasi alcalina Misure sperimentali e analisi dei da@ cine@ci Per misurare la velocità di reazione abbiamo bisogno di un sistema per seguire la formazione del prodoTo o il consumo di substrato. Via via che il substrato viene consumato la velocità diminuisce fino a quando alla fine viene raggiunto l’equilibrio. Di regola, si preferisce predisporre una serie di esperimen@ tu: alla stessa concentrazione di enzima, ma a diverse concentrazioni di substrato e misurare la velocità iniziale (V0). Saggio SpeTrofotometrico Spesso si usano metodi speTrofotometrici per monitorare le reazioni enzima@che. Ques@ possono essere molto convenien@ se il substrato o il prodoTo contengono un gruppo cromoforo (o fluoroforo) dis@nto. Assorbimento della radiazione UV/visibile dovuto a transizioni energeMche degli eleXroni degli straM esterni delle molecole. Quando la luce colpisce una molecola essa può essere trasmessa (nessuna interazione) o assorbita. Il livello di assorbimento della radiazione che aXraversa un campione di sostanza in soluzione viene misurato da uno strumento noto come speXrofotometro. Legge di Lambert e Beer L’assorbimento di radiazione luminosa da parte di una sostanza in soluzione viene descriXo quanMtaMvamente con la legge di Lambert e Beer, l’equazione fondamentale della speXrofotometria. A= Assorbanza (o densità oDca); è un numero adimensionale, il cui valore varia linearmente con la concentrazione della soluzione. ε=Coefficiente di esMnzione molare (mM-­‐1xcm-­‐1); la densità oDca di una soluzione a concentrazione unitaria e misurata in un cammino oDco lungo 1 cm. È una costante specifica di ogni sostanza a una data lunghezza d’onda. d=Cammino oDco della soluzione (cm). C=Concentrazione della soluzione della sostanza (mM) Reazione usata per la misura dell’a:vità enzima@ca della fosfatasi alcalina PNPP PNP pH = 9 2 mM Mg2+ La fosfatasi alcalina è un enzima Mg-­‐dipendente che catalizza l’idrolisi di tu: i fosfomonoesteri. Si esegue il saggio enzima@co con un composto non naturale sinte@zzato chimicamente: il p-­‐nitrofenilfosfato (PNPP) che viene idrolizzato a p-­‐
nitrofenolo (PNP) e fosfato (Pi). La forma ionica del PNP è colorata (massimo di a s s o r b i m e n t o a 4 0 5 n m ) q u i n d i l a r e a z i o n e p u ò e s s e r e m i s u r a t a speTrofotometricamente. Poiché la variazione di [S] rispeTo a t è pressoché lineare nelle fasi iniziali è possibile eseguire analisi accurate di V in funzione di [S]. Una volta oTenu@ i da@ riguardo l’andamento di V in funzione di [S] come è possibile determinare KM e kcat? Comunemente viene usato il grafico dei doppi reciproci o di Lineweaver-­‐Burk che è un riarrangiamento dell’equazione di Michaelis-­‐Menten: 1/V = (KM+[S])/(Vmax[S])=KM/(Vmax[S])+[S] /(Vmax[S]) Ovvero: 1/V = KM/(Vmax[S])+1 /Vmax Quando 1/[S] = 0 significa che [S] è infinitamente grande e la velocità di reazione è al suo valore massimo. Si no@ che avendo Vmax e [E]t si può calcolare kcat, sapendo che Vmax = kcat[E]t. Per oTenere il valore di Km estrapoliamo il grafico di Lineweaver-­‐Burk a un punto ipote@co in cui 1/V=0.
