Trasformazione batterica – Purificazione GFP

A2 – Trasformazione batterica, purificazione GFP e DNA Fingerprinting
Destinatari
Classi III, IV e V
Trasformazione batterica
Obiettivi didattici
Inserire in una cellula batterica di Escherichia coli una molecola di DNA circolare (plasmide) recante
geni che verranno espressi dal batterio.
Prerequisiti
Cellula batterica, plasmidi, enzimi di restrizione, operone, struttura e duplicazione del DNA e sintesi
proteica.
Descrizione
La trasformazione batterica è una tecnica di biologia molecolare, largamente utilizzata nei laboratori,
messa a punto per facilitare l'introduzione di plasmidi nei batteri. La trasformazione si ottiene
modificando alcune proprietà chimico-fisiche delle pareti e delle membrane cellulari con l'impiego
di sostanze chimiche (CaCl2), associate a rapidi sbalzi di temperatura o a scariche elettriche ad alto
voltaggio (elettroporazione); ne deriva così una temporanea permeabilizzazione delle cellule al DNA
esogeno. I batteri contenenti il plasmide esogeno vengono quindi fatti crescere su terreni selettivi con
conseguente formazione di colonie trasformate. Il plasmide utilizzato per la trasformazione (pGLO)
contiene il gene che codifica per la Green Fluorescent Protein (GFP), isolato dalla medusa tropicale
Aequorea Victoria. Le colonie dei batteri trasformati, se esposte a radiazioni UV, emettono una
fluorescenza verde, prova dell'avvenuta espressione fenotipica della GFP.
Purificazione della Green Fluorescent Protein (GFP)
Obiettivi didattici
Purificare la Green Fluorescent Protein (GFP) precedentemente estratta da cellule batteriche
trasformate con il plasmide pGLO.
Prerequisiti
Amminoacidi, struttura proteine, comportamento delle sostanze idrofobe e idrofile e interazioni
intermolecolari.
Descrizione
L'esperienza prevede la purificazione della proteina GFP prodotta all’interno di Escherichia Coli dal
resto delle proteine del batterio. A tale scopo l’estratto batterico totale verrà purificato mediante
cromatografia ad interazione idrofobica. Il risultato dell'esperimento viene verificato mediante
l'osservazione alla lampada UV della soluzione eluita dalla colonna. Le varie frazioni raccolte durante
l’eluizione avranno una diversa fluorescenza dovuta ad una diversa concentrazione della proteina
GFP.
DNA fingerprinting
Obiettivi didattici
Confrontare le dimensioni dei frammenti di DNA generati dalla digestione enzimatica di plasmidi
diversi, sfruttando le caratteristiche di unicità proprie del genoma degli organismi (fingerprinting).
Prerequisiti
Struttura del DNA, plasmidi e enzimi di restrizione.
Descrizione
La tecnica del fingerprinting, proprio per la sua peculiarità di consentire il confronto fra genomi
appartenenti ad individui diversi, trova applicazione in un vasto numero di campi: medico, forense e
genetico, solo per citarne alcuni. Questa esperienza, condotta a scopo didattico, utilizza DNA
batterico quale fonte di materiale da analizzare. La prova riproduce i passaggi chiave dei primi test
di fingerprinting eseguiti nei laboratori di ricerca: digestione con enzimi di restrizione, elettroforesi e
visualizzazione delle bande di DNA. L'osservazione delle bande prodotte dalla migrazione dei
frammenti di DNA durante la corsa elettroforetica, permette di confrontare e discriminare i diversi
profili genetici e comprendere le varie applicazioni della tecnica in ambito forense, medico ed
evoluzionistico.