clonaggio - Scienze in Pratica

C3 - Clonaggio del gene EGFP – Purificazione GFP – DNA Fingerprinting
Destinatari
Classi IV e V
Clonaggio del gene EGFP
Obiettivi didattici
Clonare un gene in un plasmide per ottenere un vettore di clonaggio con cui trasformare un ceppo di
E. coli che consenta l’espressione nel batterio di una proteina verde fluorescente che potrà essere di
seguito purificata.
Prerequisiti
Struttura del DNA, plasmidi, funzione della DNA polimerasi e enzimi di restrizione.
Descrizione
Il gene egfp (enhanced green fluorescent protein) viene isolato dal plasmide pEGFP in cui è contenuto
mediante la tecnica della PCR ed inserito nel vettore (pBluescript SK +), in grado di esprimersi in un
ceppo batterico di E. coli, reso competente alla trasformazione. Sia il gene egfp che il vettore
(pBluescript SK +) vengono tagliati con opportuni enzimi di restrizione, purificati e uniti tra loro
dall’enzima ligasi. Il nuovo costrutto prodotto viene quindi utilizzato per trasformare un ceppo
batterico di E. coli. La prova dell’avvenuto clonaggio si ottiene trasformando un ceppo di E. coli con
il vettore costruito.
Purificazione della Green Fluorescent Protein (GFP)
Obiettivi didattici
Purificare la Green Fluorescent Protein (GFP) precedentemente estratta da cellule batteriche
trasformate con il plasmide pGLO.
Prerequisiti
Amminoacidi, struttura proteine, comportamento delle sostanze idrofobe e idrofile e interazioni
intermolecolari.
Descrizione
L'esperienza prevede la purificazione della proteina GFP prodotta all’interno di Escherichia Coli dal
resto delle proteine del batterio. A tale scopo l’estratto batterico totale verrà purificato mediante
cromatografia ad interazione idrofobica. Il risultato dell'esperimento viene verificato mediante
l'osservazione alla lampada UV della soluzione eluita dalla colonna. Le varie frazioni raccolte durante
l’eluizione avranno una diversa fluorescenza dovuta ad una diversa concentrazione della proteina
GFP.
DNA fingerprinting
Obiettivi didattici
Confrontare le dimensioni dei frammenti di DNA generati dalla digestione enzimatica di plasmidi
diversi, sfruttando le caratteristiche di unicità proprie del genoma degli organismi (fingerprinting).
Prerequisiti
Struttura del DNA, plasmidi e enzimi di restrizione.
Descrizione
La tecnica del fingerprinting, proprio per la sua peculiarità di consentire il confronto fra genomi
appartenenti ad individui diversi, trova applicazione in un vasto numero di campi: medico, forense e
genetico, solo per citarne alcuni. Questa esperienza, condotta a scopo didattico, utilizza DNA
batterico quale fonte di materiale da analizzare. La prova riproduce i passaggi chiave dei primi test
di fingerprinting eseguiti nei laboratori di ricerca: digestione con enzimi di restrizione, elettroforesi e
visualizzazione delle bande di DNA. L'osservazione delle bande prodotte dalla migrazione dei
frammenti di DNA durante la corsa elettroforetica, permette di confrontare e discriminare i diversi
profili genetici e comprendere le varie applicazioni della tecnica in ambito forense, medico ed
evoluzionistico..