6 sequenziamento proteine

La struttura covalente delle proteine
(la sequenza amminoacidica)
Sequenza amminoacidica dell’ormone insulina bovino (Frederick Sanger, 1953)
Il primo passo per determinare la sequenza di un peptide è quello
di determinarne la composizione amminoacidica.
Il peptide viene idrolizzato nei suoi costituenti amminoacidici
mediante riscaldamento a 110 oC per 24 h in una soluzione 6 N
HCl.
Gli amminoacidi ottenuti dall’idrolisi possono essere separati
mediante cromatografia a scambio ionico su resina di polistirene
sulfonato (carica negativamente).
L’identità di ciascun amminoacido viene rivelata dal volume di
eluizione (il volume di tampone necessario per rimuovere
l’amminoacido dalla colonna).
Ciascun amminoacido viene
quantizzato
mediante
una
reazione colorimetrica con la
ninidrina.
Ninidrina
Amminoacidi trattati con la ninidrina danno un intenso colore blu. Fa
eccezione la prolina che dà un colore giallo perché contiene un gruppo
amminico secondario
La concentrazione di un amminoacido dopo che è stato riscaldato in presenza
di ninidrina è proporzionale alla assorbanza ottica della soluzione
Con questa tecnica è possibile rivelare 1 microgrammo (10 nmol) di un
amminoacido
Se si utilizza la fluorescamina in luogo della ninidrina è possibile
rivelare anche un solo nanogrammo (10 pmol) di un
amminoacido.
La fluorescamina reagisce con il gruppo α-aminico e da origina
ad un prodotto altamente fluorescente.
Il passo successivo è spesso quello di identificare il residuo
ammino-terminale
Fluorodinitrobenzene
Dabsil cloruro
Dansil cloruro
Per identificare il residuo amminoterminale quest’ultimo viene marcato con un
composto che forma con esso un legame covalente stabile.
Per marcare i residuo ammino-terminale Sanger utilizzò l’1-fluoro-2,4dinitrobenzene (FDNB). Oggi si usano i reagenti dansil cloruro e dabsil cloruro,
i cui derivati fluorescenti possono essere identificati più facilmente dei
dinitrofenil derivati
Dopo aver marcato il residuo ammino-terminale il polipeptide viene
idrolizzato e sono identificati gli amminoacidi marcati
Poiché l’idrolisi distrugge il polipeptide, questa metodica può essere utilizzata
solo una volta e non può essere utilizzata per identificare i residui che si
trovano dopo quello N-terminale.
La degradazione di Edman
Il peptide viene fatto reagire con il fenilisotiocianato, che si lega al residuo Nterminale
Il residuo amminoterminale viene quindi staccato come derivato ciclico
mediante idrolisi acida blanda che lascia il peptide intatto ed accorciato di un
residuo
Dopo la rimozione e l’identificazione del residuo ammino-terminale, viene
esposto un nuovo residuo ammino-terminale e la reazione può essere ripetuta
Sanger
Edman
Separazione mediante HPLC dei derivati
feniltiodantoinici degli amminoacidi
Sequenziatori automatici sono in grado di determinare la
sequenza amminoacidica delle catene polipeptidiche fino a
50 residui
Per essere sequenziate le proteine grandi devono essere
suddivise in segmenti più piccoli
Rottura dei ponti disolfuro di una proteina.
Ditiotreitolo (DTT)
La riduzione dei ponti disolfuro
con DTT, che porta alla
formazione di due residui di
cisteina deve essere seguita da
ulteriori modificazioni dei gruppi
reattivi SH per impedire la nuova
formazione di ponti disolfuro.
L’acetilazione con iodoacetato
soddisfa questa esigenza.
Si possono usare diversi metodi per frammentare una catena
polipeptidica
Localizzazione dei ponti disolfuro
Se nella struttura primaria vi sono ponti disolfuro la tappa
successiva è la determinazione della loro posizione.
Un campione della proteina viene frammentato con un enzima
proteolitico senza rompere i ponti disolfuro.
I peptidi ottenuti con questa frammentazione sono separati per
elettroforesi e confrontati con quelli generati dall’azione della
tripsina sulla proteina da cui i ponti disolfuro erano stati
eliminati.
Nella prima serie mancheranno due peptidi, sostituiti da uno più
grande.
I due peptidi sconparsi rappresentano le regioni della catena
polipeptidica unite dal ponte disolfuro
Elettroforesi diagonale
I peptidi uniti da legami disolfuro possono essere identificati, mediante la tecnica
dell’elettroforesi diagonale
La proteina viene tagliata in diversi peptidi in condizioni in cui i legami
disolfuro rimangono integri. La miscela di peptidi è quindi sottoposta ad
elettroforesi
La sequenza amminoacidica può essere dedotta dalla
sequenza del DNA
Come usare le informazioni derivanti dalle sequenze delle proteine
La sequenza di una determinata proteina può essere paragonata alle sequenze
già note presenti nelle banche dati per vedere se esistono sequenze simili. La
proteina isolata appartiene ad una delle famiglie di proteine conosciute?
Il confronto delle sequenze della stessa proteine in specie differenti dà molte
informazioni sulle vie dell’evoluzione.
Si può ricercare nella sequenza amminoacidica la presenza di domini ripetuti.
Molte proteine contengono sequenze amminoacidiche specifiche che servono da
segnale per la localizzazione cellulare o per il successivo processamento.
I dati della sequenza possono essere utili per preparare anticorpi specifici per
la proteina di interesse.
La sequenza amminoacidica può essere utilizzata per disegnare esche (probe) di
DNA che sono specifici per i geni che codificano la proteina corrispondente.
Motivi ripetuti nella proteina calmodulina.
Ciascun motivo lega uno ione calcio
Sequenza amminoacidica del citocromo c umano
= residui invarianti
= sostituzioni conservative
Albero filogenetico costruito
in base al numero di
differenze
amminoacidiche
nella sequenza del citocromo
c di specie diverse.
E’ sovrapponiblie a quello
ottenuto con la tassonomia
classica.
Il
numero
di
residui
che
differiscono nelle proteine omologhe
da 2 specie diverse è proporzionale
alle differenze filogenetiche esistenti
tra le 2 specie.
Es.:
cavallo-lievito 48 sostituzioni
Anitra-pollo 2 sostituzioni
Per descrivere l’intero patrimonio di proteine codificato dal DNA
di un organismo i ricercatori hanno coniato un nuovo termine,
proteoma.
Il termine proteoma deriva da : proteine espresse dal genoma.
L’analisi del proteoma cellulare sta acquistando sempre più
importanza e fornendo informazioni che si integrano con quelle
ottenute dalla sequenza del DNA