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Analisi
genetico-molecolare
della distrofia
miotonica
Società Italiana
di Genetica Medica
Revisione del gruppo di lavoro: dicembre 2004
Data di aggiornamento: 24 ottobre 2005
AUTORI
Massimo Gennarelli, Università di Brescia
e Ospedale Fatebenfratelli IRCCS, Brescia
Giuseppe Novelli, Università di Roma
Tor Vergata, Policlinico di Tor Vergata
Annalisa Botta, Università di Roma
Tor Vergata, Policlinico di Tor Vergata
Leila Baghernajad Salehi, Università di Roma
Tor Vergata, Policlinico di Tor Vergata
Emanuela Bonifazi, Università di Roma
Tor Vergata, Policlinico di Tor Vergata
Laura Vallo, Università di Roma
Tor Vergata, Policlinico di Tor Vergata
Cecilia Garré, Università di Genova
Redazione
Laura Perrotta, Zadig, Milano
Impaginazione
Giovanna Smiriglia
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Analisi genetico-molecolare della distrofia miotonica
Indice
Riassunto
Test postnatale per DM1 e DM2
Analisi molecolare
Indicazione all’indagine
Test prenatale per DM1
Analisi molecolare
Indicazione all’indagine
Pag.
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La malattia: mutazioni e fenotipo
Diagnosi
Genetica
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Analisi genetico-molecolare della malattia di Steinert,
Dystrophia myotonica 1 (DM1)
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Analisi genetico-molecolare della miopatia miotonica prossimale
o Promm, sindrome di Ricker (DM2)
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Indicazioni per i test
Indicazioni per l’analisi molecolare della DM1
Test di conferma nei pazienti sintomatici
Test presintomatico in soggetti asintomatici
Test sui minori
Test prenatale
Indicazioni per l’analisi molecolare della DM2
Test di conferma nei pazienti sintomatici DM1 negativi
Test preclinico in soggetti asintomatici
Diagnosi differenziale
Riservatezza
Informazioni al paziente
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Bibliografia essenziale
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Indice
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Analisi genetico-molecolare della distrofia miotonica
Riassunto
Test postnatale per DM1 e DM2
Analisi molecolare
E’ consigliato il protocollo diagnostico basato sulla long PCR (reazione polimerasica
a catena lunga) che permette di quantificare l’entità dell’espansione al locus DM1 in
tutti i casi (anche nelle forme congenite) e dell’espansione al locus DM2 in circa il
70% dei casi. La metodica permette di rilevare sempre la presenza di espansioni CTG
e CCTG con un’accuratezza del 100%.
Indicazione all’indagine
Test di conferma della diagnosi clinica nei pazienti con quadro clinico compatibile
con DM1 o DM2, DM1 negativi: la predizione prognostica in base alla grandezza
dell’espansione è sconsigliata per l’assenza di una correlazione tra genotipo e fenotipo, in particolare nella DM2.
Test presintomatico in soggetti asintomatici e consanguinei di pazienti DM, a scopo
clinico e predittivo per identificare la provenienza della mutazione nella famiglia e
per modificare il rischio a priori di avere ereditato la mutazione DM: si raccomanda
la consulenza genetica a conclusione dell’indagine molecolare poiché quest’ultima non
può dare informazioni sull’età di insorgenza, né sul tipo di sintomi e sulla loro progressione.
Test prenatale per DM1
Analisi molecolare
E’ consigliato il protocollo diagnostico per l’analisi postnatale integrato con lo stu-
dio di segregazione del polimorfismo intragenico Alu. In termini predittivi, è possibile escludere le forme cliniche più gravi solo per espansioni inferiori a 150 CTG.
Indicazione all’indagine
Qualora uno dei genitori abbia un rischio del 50% di essere portatore della malattia
va sottoposto al test genetico e solo in seguito si procede all’analisi prenatale, se si
ritiene necessaria.
Riassunto
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Analisi genetico-molecolare della distrofia miotonica
La malattia: mutazioni e fenotipo
La distrofia miotonica (DM) è la malattia muscolare più comune dell’adulto (circa
1/8.000 individui) è caratterizzata da espressività variabile e si presenta in forme congenite, forme con esordio in età infantile o, più spesso, forme con esordio in età adulta.
La sintomatologia clinica comprende, in diversa associazione, miotonia, distrofia, aritmie cardiache, cataratta, calvizie, ipogonadismo, alterazioni della tiroide e intolleranza
al glucosio.
Diagnosi
La diagnosi è prioritariamente clinica e strumentale. L’elettromiografia rileva scariche
miotoniche caratteristiche e l’analisi dell’occhio mediante lampada a fessura rileva le
peculiari opacità nel cristallino. Alla biopsia muscolare non ci sono alterazioni istologiche peculiari, anche se a volte si osserva la centralizzazione dei nuclei nelle fibrocellule muscolari.
Genetica
Al momento sono conosciuti due geni-malattia che mutati sono responsabili del fenotipo: il gene DMPK e il gene ZNF9, rispettivamente associati alla DM1 e alla DM2. La
mutazione DM1 (OMIM n. 160900) coinvolge la tripletta nucleotidica CTG normalmente presente nella regione non tradotta all’estremità 3’ del gene DMPK (DM proteina chinasi) localizzato sul braccio lungo del cromosoma 19 (19q13.3) ed è presente nel
98% circa dei pazienti. La DM2 (OMIM n. 602668) coinvolge la sequenza ripetuta
CCTG contenuta nell’introne 1 del gene ZNF9 (zinc finger protein 9). Un terzo locus è
stato identificato sul cromosoma 16 in alcune famiglie negative alle mutazioni DM1 e
DM2, mentre un altro locus, originariamente mappato sul cromosoma 15 da uno studio
di una sola famiglia nella quale i soggetti affetti manifestano oltre alla sintomatologia tipica anche una demenza frontotemporale, si è rivelato infondato e pertanto non esiste.1,2
Il numero di ripetizioni CTG nel locus DM1 è molto variabile nella popolazione. Gli
individui sani hanno alleli contenenti da 5 a 35 ripetizioni e in questo intervallo gli alleli sono stabili e non vanno incontro ad amplificazione.
Gli alleli con un numero di ripetizioni compreso fra 36 e 49 devono essere considerati
come alleli premutati potenzialmente instabili.
Quando la tripletta supera le 50 ripetizioni gli alleli diventano instabili e si ha l’espressione della patologia: i pazienti con fenotipo lieve hanno alleli con 50-150 duplicazioni di CTG, i pazienti con la forma classica della malattia hanno alleli con 150-1.000
copie e nei pazienti con la forma grave (congenita) la tripletta può essere ripetuta più di
2.000 volte.
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La malattia: mutazioni e fenotipo
Analisi genetico-molecolare della distrofia miotonica
In generale, più è grave la malattia e maggiore è l’espansione CTG; inoltre c’è una correlazione significativa fra l’età d’insorgenza della malattia e l’aumento delle ripetizioni.
Questa evidenza spiega le basi molecolari della cosiddetta anticipazione della DM nelle
generazioni successive, cioè l’aumento della gravità clinica associato alla più precoce età
di insorgenza. Il livello d’instabilità intergenerazionale dovuto al numero delle triplette
dipende anche dal sesso del genitore affetto: l’incremento è maggiore quando la trasmissione è materna piuttosto che paterna. Questo spiega la predominante trasmissione materna delle forme congenite, che sono le più gravi dal punto di vista clinico.
Per quanto riguarda la DM23 è stato osservato che l’ampiezza dell’espansione CCTG
nel gene ZNF9 nei figli affetti è generalmente inferiore a quella presente nei genitori, tuttavia il notevole mosaicismo somatico (presenza di espansioni diverse nei diversi tessuti) rende difficile la conferma di questo risultato. Non è stata invece osservata
alcuna correlazione significativa fra l’età di esordio della DM2 e l’ampiezza dell’espansione CCTG.
La proteina ZNF9, che contiene 7 domini zinc finger, si ritiene leghi l’RNA. Viene
espressa in molti tessuti e i livelli di espressione più alti si trovano nel cuore e nel
muscolo scheletrico, che sono i tessuti prevalentemente coinvolti nella DM2. Il trascritto mutante del gene ZNF9 si accumula in foci nucleari in maniera del tutto simile a quello che si osserva per il trascritto mutato del gene DMPK nella DM1. Questa
osservazione avvalora l’ipotesi corrente di un ruolo patogenetico dell’RNA espanso che
sequestrerebbe le proteine che legano la ripetizione CUG/CCUG, necessarie per il processamento nucleare dell’RNA, sottraendole ad altri trascritti e inibendo così importanti funzioni cellulari.
La malattia: mutazioni e fenotipo
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Analisi genetico-molecolare della distrofia miotonica
Analisi genetico-molecolare
della malattia di Steinert,
Dystrophia myotonica 1 (DM1)
L’analisi diretta dell’espansione della ripetizione CTG mediante la combinazione delle
tecniche della PCR e del Southern blot permette un’accurata caratterizzazione di tutte
le mutazioni DM1.
Il Southern blot condotto su DNA genomico trattato con un enzima di restrizione (come
EcoRI, BamHI, NcoI, o BgII) è la procedura di base per l’analisi dei frammenti contenenti da 100 a oltre 2.000 duplicazioni di CTG. Fra le numerose sonde per l’ibridazione disponibili presso i laboratori di ricerca ci sono cDNA25, pGB2.6, p5B1.4 e pMDY1.
Ma il Southern blot non permette di distinguere gli alleli con piccole espansioni: in questo caso l’approccio migliore è l’analisi mediante PCR. Alleli con un numero di ripetizioni compreso fra 5 e 200 possono essere facilmente identificati con la PCR, che prevede l’utilizzo come primer di oligonucleotidi sintetici complementari alle regioni vicine alla sequenza ripetuta.
Un ulteriore approccio diagnostico molecolare è rappresentato dalla long PCR che consente di amplificare frammenti contenenti da 5 a 3.700 copie di CTG, che includono
quindi tutti gli alleli normali e mutati.4 Questa tecnica prevede una reazione polimerasica a catena seguita da due fasi, una per la caratterizzazione degli alleli normali o di quelli con piccole espansioni e un’altra per l’identificazione delle espansioni più grandi. Nella prima fase il prodotto di PCR viene sottoposto a elettroforesi capillare per mezzo di
un sequenziatore automatico. Qualora vengano individuati due alleli distinti di dimensioni normali, il soggetto analizzato è da considerare sano. Se è visibile invece un solo
segnale, il campione può essere un omozigote sano oppure un portatore di un allele espanso e uno normale. In questo caso il prodotto della PCR passa alla seconda fase di analisi in cui viene caricato su un gel di agarosio, trasferito su filtro di nylon e ibridato con
una oligo-sonda [CTG]5.
Le tecniche di PCR e di Southern blot per l’analisi diretta delle mutazioni/espansioni
DM richiedono una competenza specifica e devono essere condotte in laboratori che
rispondano a rigorosi criteri di accuratezza.
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Analisi genetico-molecolare della malattia di Steinert, Dystrophia myotonica 1 (DM1)
Analisi genetico-molecolare della distrofia miotonica
Analisi genetico-molecolare
della miopatia miotonica prossimale
o Promm, sindrome di Ricker (DM2)
L’espansione della sequenza CCTG del locus DM2 viene analizzata mediante long PCR
alla quale è necessario affiancare il Southern blot secondo il protocollo descritto in Liquori et al.2 La procedura consente l’analisi di frammenti contenenti un numero di ripetizioni CCTG compreso tra 75 e 1.100 ma, a causa della elevatissima instabilità ed eterogeneità somatica, la tecnica fallisce nell’evidenziare la mutazione nel 20% dei pazienti DM2.3 Per questa ragione sono stati sviluppati metodi diagnostici alternativi che, pur
essendo incapaci di caratterizzare le espansioni più grandi, riescono però a individuarne
sempre la presenza. La metodica della long PCR descritta nel paragrafo precedente ha
una sensibilità del 100% per le espansioni comprese tra 5 e 3.700 ripetizioni.
La recente caratterizzazione5 di un polimorfismo localizzato nel primo introne del gene
ZNF9 fornisce uno strumento in più nell’analisi genetico-molecolare della DM2. Questo polimorfismo consiste in una sostituzione nucleotidica C/A che crea o distrugge un
sito di restrizione ApaI. Tale polimorfismo è risultato essere in linkage disequilibrium con
la mutazione DM2.
Le tecniche di PCR e/o Southern blot per l’analisi diretta delle mutazioni/espansioni DM
richiedono una competenza specifica e devono essere quindi condotte in laboratori che
rispondono a rigorosi criteri di accuratezza.
Recentemente alcuni autori6 hanno proposto l’impiego dell’ibridazione in situ per
visualizzare i trascritti abnormi del gene DM2 in sezioni istologiche di biopsie muscolari. A nostro parere, il test può essere utilizzato in alcuni casi come integrazione degli
altri metodi.
Analisi genetico-molecolare della miopatia miotonica prossimale o Promm, sindrome di Ricker (DM2)
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Analisi genetico-molecolare della distrofia miotonica
Indicazioni per i test
Indicazioni per l’analisi molecolare della DM1
Test di conferma nei pazienti sintomatici
Conferma della diagnosi clinica: il test è la conferma definitiva per il medico che sta
conducendo la diagnosi in un paziente con sintomi clinici tipici.
Definizione di diagnosi clinica incerta: il test genetico è utile nei casi in cui il paziente abbia un quadro clinico compatibile sia con DM sia con altre patologie.
Commenti
Dal momento che la correlazione fra l’ampiezza dell’espansione e la gravità della malattia non è assoluta, non è appropriato fare una predizione della prognosi della malattia
sulla base del numero di triplette risultate dall’analisi molecolare. Poiché i risultati del
test genetico hanno conseguenze dirette anche su altri membri della famiglia del probando, la consulenza genetica deve essere disponibile sia per il probando sia per qualsiasi altro membro della famiglia. Recentemente sono stati descritti casi di pazienti con
mutazione DM1 con un fenotipo associato alla malattia facio-scapolo-omerale (FSH),
in alcuni di questi erano presenti entrambe le mutazioni DM1 e FSH (B. Eymard, comunicazione personale).
Test presintomatico in soggetti asintomatici
Viene condotto per identificare pazienti asintomatici e consanguinei dei pazienti a scopo clinico e predittivo, oppure per conoscere il rischio a priori di avere ereditato la mutazione DM, che viene ridotto a zero in caso di esito negativo.
Commenti
Al momento attuale non è possibile dare informazioni certe sull’età d’insorgenza della
malattia o sul tipo di sintomi e sulla loro progressione. Per questo motivo il test su pazienti asintomatici deve sempre comprendere la consulenza genetica condotta da personale
qualificato ed esperto.
Test sui minori
A meno che non sussistano ragioni mediche pressanti, i minori non dovrebbero essere
sottoposti a test genetico. Questa decisione è volta alla tutela dell’individuo che si sottopone al test, che deve essere in grado di comprendere pienamente le conseguenze del
risultato di tale analisi.
Un’eccezione appropriata viene fatta nel caso in cui il minore presenti i sintomi clinici
della malattia: il test genetico in questo caso viene infatti condotto per avere la conferma diagnostica della presenza della malattia oppure per monitorare adeguatamete eventuali gravidanze successive della coppia.
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Indicazioni per i test
Analisi genetico-molecolare della distrofia miotonica
Test prenatale
In caso di diagnosi certa di distrofia miotonica in uno dei genitori, il test prenatale può
essere usato per stabilire il rischio del feto di aver ereditato l’allele mutato.
Nel caso in cui uno dei genitori abbia un rischio del 50% di essere portatore della malattia si procede in due fasi: prima viene sottoposto al test il genitore a rischio e poi si esegue l’analisi prenatale solo se è ancora necessaria.
Si raccomanda l’esecuzione durante il monitoraggio prenatale anche del test di segregazione del polimorfismo Alu di inserzione/delezione del gene DMPK. Questo polimorfismo è in disequilibrio con la mutazione DM e quindi di grande aiuto diagnostico, specie durante l’accertamento di espansioni di grandi dimensioni non facilmente
analizzabili.
A causa degli intervalli di sovrapposizione delle dimensioni dell’espansione nelle
diverse forme della malattia, dell’incertezza riguardo al mosaicismo somatico e all’instabilità dell’amplificazione delle triplette nella vita fetale non è possibile predire se il
feto svilupperà la forma congenita di DM o quella a esordio più tardivo. E’ possibile
escludere con una buona attendibilità statistica le forme più gravi in presenza di espansioni al di sotto delle 150 CTG. Benché la diagnosi prenatale sia basata sull’analisi
diretta della mutazione, è consigliabile effettuare contestualmente l’analisi molecolare in entrambi i genitori.
Tabella 1. Test genetico per la distrofia miotonica
Tipo di test
Mutazione
analizzata
Accuratezza
del test
Disponibilità
di un kit commerciale
DM1 - Analisi diretta
della mutazione
Espansione
trinucleotidica [CTG]n
100%
No
DM2 - Analisi diretta
della mutazione
Espansione
tetranucleotidica [CCTG]n
80-100%
No
Indicazioni per l’analisi molecolare della DM2
Test di conferma nei pazienti sintomatici DM1 negativi
Il test è la conferma definitiva della diagnosi clinica in un paziente con sintomi clinici
tipici. Il test genetico è utile anche in tutti i casi in cui la diagnosi clinica è incerta e
cioè ogni qual volta il paziente mostri un quadro clinico compatibile sia con DM sia
con altre patologie.
Indicazioni per i test
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Analisi genetico-molecolare della distrofia miotonica
Commenti
Ampiezza dell’espansione, gravità della malattia ed età di esordio della malattia non sono
correlate in modo assoluto e pertanto non è possibile fare una predizione della prognosi della malattia sulla base del numero delle ripetizioni risultate all’analisi molecolare.
I risultati del test genetico hanno senza dubbio ripercussioni su altri membri della famiglia del probando, per questo motivo deve essere sempre disponibile la consulenza genetica sia per il probando sia per qualsiasi altro familiare.
Alcuni autori7 raccomandano di prendere in considerazione il test DM2 in pazienti asintomatici che presentano un incremento della creatin chinasi sierica come sola manifestazione clinica presente.
Recentemente sono stati riportati casi di pazienti con mutazione DM2 e un fenotipo caratteristico della camptocormia. Anche in questi casi si ritiene utile analizzare il gene DM2.
Test preclinico in soggetti asintomatici
Viene condotto per determinare quale dei due genitori abbia l’allele mutato in modo da
identificare altri possibili portatori nel ramo familiare di provenienza del genitore.
Il test preclinico nei soggetti asintomatici viene eseguito allo scopo di conoscere il rischio
a priori di avere ereditato la mutazione DM2.
Commenti
Dal momento che, come detto in precedenza, il dato molecolare non può dare informazioni sull’età di insorgenza o sul tipo di sintomi e sulla loro progressione, il test sui
pazienti asintomatici deve sempre comprendere la consulenza genetica condotta da personale qualificato ed esperto.
Diagnosi differenziale
Talvolta la distrofia miotonica non è clinicamente diagnosticabile soprattutto alla nascita e spesso richiede la necessità di procedere a una diagnosi differenziale per distinguerla da altre patologie come la miosite da corpi inclusi (inclusion body myositis, IBM), la
miopatia ereditaria miofibrillare (hereditary myofibrillar myopathy, MFM), la distrofia
muscolare distale e alcune distrofie dei cingoli.
Inoltre, è opportuno in alcuni casi procedere alla diagnosi differenziale nei confronti di
altre miotonie dovute a difetti dei canali ionici come la miotonia o miotonia congenita
di Thomsen o di Becker, data da mutazioni nel gene CLCN1, la paramiotonia congenita e le sue varianti, data da mutazioni nel gene SCN4A, e la paralisi periodica ipercaliemica data da mutazioni del gene SCN4A.
Occasionalmente sono stati riportati in letteratura casi di diagnosi errate, soprattutto per
la forma congenita di DM1, confusa con l’atrofia muscolare spinale di tipo I (SMA). In
tutte queste situazioni la diagnosi molecolare genetica è non solo opportuna ma anche
necessaria.
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Indicazioni per i test
Analisi genetico-molecolare della distrofia miotonica
Riservatezza
Mantenere la riservatezza riguardo ai risultati delle analisi molecolari dei soggetti che si
sottopongono al test è una responsabilità etica e legale del laboratorio di analisi e di chi
esegue il test. La riservatezza è molto importante per prevenire la discriminazione nei
riguardi dei soggetti sottoposti alla valutazione.
Informazioni al paziente
Il paziente deve essere informato riguardo al test genetico e deve essere messo a conoscenza di tutte le caratteristiche della malattia e della sua variabilità fenotipica, soprattutto nel caso del test presintomatico. Deve conoscere le modalità di esecuzione dell’analisi e deve essere consapevole delle conseguenze che il risultato del test può avere sulla sua persona e sui suoi familiari. Deve, inoltre, essere messo a conoscenza di tutti i supporti di natura medica, genetica, psicologica ed etica messi a sua disposizione dalla struttura di riferimento durante e dopo la fase diagnostica. Prima di iniziare qualsiasi genere di indagine, il paziente deve fornire il consenso informato che va sempre formalizzato in forma scritta.
Dal momento che i campioni di DNA utilizzati a scopo di ricerca e per la diagnosi appartengono all’individuo da cui sono stati ottenuti, si raccomanda che ogni laboratorio elabori un modulo per il consenso informato in cui si richiedano anche le indicazioni per
la conservazione del campione di DNA dopo l’esecuzione del test. Le indicazioni richieste riguardano:
il permesso di conservare il DNA dopo l’esecuzione del test;
il permesso di utilizzare il DNA per futuri test a scopo diagnostico senza bisogno di
ulteriore consenso;
la possibilità di utilizzare il campione di DNA per scopi di ricerca.
Indicazioni per i test
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Analisi genetico-molecolare della distrofia miotonica
Bibliografia essenziale
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Bibliografia essenziale
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Finito di stampare nel mese di novembre 2005 presso Geca - Cesano Boscone, Milano
