DNA fingerprinting - Scienze in Pratica

A2F1en – Trasformazione batterica, purificazione GFP e DNA Fingerprinting
Destinatari
Classi III, IV e V
Trasformazione batterica (italiano)
Obiettivi didattici
Inserire in una cellula batterica di Escherichia coli una molecola di DNA circolare (plasmide) recante
geni che verranno espressi dal batterio.
Prerequisiti
Cellula batterica, plasmidi, enzimi di restrizione, operone, struttura e duplicazione del DNA e sintesi
proteica.
Descrizione
La trasformazione batterica è una tecnica di biologia molecolare, largamente utilizzata nei
laboratori, messa a punto per facilitare l'introduzione di plasmidi nei batteri. La trasformazione si
ottiene modificando alcune proprietà chimico-fisiche delle pareti e delle membrane cellulari con
l'impiego di sostanze chimiche (CaCl2), associate a rapidi sbalzi di temperatura o a scariche elettriche
ad alto voltaggio (elettroporazione); ne deriva così una temporanea permeabilizzazione delle cellule
al DNA esogeno. I batteri contenenti il plasmide esogeno vengono quindi fatti crescere su terreni
selettivi con conseguente formazione di colonie trasformate.
Il plasmide utilizzato per la trasformazione (pGLO) contiene il gene che codifica per la Green
Fluorescent Protein (GFP), isolato dalla medusa tropicale Aequorea Victoria. Le colonie dei batteri
trasformati, se esposte a radiazioni UV, emettono una fluorescenza verde, prova dell'avvenuta
espressione fenotipica della GFP.
Purificazione della Green Fluorescent Protein (italiano)
Obiettivi didattici
Purificare la Green Fluorescent Protein (GFP) precedentemente estratta da cellule batteriche
trasformate con il plasmide pGLO.
Prerequisiti
Amminoacidi, struttura proteine, comportamento delle sostanze idrofobe e idrofile e interazioni
intermolecolari.
Descrizione
L'esperienza prevede la purificazione della proteina GFP prodotta all’interno di Escherichia Coli dal
resto delle proteine del batterio. A tale scopo l’estratto batterico totale verrà purificato mediante
cromatografia ad interazione idrofobica.
Il risultato dell'esperimento viene verificato mediante l'osservazione alla lampada UV della
soluzione eluita dalla colonna. Le varie frazioni raccolte durante l’eluizione avranno una diversa
fluorescenza dovuta ad una diversa concentrazione della proteina GFP.
DNA fingerprinting (english)
Learning objectives
Compare four DNA fingerprints generated by the cut of a restriction enzyme.
Pre-Req Knowledge
DNA structure, plasmids and restriction enzymes
Description
DNA evidence assists in missing persons, mass disaster, criminal and paternity cases. It can be used
to identify a perpetrator or exonerate the innocent.
Students will use plasmids engineered to mimic the natural variations in DNA that exist between
one human being and another. The activity reproduces the key steps of the first DNA
fingerprinting technique used by scientists: digestion with restriction enzymes followed by gel
electrophoresis to visualize the DNA.
Restriction enzymes are a special class of enzymes that can cut the DNA into fragments at specific
locations called restriction sites.
If two or more DNA samples have the same restriction sites, then they will be broken into similar
fragments. DNA fragments are separated by size via electrophoresis in agarose gels. During
electrophoresis, DNAs which are negatively charged migrate toward the positive electrode. As DNA
fragments move, their migration rate is slowed by the matrix of the agarose gel. Smaller DNA
fragments move more rapidly through the pores of the gel matrix than larger DNA fragments. The
result is a separation of the DNA fragments according to size, with the smallest DNA fragments
moving the greatest distance away from the origin.
Students will also prepare the agarose gels by dissolving the agarose powder in an appropriate
buffer, such as TBE, to be used in electrophoresis. The agarose is dispersed in the buffer before
heating it to near-boiling point. The melted agarose is allowed to cool sufficiently before pouring
the solution into a cast. A comb is placed in the cast to create wells for loading sample.
The activity will be done according to CLIL methodology and upon request supplemental education
materials are available for the teachers.
The staff have a good level of English but are not native speakers.