A2 - Trasformazione batterica - purificazione GFP

A2 – Trasformazione batterica, purificazione GFP e DNA Fingerprinting
Trasformazione batterica
Difficoltà
Obiettivi didattici
Inserire in una cellula batterica di Escherichia coli una molecola di DNA circolare
(plasmide) recante geni che verranno espressi dal batterio.
Prerequisiti
Cellula batterica, plasmidi, enzimi di restrizione, operone, struttura e duplicazione del
DNA e sintesi proteica.
Descrizione
La trasformazione batterica è una tecnica di biologia molecolare, largamente utilizzata
nei laboratori, messa a punto per facilitare l'introduzione di plasmidi nei batteri. La
trasformazione si ottiene modificando alcune proprietà chimico-fisiche delle pareti e
delle membrane cellulari con l'impiego di sostanze chimiche (CaCl2), associate a rapidi
sbalzi di temperatura o a scariche elettriche ad alto voltaggio (elettroporazione); ne
deriva così una temporanea permeabilizzazione delle cellule al DNA esogeno. I batteri
contenenti il plasmide esogeno vengono quindi fatti crescere su terreni selettivi con
conseguente formazione di colonie trasformate.
Il plasmide utilizzato per la trasformazione (pGLO) contiene il gene che codifica per la
Green Fluorescent Protein (GFP), isolato dalla medusa tropicale Aequorea Victoria. Le
colonie dei batteri trasformati, se esposte a radiazioni UV, emettono una fluorescenza
verde, prova dell'avvenuta espressione fenotipica della GFP.
Purificazione della Green Fluorescent Protein (GFP)
Difficoltà
Obiettivi didattici
Purificare la Green Fluorescent Protein (GFP) precedentemente estratta da cellule
batteriche trasformate con il plasmide pGLO.
Prerequisiti
Amminoacidi, struttura proteine, comportamento delle sostanze idrofobe e idrofile e
interazioni intermolecolari.
Descrizione
L'esperienza prevede la purificazione della proteina GFP prodotta all’interno di
Escherichia Coli dal resto delle proteine del batterio. A tale scopo l’estratto batterico
totale verrà purificato mediante cromatografia ad interazione idrofobica.
Il risultato dell'esperimento viene verificato mediante l'osservazione alla lampada UV
della soluzione eluita dalla colonna. Le varie frazioni raccolte durante l’eluizione
avranno una diversa fluorescenza dovuta ad una diversa concentrazione della proteina
GFP.
DNA fingerprinting
Difficoltà
Obiettivi didattici
Confrontare le dimensioni dei frammenti di DNA generati dalla digestione enzimatica
di plasmidi diversi, sfruttando le caratteristiche di unicità proprie del genoma degli
organismi (fingerprinting).
Prerequisiti
Struttura del DNA, plasmidi e enzimi di restrizione.
Descrizione
La tecnica del fingerprinting, proprio per la sua peculiarità di consentire il confronto fra
genomi appartenenti ad individui diversi, trova applicazione in un vasto numero di
campi: medico, forense e genetico, solo per citarne alcuni. Questa esperienza,
condotta a scopo didattico, utilizza DNA batterico quale fonte di materiale da
analizzare. La prova riproduce i passaggi chiave dei primi test di fingerprinting eseguiti
nei laboratori di ricerca: digestione con enzimi di restrizione, elettroforesi e
visualizzazione delle bande di DNA. L'osservazione delle bande prodotte dalla
migrazione dei frammenti di DNA durante la corsa elettroforetica, permette di
confrontare e discriminare i diversi profili genetici e comprendere le varie applicazioni
della tecnica in ambito forense, medico ed evoluzionistico.