labAndr - Carlo Bulletti

Il LABORATORIO DI ANDROLOGIA PER LE TECNICHE PMA
Parte fondamentale nella decisione del trattamento di fecondazione assistita ha la valutazione del
liquido seminale del partner della coppia.
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CENNI DI FISIOLOGIA DEI GAMETI MASCHILI
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RUOLO DEGLI SPERMATOZOI NELLA FECONDAZIONE DEI MAMMIFERI
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ANALISI DI LABORATORIO
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CENNI DI FISIOLOGIA DEI GAMETI MASCHILI*
La spermatogenesi è un processo di proliferazione e differenziamento di cellule staminali
indifferenziate in spermatozoi, ha luogo nei tubuli seminiferi del testicolo e si divide in tre fasi
sequenziali: proliferazione degli spermatogoni, meiosi e spermiogenesi.
La proliferazione degli spermatogoni consente sia di produrre cellule germinali destinate a
trasformarsi in spermatociti primari, sia di mantenere un pool di cellule staminali.*
Gli spermatogoni sono classificati in tipo A e tipo B. Gli spermatogoni di tipo A dopo divisione
mitotica formano gli spermatogoni di tipo B che per ulteriori divisioni mitotiche daranno origine
agli spermatociti primari che, dopo aver duplicato il loro DNA, entreranno nella prima divisione
mitotica .
E’ interessante notare che la citodieresi delle cellule germinali, ossia la separazione del citoplasma
che ha luogo alla fine della divisione cellulare, è incompleta; tale fenomeno comporta che le cellule
germinali derivate da uno spermatogonio comune rimangono in un sincizio fino a che le cellule
germinali mature sono rilasciate alla spermiazione . questa struttura sinciziale consente alle cellule
germinali di comunicare tra di loro e di coordinare il loro sviluppo in maniera sincrona.
Alla fine della meiosi uno spermatocita primario si è diviso due volte per dar luogo a 4 spermatidi.*
Gli spermatidi che sono a questo stadio cellule rotonde subiscono una serie di modificazioni
graduali, spermiogenesi, che le traformerà in cellule allungate , flagellate, in grado di muoversi
autonomamente.
Man mano che le cellule progrediscono attraverso il processo spermiogenetico , si muovono, spinte
dal fluido tubulare , verso il lume dei tubuli seminiferi dove alla fine vengono rilasciate quando
sono mature.*
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Il processo spermatogenetico nell’uomo , dallo spermatogonio allo spermatozoo maturo , richiede
circa 72 giorni. *
L’intero processo richiede complesse interazioni tra le cellule germinali e le cellule somatiche
presenti all’interno dei tubuli seminiferi , definite cellule del Sertoli. Le cellule del Sertoli
contribuiscono in maniera determinante alla costituzione del microambiente della barriera
ematotesticolare necessario per garantire il corretto sviluppo delle cellule germinali.*
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RUOLO DEGLI SPERMATOZOI NELLA FECONDAZIONE DEI MAMMIFERI
Maturazione epididimaria
Nei mammiferi gli spermatozoi che lasciano il testicolo non hanno la capacità di fecondare
l’ovocita. Acquisiscono questa capacità solo dopo essere passati attraverso l’epididimo.
Questo passaggio modifica dello spermatozoo la membrana plasmatica attraverso : l’adsorbimento
di nuove glicoproteine di superficie , modificazione della carica di membrana, glicosilazioni e
modificazioni dei lipidi di membrana.
La capacitazione
Gli spermatozoi dei mammiferi , maturati nell’epididimo e quindi eiaculati, non sono ancora in
grado di fertilizzare l’ovocita; devono infatti risiedere per un certo tempo nelle vie genitali
femminili per acquisire questa abilità. Queste modificazioni fisiologiche vanno sotto il nome di
capacitazione.
Molto verosimilmente la capacitazione avviene grazie alla rimozione dalla membrana plasmatica
degli spermatozoi di sostanze adsorbite o integrate durante il passaggio attraverso l’epididimo in
modo da rendere la membrana in grado di riconoscere l’ovocita o comunque di reagire con sostanze
secrete da questo.
La capacitazione rende lo spermatozoo in grado di sviluppare una corretta reazione acrosomiale .*
La reazione acrosomiale
L’acrosoma è una struttura circoscritta da membrana che ricopre la sommità dello spermatozoo,
anteriormente al nucleo. Contiene al suo interno molti diversi enzimi idrolitici, quali ialuronidasi e
acrosina.
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La reazione acrosomiale ha almeno due funzioni:
1. Permette la penetrazione attraverso la zona pellucida dell’ ovocita.
2. Permette la fusione alla membrana plasmatica dell’ovocita.
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Fusione spermatozoo-ovocita
Dopo aver superato la zona e lo spazio perivitellino lo spermatozoo giunge a contatto con la
membrana dell’ovocita.
La fusione avviene solo dopo che è avvenuta la reazione acrosomiale.
Eventi che seguono la fusione
Dopo la fusione con lo spermatozoo l’ovocita inizia un processo detto attivazione che comporta
alcune modificazioni morfologiche e biochimiche, di queste quelle più facilmente riconoscibili sono
la esocitosi dei granuli corticali e la ripresa della meiosi.
Viene completata la seconda divisione meiotica arrestata in metafase ed il nucleo dell’ovocita,
divenuto aploide, viene detto pronucleo femminile ; intanto il nucleo dello spermatozoo decondensa
la cromatina e costituisce il pronucleo maschile.
I due pronuclei allora convergono al centro dell’ovocita , le membrane nucleari si disintegrano e i
cromosomi si mescolano per la prima divisione mitotica che segna l’inizio dello sviluppo
embrionario.
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ANALISI DI LABORATORIO
L’ esame standard del liquido seminale è diventato sempre più importante nell’ impostazione di un
corretto screening diagnostico di una coppia infertile.
Nessuno dei parametri rilevabili dallo spermiogramma saggia la reale capacità fertilizante dello
spermatozoo e i criteri della loro normalità sono basati semplicemente su dati statistici ottenuti da
uomini con una storia recente di fertilità.
L’esame comprende sempre prima di qualunque trattamento :
1. Valutazione macroscopica dell’eiaculato (VOLUME, VISCOSITA’,PRESENZA DI
CRISTALLI PROSTATICI e FLUIDIFICAZIONE)
2. Valutazione microscopica dell’eiaculato (CONCENTRAZIONE NEMASPERMICA,
MOTILITA’, PRESENZA DI CELLULE e di ZONE DI AGGLUTINAZIONE,
MORFOLOGIA.)*
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Come si può capire la valutazione macroscopica dell’eiaculato è di facile comprensione .
Il VOLUME si valuta con una pipetta graduata.
La VISCOSITA’ si valuta con una pasteur cercando di far cadere il seme ,nel barattolo di raccolta
, goccia a goccia ; se ciò non si verifica si parla di viscosità aumentata.
I CRISTALLI PROSTATICI sono formazioni gelatinose di varie dimensioni che possono essere
presenti nell'’iaculato , prodotti a livello prostatico non sono prognostici della qualità seminale.
La FLUIDIFICAZIONE deve avvenire in 15 – 30 minuti , se non avviene al microscopio si
osservano una sorta di corsie dense di spermatozoi che non sono così liberi di muoversi nell’intero
vetrino.
Più complessa è la valutazione microscopica che necessita di un occhio molto esperto soprattutto
per quello che riguarda la stima percentuale della motilità e della morfologia.
La MOTILITA’ rappresenta senza dubbio una proprietà fondamentale dello spermatozoo. Il
movimento dello spermatozoo è di tipo flagellare. E’ necessario valutare la qualità della motilità ,
che normalmente deve essere di tipo progressivo e vivace (25-100m/sec). Quando la velocità
media è chiaramente al di sotto di questi valori , ma il movimento è sempre di tipo rettilineo , la
motilità viene definita “lentamente progressiva”. Nei casi in cui la motilità non sia di tipo
progressivo ma sul posto, viene definita “agitatoria in loco” .Va segnalata anche la quantità
percentuale di spermatozoi immobili . La valutazione è soggettiva e dipende dall’esperienza
dell’operatore ed è effettuata al microscopio ottico (M.O.) a vari ingrandimenti (10X;20X;40X).
La MORFOLOGIA è essenziale per una completa valutazione del campione seminale. Ci si avvale
solitamente di vetrini precolorati (ematossilina-eosina) si osservano al M.O. a 100X in immersione
e si valutano 5 classi diverse di spermatozoi : 1) normali; 2) con anomalie della testa, 3) con
anomalie del tratto intermedio; 4) con anomalie della coda; 5) amorfi (anomalie testa + anomalie
coda ).*
Inoltre in un eiaculato normale, accanto a spermatozoi normali e anomali si possono trovare
contemporaneamente cellule germinali a vari stadi maturativi, cellule epiteliali, leucociti, cristalli.*
I criteri di valutazione sono suggeriti dall’ Organizzazione Mondiale di Sanità (WHO) e sono per lo
spematozoo normale:
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testa ovale
3.5m x 2-3 m
area acrosomiale
30% della testa
pezzo intermedio
7-8 m x 1 m
coda
4 -5 m
Il WHO stabilisce i parametri di normalità del liquido seminale, aggiornandoli di anno in anno.
I parametri di normalità fissati nel 1999 sono: *
Volume
2 – 4 ml
Zone di agglutinazione
assenti
Leucociti
< 1.0x106/ml
Fluidificazione
15’ – 1ora
Concentrazione
20x106/ml o più
Viscosità
normale
Morfologia(tipi normali)
> 30 %
Motilità (rapida + debole) > 50 %
La CONCENTRAZIONE nemaspermica si valuta mediante conta precisa del numero di
spermatozoi in Camera di Neuebauer previa diluizione del seme (generalmente 1:20).
I valori normali massimi riportati dal WHO sono 200 – 250 x106sperm./ml ; i minimi sono 20 x
106/ml.
Le ZONE DI AGGLUTINAZIONE appaiono al M.O. come aree in cui gli spermatozoi convergono e
se pur mobili non sono in grado di allontanarsene (sono indice della presenza di anticorpi sulla
superficie degli spermatozoi).
TECNICHE DI PREPARAZIONE DEL SEME PER LA FECONDAZIONE ASSISTITA
I terreni più usati per la selezione nemaspermica sono costituiti da una miscela di sali inorganici, è
presente glucosio o fruttosio e alcuni terreni contengono albumina (importante per l’innesco della
capacitazione).
Le metodiche si propongono di separare gli spermatozoi dal plasma seminale e di ottenere una
sospensione finale concentrata di soli spermatozoi mobili.
Al termine di ogni trattamento è necessario rivalutare tutti i parametri seminali (concentrazione ,
motilità, morfologia ) per giudicare la procedura attuata.
Le tecniche ci consentono effettivamente di selezionare spermatozoi migliori per motilità e
morfologia.
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Le tecniche usate più comunemente in laboratorio sono:
1. METODICHE DI MIGRAZIONE *: si basa sul fatto che lo spermatozoo è dotato di motilità
propria  migra dal proprio liquido ad un altro: si seleziona da solo.
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SWIM UP DA PELLET
E’ stato proposto per avere un recupero maggiore. Si centrifuga il liquido seminale per
concentrare le cellule in un sedimento finale e farle migrare nel terreno di coltura sovrastante. In
genere il liquido seminale viene diluito con pari o doppia quantità di terreno rispetto al liquido
seminale utilizzato (maggiore è la quantità di liquido seminale maggiore è il recupero). Si pone
a incubare per ½ ora circa a 37°C e si recuperano le due frazioni prossimale e distale. Le fasi più
delicate sono la stratificazione sul pellet, che non deve essere risospeso, e il prelievo del pellet.
Gli spermatozoi migliori per motilità e morfologia migrano verso l’alto e sono recuperati nella
porzione superiore del sovranatante.
2. METODICHE DI SEPARAZIONE SU GRADIENTE*
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PERCOLL
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MINIPERCOLL
Il “percoll” è composto da particelle silicee legate al polivinilpirrolidone, è fornito dalle ditte in
soluzione madre che viene diluita con terreno alle percentuali utili all’impiego (gradienti al
95%, 70%, 50%). La tecnica si basa sul concetto che centrifugando cellule diverse in “peso”,
per caratteristiche morfo-fonzionali, su gradienti di densità diversi (95%, 70%,50%) alla fine le
cellule si saranno distribuite in base al loro peso specifico in un determinato gradiente e solo in
quello. Nel nostro caso il gradiente che seleziona gli sperm. migliori è il 95% mentre gli altri
fungono da filtro.
–PERCOLL o Tecnica a gradienti discontinui da 1ml- In provetta si stratificano volumi uguali
da 1ml (uno sopra l’altro) di ogni gradiente e sopra a tutto un uguale volume di seme (4ml in
tutto) si centrifuga per 15 minuti e nel pellet del gradiente 95% si recuperano gli spermatozoi
migliori. Questa tecnica è utilizzata per trattare semi di buona qualità (>40x106/ml ; >50%
motilità rapida+debole)
 MINIPERCOLL o Tecnica a gradienti discontinui da 0.5ml o da 0.3ml . In provetta si
stratificano volumi uguali da 0.5ml (oppure da 0.3ml ) (uno sopra l’altro) di ogni gradiente e
sopra a tutto un uguale volume di seme (2ml in tutto)( altrimenti 1.2ml) si centrifuga per 10
minuti e nel pellet del gradiente 95% si recuperano gli spermatozoi migliori. Questa tecnica è
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utilizzata per trattare semi di media e scarsa qualità (<5x106/ml ; <<50% motilità
rapida+debole).
Quando un trattamento è ben riuscito la motilità è almeno dell’ 80%, la morfologia è migliorata
almeno del 30% ed il campione è libero da detriti e cellule infiammatorie.
CONCLUSIONI
Vantaggi dello swim-up :
1) aumento della percentuale di spermatozoi mobili
2) migliori parametri cinetici
3) diminuzione molto netta della percentuale di sperm. anomali
Svantaggi dello swim-up :
1) Diminuzione della concentrazione rispetto al seme di base
Vantaggi del percoll :
1) Filtra e delinea i componenti del plasma seminale
2) Recupero degli sperm. migliori per motilità e morfologia
Svantaggi del percoll :
1) Elevato traumatismo (non si può centrifugare tanto ! )
2) Diminuzione della concentrazione
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 Cosa ci si può aspettare da un trattamento del liquido seminale per riproduzione
assistita?
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Selezione spermatozoi mobili
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Aumentate capacità cinetiche
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Selezione di spermatozoi con capacità fecondante ideale
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Spermatozoi geneticamente sani
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Eliminazione di componenti patologici (gli sperm. mobili non è detto siano sani)
 Adesso lo scopo di una tecnica di preparazione per riproduzione assistita deve
essere :
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Assenza di componenti patologiche del seme
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Buona concentrazione nemaspermica
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Elevata percentuale di forme mobili con buoni parametri cinetici
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Bassa percentuale di forme atipiche
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Il fine ultimo è che lo sperm. deve penetrare l’ovocita
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