A2 – Trasformazione batterica, purificazione GFP e DNA Fingerprinting Destinatari Classi III, IV e V Trasformazione batterica Obiettivi didattici Inserire in una cellula batterica di Escherichia coli una molecola di DNA circolare (plasmide) recante geni che verranno espressi dal batterio. Prerequisiti Cellula batterica, plasmidi, enzimi di restrizione, operone, struttura e duplicazione del DNA e sintesi proteica. Descrizione La trasformazione batterica è una tecnica di biologia molecolare, largamente utilizzata nei laboratori, messa a punto per facilitare l'introduzione di plasmidi nei batteri. La trasformazione si ottiene modificando alcune proprietà chimico-fisiche delle pareti e delle membrane cellulari con l'impiego di sostanze chimiche (CaCl2), associate a rapidi sbalzi di temperatura o a scariche elettriche ad alto voltaggio (elettroporazione); ne deriva così una temporanea permeabilizzazione delle cellule al DNA esogeno. I batteri contenenti il plasmide esogeno vengono quindi fatti crescere su terreni selettivi con conseguente formazione di colonie trasformate. Il plasmide utilizzato per la trasformazione (pGLO) contiene il gene che codifica per la Green Fluorescent Protein (GFP), isolato dalla medusa tropicale Aequorea Victoria. Le colonie dei batteri trasformati, se esposte a radiazioni UV, emettono una fluorescenza verde, prova dell'avvenuta espressione fenotipica della GFP. Purificazione della Green Fluorescent Protein (GFP) Obiettivi didattici Purificare la Green Fluorescent Protein (GFP) precedentemente estratta da cellule batteriche trasformate con il plasmide pGLO. Prerequisiti Amminoacidi, struttura proteine, comportamento delle sostanze idrofobe e idrofile e interazioni intermolecolari. Descrizione L'esperienza prevede la purificazione della proteina GFP prodotta all’interno di Escherichia Coli dal resto delle proteine del batterio. A tale scopo l’estratto batterico totale verrà purificato mediante cromatografia ad interazione idrofobica. Il risultato dell'esperimento viene verificato mediante l'osservazione alla lampada UV della soluzione eluita dalla colonna. Le varie frazioni raccolte durante l’eluizione avranno una diversa fluorescenza dovuta ad una diversa concentrazione della proteina GFP. DNA fingerprinting Obiettivi didattici Confrontare le dimensioni dei frammenti di DNA generati dalla digestione enzimatica di plasmidi diversi, sfruttando le caratteristiche di unicità proprie del genoma degli organismi (fingerprinting). Prerequisiti Struttura del DNA, plasmidi e enzimi di restrizione. Descrizione La tecnica del fingerprinting, proprio per la sua peculiarità di consentire il confronto fra genomi appartenenti ad individui diversi, trova applicazione in un vasto numero di campi: medico, forense e genetico, solo per citarne alcuni. Questa esperienza, condotta a scopo didattico, utilizza DNA batterico quale fonte di materiale da analizzare. La prova riproduce i passaggi chiave dei primi test di fingerprinting eseguiti nei laboratori di ricerca: digestione con enzimi di restrizione, elettroforesi e visualizzazione delle bande di DNA. L'osservazione delle bande prodotte dalla migrazione dei frammenti di DNA durante la corsa elettroforetica, permette di confrontare e discriminare i diversi profili genetici e comprendere le varie applicazioni della tecnica in ambito forense, medico ed evoluzionistico.