Presentazione di PowerPoint

Estrazione rapida di DNA
plasmidico da Escherichia
coli
(QIAscreen)
Corso di INGEGNERIA GENETICA, Prof. Renato Fani,
ESERCITAZIONE DI LAB. N.1
PLASMIDI
IN NUMEROSE SPECIE BATTERICHE SONO PRESENTI I
PLASMIDI, MOLECOLE DI DNA PIU’ PICCOLE DEL
GENOMA,GENERALMENTE CIRCOLARI, A DOPPIA
ELICA E DI DIMENSIONI VARIABILI. ESSI SONO
DOTATI DI CAPACITA’ REPLICATIVA AUTONOMA
TALORA IN GRADO DI INTEGRARSI NEL GENOMA
(EPISOMI) E POSSONO CONFERIRE FENOTIPI
RILEVANTI AI BATTERI (VIRULENZA – RESISTENZA,
FISSAZIONE DELL’AZOTO, DEGRADAZIONE
COMPOSTI XENOBIOTICI, …).
PLASMIDI
OC
CCC
Trasmissione di geni per
via orizzontale
(CONIUGAZIONE BATTERICA)
Anche i casi di semplice trasferimento dei pochi geni
presenti su un plasmide, sembrano aver rappresentato uno
dei motori trainanti per l’evoluzione delle forme di vita e
dei procarioti in particolare.
I plasmidi
I plasmidi sono utilizzati in tecniche di biologia molecolare
Uno dei più classici:
I plasmidi
Regioni importanti:
bla
(ApR), corrisponde al gene
codificante un enzima capace di
conferire alla cellula che ospita il
plasmide la resistenza all’antibiotico
ampicillina.
tet (TcR), gene che conferisce la
resistenza all’antibiotico tetraciclina.
rep, corrisponde alla regione che serve
alla
replicazione,
e
quindi
al
mantenimento, del plasmide, in sua
assenza il plasmide viene perso perché
non può più essere replicato
I punti indicati dalle scritte blu
corrispondono a specifici siti al cui
interno è possibile inserire il DNA da
analizzare.
IN COSA CONSISTE DUNQUE
L’ESERCITAZIONE
DI OGGI?
ESTRAZIONE DEL DNA
PLASMIDICO MEDIANTE LISI
ALCALINA
PROTOCOLLO
1. Da una piastra di cellule batteriche, recanti il plasmide
d’interesse, o da uno “stock” di batteri in glicerolo, viene
effettuato, in condizioni sterili, l’inoculo di una singola
colonia, in 3ml di brodo LB con opportuno antibiotico,
all’interno di un tubo batteriologico da 15 ml. Il tubo viene
incubato per circa 12-16 ore a 37°C in agitazione,
affinché la coltura batterica raggiunga la fase di crescita
stazionaria.
LB + antibiotico
PROTOCOLLO
2. La coltura viene quindi centrifugata a 12000 rpm
per 1-3 minuti, ottenendo così un “pellet” di
cellule batteriche che viene poi risospeso in 300μl
(0,3 ml) di soluzione di risospensione, o soluzione
P1 (50mM Tris-HCl pH 8, 10 mM EDTA pH 8 +
RNasiA).
Tris HCl
Tampone con la funzione di creare un microambiente favorevole
al mantenimento del DNA in condizioni ottimali.
EDTA
Chelante degli ioni bipositivi (soprattutto calcio e magnesio) serve a
disattivare gli enzimi litici (Dnasi) che si liberano con la lisi cellulare e che
potrebbero degradare il DNA. Destabilizzante delle membrane biologiche.
RNasiA
Enzima indispensabile alla degradazione dell’RNA, che altrimenti
potrebbe mascherare il segnale dato dal DNA.
PROTOCOLLO
3. Aggiungere 300 μl di soluzione di lisi, o soluzione P2
(200 mM NaOH, 1% SDS), agitare delicatamente
per inversione e incubare a temperatura ambiente
per max 5’.
NaOH
Eleva il pH determinando uno stress osmotico che destabilizza
la parete cellulare. Denatura tutte le strutture ad alto peso molecolare
compreso il DNA cromosomico.
SDS
Scioglie la membrana plasmatica.
PROTOCOLLO
4. Aggiungere 300 μl di soluzione neutralizzante o P3
(2,55 M K-acetato pH 4,8), mescolare ancora per
inversione e centrifugare a 13000 rpm per 15’.
K-acetato
Riporta il pH a valori lggermente basici (intorno a 8)
determinando la rinaturazione rapida e imperfetta delle strutture
cellulari (flocculi biancastri) ad eccezione del DNA plasmidico.
PROTOCOLLO
5. Recuperare il sopranatante con una micropipetta e
trasferirlo in una nuova eppendorf. Precipitare il
DNA con 0,8 volumi di isopropanolo mediante
centrifugazione per 15’.
Le soluzioni alcoliche servono per far precipitare gli acidi nucleici.
PROTOCOLLO
6. Il pellet del DNA viene sottoposto a due lavaggi
con etanolo 70%, centrifugando per 2’ a 13000 rpm.
Dopo averlo essiccato brevemente risospendere in 20
μl di TE o dH20.
PROTOCOLLO
7. La concentrazione del DNA estratto e purificato
viene stimata sottoponendo un’aliquota ad
elettroforesi su gel di agarosio, con Bromuro di
etidio (EtBr), insieme ad aliquote di preparazioni a
concentrazione nota utilizzate come “standard”.
reparazione di un gel di agarosio
. Pesare la quantità opportuna di agarosio (in base alle dimensioni dei frammenti da separare)
ed aggiungerla al volume stabilito di tampone TEA 1 X.
. Portare ad ebollizione il gel su piastra magnetica o in un forno a microonde e verificare il
completo scioglimento dell'agarosio.
. Aggiungere la giusta quantità di bromuro di etidio ATTENZIONE: agente mutageno
. Versare il gel nella vasca elettroforetica all’interno della slitta, sulla quale sarà stato
precedentemente sistemato un pettine vicino ad un'estremità della vaschetta. I denti del
pettine formeranno, una volta solidificatosi il gel, i pozzetti in cui verranno caricati i campioni
di DNA. E’ estrememente importante che i denti del pettine non tocchino la base della slitta,
per evitare, al termine della preparazione, che i pozzetti risultino "bucati".
AGAROSIO.
. Quando il gel si è perfettamente solidificato (solitamente sono sufficienti per questo circa
Un polimero lineare estratto da alghe, solido a temperatura ambiente.
30 minuti a temperatura ambiente), rimuovere delicatamente il pettine e i supporti per la slitta
BROMURO DI
ETIDIO.
dalla
vasca elettroforetica.
Il 3-8 diamino 5 etil-fenilfenantridio bromuro è un mutageno che si intercala tra le basi del DNA e per questo motivo va utilizzato con prudenza ed è
necessario indossare i guanti quando si utilizzano materiali che lo contengono. Possiede la proprietà di illuminarsi per fluorescenza quando viene colpita
da un fascio di
luce ultravioletta.
. Aggiungere
il tampone da elettroforesi (TEA 1X) fino a coprire il gel per almeno 2 mm.
Viene preparato come soluzione a 10 mg/ml in acqua distillata e conservato a 4°C.
reparazione e caricamento dei campioni
Aggiungere Blue di Bromofenolo ai campioni di DNA (ad esempio 2 μl di Blue per 10 μl di
campione) e caricarli nei pozzetti con una micropipetta.
.
. Applicare il coperchio alla vasca elettroforetica e inserire gli elettrodi in modo tale che
il polo positivo (rosso) si trovi all'estremità del gel più lontana dai pozzetti.
tilizzando come riferimento la banda del Blue di Bromofenolo, continuare la corsa
elettroforetica per il tempo desiderato.
BLU DI BROMOFENOLO (BBF).
Il BBF è un colorante blu violaceo che viene aggiunto al campione che carichiamo su gel di agarosio in modo da visualizzarne la corsa.
Di questo colorante sfruttiamo la mobilità in direzione dell’anodo, caratteristica analoga al DNA.
La soluzione madre si prepara al 5% in acqua distillata ed ha consistenza molto densa.
.
Terminato il tempo spengere l'apparato, porre il gel su di un transilluminatore
a raggi UV e documentare il risultato con una fotografia.