Istituto Lombardo
Accademia di Scienze e Lettere
MILANO
Incontro di Studio
Distrofie miotoniche:
malattie genetiche da RNA tossico
28 giugno 2012
Abstracts
Milano, Palazzo di Brera, Via Brera 28
Le distrofie miotoniche (DM) sono malattie neuromuscolari degenerative di origine genetica,
contraddistinte da un quadro clinico ampiamente variabile e da un decorso lentamente progressivo,
il cui esordio può avvenire a qualunque età. Rappresentano la seconda forma di distrofia muscolare
più diffusa, dopo la distrofia muscolare di Duchenne. Le DM sono caratterizzate dal fenomeno della
miotonia, vale a dire da una prolungata contrazione del muscolo scheletrico, dopo breve
stimolazione, e da ritardo nel rilassamento muscolare dopo contrazione volontaria.
Esistono due forme di DM: la più grave (DM1 o malattia di Steiner) dipende dall’espansione della
tripletta nucleotidica (CTG)n nella regione 3’ non tradotta del gene DMPK, mentre la meno grave
DM2 deriva dall’espansione della tetrapletta (CCTG)n nel primo introne del gene ZNF-9.
La patogenesi delle DM è legata all’accumulo, nel nucleo cellulare, di RNA espanso, con sequestro
di fattori proteici necessari alla maturazione degli RNA trascritti e conseguente alterazione della
complessiva funzionalità cellulare.
L’incontro di studio ha lo scopo di illustrare le basi genetiche e cellulari di queste patologie rare, e
di dimostrare come i risultati della ricerca scientifica possano avere importanti ricadute nella
diagnosi e nella terapia.
ore 9.30
Saluto del Presidente dell’Istituto Lombardo Accademia di Scienze e Lettere
Carlo Pellicciari (Università di Pavia)
Introduzione
Denis Furling (UPMC-Université Paris 6, Parigi)
Anormalità dello splicing nelle distrofie miotoniche
Manuela Malatesta (Università di Verona)
Alterazioni nucleari nelle distrofie miotoniche
Giovanni Meola (Università di Milano)
Aspetti clinici e gestionali delle distrofie miotoniche
Considerazioni conclusive
Denis Furling
UPMC-Université Paris 6, Parigi
Anormalità dello splicing nelle distrofie miotoniche
La distrofia miotonica di tipo 1 (DM1) è tra le più comuni forme di distrofia muscolare nell’adulto,
caratterizzata da progressivo deperimento e debolezza muscolare, miotonia, difetti di conduzione a
livello cardiaco, alterate funzioni cognitive e da diversi altri sintomi multisistemici. La DM1 è una
malattia ereditaria autosomica dominante, causata da un’instabile espansione (da ~50 a più di 1,000
ripetizioni) della tripletta nucleotidica CTG nella regione non-codificante all’estremità 3’ del gene
DMPK. L’espressione di RNA per DMPK contenenti l’espansione CUG supporta l’ipotesi di una
effetto tossico dell’RNA per “acquisizione di funzione”, come meccanismo alla base del fenotipo
distrofico. Un meccanismo simile è pure coinvolto nella eziopatologia della distrofia miotonica di
tipo 2 (DM2), che ha aspetti clinici comuni alla DM1 ed è causata dall’espansione della sequenza
CCTG nel primo introne del gene CNP (ZNF9).
In entrambe le distrofie miotoniche, l’accumulo a livello del nucleo cellulare di RNA contenenti le
sequenze CUG/CCUG espanse altera l’attività di fattori proteici (quali MBNL1 e CUG-BP1) che
legano gli RNA nucleari, con conseguente sregolazione dello splicing alternativo di numerosi
trascritti nei tessuti dei pazienti DM ed insorgenza del fenotipo patologico.
Verrà presentata una rassegna delle alterazioni di splicing nelle DM, con particolare riferimento
all’mRNA del gene BIN1, che gioca un ruolo chiave nella formazione delle invaginazioni tubulari
del sarcolemma, alla base della biogenesi di tubuli T (strutture membranose essenziali, nel tessuto
muscolare striato, per il corretto accoppiamento eccitazione/contrazione). Le alterazioni nello
splicing di BIN1 nei pazienti affetti da DM, dovuto ad una perdita di funzione della proteina
MBNL1, hanno come conseguenza l’espressione di un a forma inattiva della proteina BIN1, priva
di attività di legame per i fosfoinositidi e della capacità di formare invaginazioni tubulari della
membrana plasmatica. Introducendo in un modello murino normale un simile difetto di splicing per
BIN1 si ottengono alterazioni dei tubuli T e diminuita forza muscolare: ciò suggerisce che
l’alterazione dello splicing per questo gene possa direttamente determinare l’insorgenza di
debolezza muscolare, una delle caratteristiche più significative delle DM.
Denis Furling
UPMC-Université Paris 6, Parigi
Splicing abnormalities in myotonic dystrophies
Myotonic dystrophy of type 1 (DM1) is one of the most common muscular dystrophy in adults
characterized by progressive muscle wasting and weakness, myotonia, cardiac conduction defects,
alteration in cognitive functions as well as several other multisystemic symptoms. DM1 is an
autosomal dominant inherited disease caused by an unstable CTG expansion ranging from ~50 to
more than 1,000 repeats in the 3’ non-coding region of the DMPK gene. Expression of DMPK
RNAs with expanded CUG repeats supports a toxic RNA gain-of-function as a pathologic
mechanism for DM1. A similar or common mechanism may also be involved in DM type 2 that is
caused by CCTG expansion in the first intron of the CNP (ZNF9) gene and shared similar clinical
features with DM1 disease. In both myotonic dystrophies, nuclear accumulation of pathogenic
CUG/CCUGexp-RNAs alters the activities of the RNA binding proteins such as MBNL1 and CUGBP1 that leads to alternative splicing mis-regulation of a numerous of transcripts in DM tissues and
ultimately, to clinical features of the disease.
An overview of the DM splicing mis-regulation will be presented, with focus on mis-regulation of
the BIN1 mRNA. In muscle, BIN1 plays an important role in tubular invaginations of the plasma
membrane and is required for biogenesis of T-tubules, which are specialized membrane structures
essential for excitation-contraction coupling. BIN1 splicing mis-regulation in DM patients due to
MBNL1 loss-of-function results in the expression of an inactive form of BIN1 deprived of
phosphoinositide-binding and membrane-tubulating activities. Reproducing similar BIN1 missplicing defect in the muscles of wild type mice is sufficient to promote T-tubule alterations and
muscle strength decrease, suggesting that alteration of BIN1 splicing may contributes to muscle
weakness, a prominent feature in DM.
Manuela Malatesta
Università di Verona
Alterazioni nucleari nelle distrofie miotoniche
Nel nucleo cellulare i trascritti primari dei geni subiscono varie modificazioni molecolari per
diventare RNA maturi, pronti per essere esportati nel citoplasma. Questi eventi molecolari sono
ordinati cronologicamente e spazialmente, e avvengono prevalentemente in strutture contenenti
ribonucleoproteine (RNP).
Difetti nella maturazione dell’RNA sono stati associati a patologie che provocano distrofia
muscolare: nelle distrofie miotoniche di tipo 1 (DM1) e di tipo 2 (DM2), le caratteristiche
multisistemiche (ad esempio, miotonia, distrofia muscolare, cardiomiopatia dilatativa, difetti della
conduzione cardiaca, cataratta, insulino-resistenza, anomalie sierologiche specifiche) che
contraddistinguono queste patologie sono causate dall’espansione di due distinte sequenze
nucleotidiche ((CTG)n nel gene DMPK del cromosoma 19q13 nella DM1, e (CCTG)n nel gene
ZNF9 del cromosoma 3q21 nella DM2). Associando tecniche biomolecolari e citochimiche, è stato
dimostrato che i meccanismi di base in entrambe le DM consistono nel sequestro nucleare degli
RNA espansi: i trascritti contenenti CUG e CCUG si accumulano in foci intranucleari
rispettivamente nella DM1 e nella DM2, ed alterano la regolazione e la localizzazione intranucleare
delle proteine CUGBP1 e MBLN1, necessarie per la maturazione fisiologica del pre-RNA
messaggero (mRNA).
Mediante tecniche immunocitochimiche in microscopia ottica ed elettronica, il nostro gruppo ha
dimostrato che, nella DM2, i foci contenenti MBNL1 sequestrano anche snRNPs e hnRNPs, fattori
di splicing coinvolti nelle fasi precoci della maturazione dei trascritti, a supporto dell’ipotesi che il
fenotipo patologico multifattoriale dei pazienti distrofici sia dovuto ad una generale alterazione dei
processi maturativi post-trascrizionali del pre-mRNA. Abbiamo anche dimostrato che, nei muscoli
scheletrici di pazienti affetti da DM1 e DM2, diversi fattori di splicing e di cleavage si accumulano
nei mionuclei, suggerendo disfunzioni nei processi di maturazione del pre-mRNA simili alle
alterazioni nucleari tipiche della sarcopenia (la perdita di massa e funzione muscolare che si
verifica fisiologicamente con l’invecchiamento). Inoltre, in uno studio in vitro, abbiamo osservato
che i mioblasti derivati da cellule satellite di pazienti affetti da DM2 mostrano caratteristiche tipiche
della senescenza e disfunzioni dei processi maturativi del pre-mRNA più precocemente dei
mioblasti di individui sani.
Nel loro insieme, questi dati suggeriscono l’esistenza di meccanismi nucleari comuni alla base delle
alterazioni muscolari in diverse condizioni patologiche.
Manuela Malatesta
Università di Verona
Nuclear alterations in myotonic dystrophies
In the cell nucleus, genes are transcribed, and the primary transcripts undergo molecular processing
which generate mature RNAs to be exported to the cytoplasm. The events leading to the formation
of mature RNAs are chronologically and spatially ordered, and they mostly occur on distinct
ribonucleoprotein (RNP) containing structures.
Defects in the RNA maturation pathways have been related to diseases leading to muscle dystrophy:
in myotonic dystrophy type 1 (DM1) and type 2 (DM2), the multisystemic features (e.g., myotonia,
muscular dystrophy, dilated cardiomyopathy, cardiac conduction defects, cataracts, insulinresistance, and disease-specific serological abnormalities) which characterize these pathologies are
caused by the expansion of two distinct nucleotide sequences ((CTG)n in the DMPK gene on
chromosome 19q13 in DM1, and (CCTG)n in the ZNF9 gene on chromosome 3q21 in DM2).
Combining biomolecular and cytochemical techniques, it has been demonstrated that the basic
mechanisms of both DMs reside in the nuclear sequestration of the expanded RNAs: CUG- and
CCUG-containing transcripts accumulate in intranuclear foci in DM1 and DM2 cells respectively,
and alter the regulation and intranuclear localization of the RNA-binding proteins CUGBP1 and
MBLN, which are necessary for the physiological processing of pre-messenger(m)RNA.
Using immunocytochemical techniques at light and electron microscopy, we have demonstrated that
MBNL1-containing foci in DM2 cells also sequester snRNPs and hnRNPs, splicing factors
involved in the early phases of transcript processing; this strengthens the hypothesis that the
multifactorial phenotype of dystrophic patients could be due to a general alteration of the premRNA post-transcriptional pathway. Interestingly, we also demonstrated that, in skeletal muscles of
DM1 and DM2 patients, splicing and cleavage factors accumulate in myonuclei, suggesting an
impairment of pre-mRNA processing reminiscent of the nuclear alterations typical of sarcopenia
(i.e. the loss of muscle mass and function physiologically occurring during ageing). Moreover, in an
in vitro study, we observed that satellite-cell-derived DM2 myoblasts show cell senescence
alterations and impairment of the pre-mRNA maturation pathways earlier than the myoblasts from
healthy patient.
These results suggest possible common cellular mechanisms responsible for skeletal muscle
wasting in different pathological conditions.
Giovanni Meola
Università degli Studi di Milano
Aspetti clinici e gestionali delle distrofie miotoniche
La distrofia miotonica (DM) è la più comune forma di distrofia muscolare dell'adulto ad ereditarietà
autosomica dominante caratterizzata da miopatia progressiva, miotonia e da un coinvolgimento
multisistemico. A ora sono state identificate due forme distinte di DM causate da mutazioni simili.
La distrofia miotonica di tipo 1 (DM1, malattia di Steinert) è stata descritta più di 100 anni fa ed è
causata dall’espansione della tripletta (CTG)n nel gene DMPK, mentre la distrofia miotonica di tipo
2 (DM2) è stata identificata solo 18 anni fa ed è causata dall’espansione (CCTG)n nel gene
ZNF9/CNBP. I trascritti mutanti contenenti le espansioni CUG o CCUG, si aggregano sottoforma di
foci nei nuclei delle cellule dove sequestrano proteine RNA-binding con conseguente alterazione
dello splicing alternativo (spliceopatia) di geni effettori a valle. Nonostante le somiglianze cliniche
e genetiche, la DM1 e la DM2 sono disordini ben distinti che richiedono differenti strategie
diagnostiche e di gestione. La DM1 può presentare quattro forme clinicamente diverse: la forma
congenita, la forma infantile, la forma a esordio adulto e quella ad insorgenza tardiva
oligosintomatica. La DM1 congenita è la forma più grave di DM caratterizzata da estrema
debolezza muscolare e ritardo mentale. Nella DM2 il fenotipo clinico è molto variabile e non ci
sono sottogruppi clinici distinti. Forme congenite e a esordio infantile non sono state descritte nella
DM2 e, contrariamente alla DM1, la miotonia può essere assente anche all’esame elettromiografico.
A causa della mancanza di conoscenza della malattia tra i medici, la DM2 rimane ampiamente
sottodiagnosticata. Il ritardo nel ricevere la diagnosi corretta dopo l'insorgenza dei primi sintomi è
molto lungo nelle DM: in media più di 5 anni per la DM1 e più di 14 anni per i pazienti con DM2.
Il lungo ritardo nella diagnosi delle DM causa nei pazienti problemi nella gestione delle loro vite e
angosce a causa dell’'incertezza della prognosi e del trattamento terapeutico.
Giovanni Meola
Università degli Studi di Milano
Clinical aspects and management of myotonic dystrophies
Myotonic dystrophy (DM) is the most common adult muscular dystrophy, characterized by
autosomal dominant progressive myopathy, myotonia and multiorgan involvement. To date two
distinct forms caused by similar mutations have been identified. Myotonic dystrophy type 1 (DM1,
Steinert’s disease) was described more than 100 years ago and is caused by a (CTG)n expansion in
DMPK, while myotonic dystrophy type 2 (DM2) was identified only 18 years ago and is caused by
a (CCTG)n expansion in ZNF9/CNBP. When transcribed into CUG/CCUG-containing RNA, mutant
transcripts aggregate as nuclear foci that sequester RNA-binding proteins, resulting in spliceopathy
of downstream effector genes. Despite clinical and genetic similarities, DM1 and DM2 are distinct
disorders requiring different diagnostic and management strategies. DM1 may present in four
different forms: congenital, early childhood, adult onset and late-onset oligosymptomatic DM1.
Congenital DM1 is the most severe form of DM characterized by extreme muscle weakness and
mental retardation. In DM2 the clinical phenotype is extremely variable and there are no distinct
clinical subgroups. Congenital and childhood-onset forms are not present in DM2 and, in contrast to
DM1, myotonia may be absent even on electromyography. Due to the lack of awareness of the
disease among clinicians, DM2 remains largely underdiagnosed. The delay in receiving the correct
diagnosis after onset of first symptoms is very long in DM: on average more than 5 years for DM1
and more than 14 years for DM2 patients. The long delay in the diagnosis of DM causes
unnecessary problems for the patients to manage their lives and anguish with uncertainty of
prognosis and treatment.
