Cinetica Enzimatica
OBIETTIVO PRINCIPALE:
costruire un’equazione che potesse descrivere
in generale il comportamento cinetico degli
enzimi e quindi di determinare parametri
cinetici più importanti (KM, Vmax, costante di
specificità, costante catalitica) che sono la
carta d’identità di ogni enzima, misurando la
VELOCITA’ della reazione catalitica
Relazione tra Velocità e
concentrazione del substrato
Vmax
Km
Relazione tra Velocità e
concentrazione del substrato
Vmax
A (S) basse la reazione è lineare
Km
Relazione tra Velocità e
concentrazione del substrato
Vmax
A (S) alte, SATURAZIONE
dell’enzima
Km
Relazione tra Velocità e
concentrazione del substrato
Vmax
A (S) alte, SATURAZIONE
dell’enzima
Km
La Formazione del complesso
ES è la CHIAVE per la
comprensione della Cinetica
S
E
k1
k-1
S
E
k2
P
dove i termini indicati con k rappresentano le costanti specifiche di velocità di
reazione.
ES è un intermedio di reazione il cui basso valore di energia di attivazione
permette di fare avvenire una specifica reazione catalizzata
Quando ES in seguito al raggiungimento di uno stato di equilibrio dinamico
assume un valore di concentrazione che si mantiene costante nel tempo, si dice
che è stato raggiunto lo stato stazionario (steady state).
S
E
k1
k-1
S
E
k2
P
STEP 1
dove i termini indicati con k rappresentano le costanti specifiche di velocità di
reazione.
ES è un intermedio di reazione il cui basso valore di energia di attivazione
permette di fare avvenire una specifica reazione catalizzata
Quando ES in seguito al raggiungimento di uno stato di equilibrio dinamico
assume un valore di concentrazione che si mantiene costante nel tempo, si dice
che è stato raggiunto lo stato stazionario (steady state).
S
E
k1
k-1
S
E
k2
P
STEP 2
dove i termini indicati con k rappresentano le costanti specifiche di velocità di
reazione.
ES è un intermedio di reazione il cui basso valore di energia di attivazione
permette di fare avvenire una specifica reazione catalizzata
Quando ES in seguito al raggiungimento di uno stato di equilibrio dinamico
assume un valore di concentrazione che si mantiene costante nel tempo, si dice
che è stato raggiunto lo stato stazionario (steady state).
Ragionando su questo modello di reazione ad un
substrato venne elaborata
L’EQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN
0
Perché è importante questa reazione?
• E’ GENERALE
•
DA DUE GRANDEZZE MISURABILI SI OTTENGONO
INFORMAZIONI
CHE RIGUARDANO LA CINETICA DELL’ENZIMA
ASSUNZIONI UTILIZZATE PER COSTRUIRE
L’EQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN
0
Per ottenere l’equazione di M. M. sono state considerate le
seguenti assunzioni teoriche:
• VELOCITA’ INIZIALE (V0), VIENE VALUTATA SOLO LA
VELOCITA’ CATALITICA ALL’INIZIO DELLA REAZIONE
•Step limitante è ES E + P
•EQUILIBRIO RAPIDO DEL COMPLESSO ENZIMA-SUBSTRATO
e
raggiungimento
dello
STATO
STAZIONARIO
DEL
COMPLESSO ENZIMA-SUBSTRATO
Michaelis-Menten Kinetics
Vmax
Km
VELOCITA’ INIZIALE
Un problema è costituito dalla variazione di (S) nel tempo.
Per questo viene considerata la velocità iniziale.
In condizioni di (S)>>(E), se si misura la velocità iniziale
(V0) la variazione di (S) è trascurabile.
Inoltre la velocità iniziale viene misurata in in un periodo di
tempo durante il quale la reazione inversa è fisicamente
trascurabile in quanto poco è il prodotto formatosi:
la velocità iniziale che può così essere determinata sarà la
massima velocità ottenibile. (c’è molto substrato e la velocità
contraria alla direzione della reazione è bassissima)
In condizioni di velocità iniziale la reazione è di fatto
irreversibile (k-2=0) e deve essere scritta nel seguente
modo:
ASSUNZIONI UTILIZZATE PER COSTRUIRE
L’EQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN
0
Per ottenere l’equazione di M. M. sono state considerate le
seguenti assunzioni teoriche:
• VELOCITA’ INIZIALE (V0), VIENE VALUTATA SOLO LA
VELOCITA’ CATALITICA ALL’INIZIO DELLA REAZIONE
•Step limitante è ES E + P
•EQUILIBRIO RAPIDO DEL COMPLESSO ENZIMA-SUBSTRATO
e
raggiungimento
dello
STATO
STAZIONARIO
DEL
COMPLESSO ENZIMA-SUBSTRATO
Limiting step, che determina la velocità
della reazione
Quindi la Vmax si raggiunge quando tutto l’enzima è complessato in ES
e la concentrazione di E libero diventa trascurabile.
Vo= K2 (S)
ASSUNZIONI UTILIZZATE PER COSTRUIRE
L’EQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN
0
Per ottenere l’equazione di M. M. sono state considerate le
seguenti assunzioni teoriche:
• VELOCITA’ INIZIALE (V0), VIENE VALUTATA SOLO LA
VELOCITA’ CATALITICA ALL’INIZIO DELLA REAZIONE
•Step limitante è ES E + P
•EQUILIBRIO RAPIDO DEL COMPLESSO ENZIMA-SUBSTRATO
e
raggiungimento
dello
STATO
STAZIONARIO
DEL
COMPLESSO ENZIMA-SUBSTRATO
STATO STAZIONARIO
Il complesso ES si mantiene in uno stato
stazionario durante tutto il periodo di tempo
in cui si possono misurare delle velocità
iniziali:[ES] rimane costante perchè la
velocità con cui il complesso ES si forma a
partire da E+S è uguale alla somma delle
velocità con cui si scinde a dare E+P ed E+S.
L’approssimazione dello stato
Briggs and J. B. S.
stazionario G. E.Haldane
(1925)
Allo stato stazionario le
velocità di formazione e
rottura di ES sono uguali
L’ipotesi dello stato stazionario vale solo se:
•Il sistema di reazione sia un sistema chiuso (reattore batch)
•La concentrazione iniziale di substrato sia considerevolmente
superiore alla concentrazione totale di enzima
•si considera la velocià iniziale della reazione
Michaelis-Menten Kinetics
Vmax
Km
E’ adatta alle osservazioni sperimentali??
A basse (S) allora Km >> (S) e quindi
(S) Al denominatore trascurabile
A alte (S) allora (S) >> Km e quindi
Km al denominatore trascurabile
Modo più pratico per descrivere la
cinetica: Grafico degli inversi
SIGNIFICATO DELLE
COSTANTI CATALITICHE
• KM
• Kcat
• Kcat/KM
Michaelis-Menten Kinetics
Vmax
Km
La km è caratteristica di un
enzima per un certo substrato
•
•
•
•
Glucosio] plasma: circa 5mM
Glucosio + ATP
Glucosio-6-P +ADP
Km glucosio per GK epatica=15mM
Km glucosio per HK cervello=0,01 mM
• Spesso la Km è simile
alle concentrazioni
cellulari fisiologiche
dei substrati (in rosa)
Costante catalitica (kcat)
o Numero di turn-over
E’ rappresentata dalla k della reazione limitante
VMax = kcat [E0]
• Massimo numero di molecole di
substrato convertite nella unità di tempo
da una molecola (sito) di enzima
• È correlata alla velocità di
decomposizione del complesso ES
Nel caso di reazioni complesse con molte tappe
catalitiche, la costante catalitica è data dal contributo
di tutte le costanti di velocità nei singoli step. Se una
di queste velocità è molto più lenta delle altre:
kcat sarà uguale alla K di quello step
• Ogni enzima ha valori di km e kcat che sono
ottimali per le condizioni bilogiche in cui si trova
ad operare.
Dipendono quindi dal substrato, dalla sua
concentrazione e dalla chimica della reazione
da catalizzare.
Il confronto di km e kcat di enzimi diversi potrebbe
non essere corretto
Rapporto kcat/Km
(costante di specificità)
• Dà una idea della efficienza relativa con cui
vengono
trasformati
substrati
diversi
(specificità)
• Tiene conto della velocità di catalisi (kcat) e
dell’affinità tra E e S (Km)
• Dà una idea della efficienza catalitica
dell’enzima (enzimi “perfettamente” evoluti
hanno
costanti
cinetiche
che
si
approssimano alla diffusione)
Acetlicolinesterasi
9 x 10-5
1.4 x 104
Fumarasi
5 x 10-6
8 x 102
1.6 x 108
1.6 x 108
MOLTI ENZIMI CATALIZZANO
REAZIONI A DUE O PIU’
SUBSTRATI
Meccanismo a ping-pong
Meccanismo a ping-pong
GLI ENZIMI POSSONO ESSERE
INIBITI
Inibizione Reversibile
Gli inibitori reversibili
competitivi sono
molto simili al substrato
(eccedono entrambi al sito
attivo dell’enzima)
substrato
inibitore
INIBIZIONE
COMPETITIVA
Stessa Vmax
Aumento Km
INIBIZIONE
INCOMPETITIVA
Calo Vmax
Cala Km
(ESI porta a un calo di ES
e quindi altro ES deve formarsi)
INIBIZIONE
MISTA
(sia Km che Vmax sono modificate)
INIBITORI IRREVERSIBILI
La Velocità di reazione è
influenzata da numerose variabili:
– concentrazione di
substrato
– concentrazione di
enzima
– Inibitori
– Cofattori/coenzimi
– attivatori
– pH
– temperatura
La Velocità di reazione è
influenzata da numerose variabili:
– concentrazione di
substrato
– concentrazione di
enzima
– Inibitori
– Cofattori/coenzimi
– attivatori
– pH
– temperatura
Effetti del pH sull’attività
enzimatica
L’attività di molti enzimi varia con il pH nello stesso
modo in cui semplici acidi e basi si ionizzano.
nel sito catalitico vi sono spesso
residui acidi e basici
Variazioni di pH modificano le
interazioni intra- ed inter-catena
Diminuisce concentrazione H+
Tutti gli amminoacidi liberi possiedono almeno due pK perché possiedono
almeno il gruppo carbossilico (ACIDO) e il gruppo amminico (BASICO). Per
esempio l’alanina che ha una catena laterale alifatica possiede solo questi
due gruppi ionizzabili:
pK è il pH in cui la forma protonata e
la deprotonata dell’amminoacido si
trovano alla stessa concentrazione:
Henderson- Hasselbach:
Per acido:
AH
A- + H +
pH = pKa + log A- / AH
Per base:
BH +
B+H+
pH = pKb + log B/ BH +
Enzima proteolitico digestivo che agisce nello
stomaco ad un pH tra 1 e 2
La Velocità di reazione è
influenzata da numerose variabili:
– concentrazione di
substrato
– concentrazione di
enzima
– Inibitori
– Cofattori/coenzimi
– attivatori
– pH
– temperatura
Sperimentalmente, in vitro, si è rilevato che la
velocità di gran parte delle reazioni enzimatiche
in media raddoppia per ogni aumento di 10 °C
di temperatura:
Temperatura ottimale:
• varia da un enzima all'altro;
• dipende dal particolare sistema cellulare;
L’aumento della temperatura porta ad un aumento dell’energia cinetica del sistema
ed ha un effetto importante sulla velocità di reazione
Quando le molecole collidono l’energia cinetica può essere convertita in energia chimica potenziale. Se questa
forma di energia diventa grande abbastanza, può venire raggiunta la soglia dell’energia di attivazione di una
reazione. Se tale reazione è esoergonica, può avvenire la trasformazione dei reagenti in prodotti.
Così se la temperatura di un sistema aumenta, più molecole per unità di tempo possono raggiungere l’energia di
attivazione, e la velocità di una reazione può aumentare.
Per convertire il substrato in prodotti, gli enzimi devono collidere e legare il substrato nel sito attivo. Aumentando
la T aumenterà questo numero di collisioni.
L’aumento della temperatura del sistema può anche rompere i legami deboli dell’enzima e denaturare così la
sua struttura tridimensionale. QUINDI:
Il calore fino ad una certo punto aumenta l’attività enzimatica, poi, superata una certa
soglia, può indurre la denaturazione dell’enzima e quindi la sua completa inattivazione.
Enzimi
Andamento dell'attività enzimatica in funzione della temperatura.
(tratto AB), crescente, corrisponde
all'aumento dell'attività dell'enzima
fino a un massimo per effetto di
una contemporanea diminuzione
dell'energia di attivazione della
reazione
(tratto BC), decrescente fino a un valore asintotico
della temperatura, è l'effetto combinato
dell'aumento di attività enzimatica proporzionale
all'aumento di temperatura e della diminuzione
brusca di tale attività per sottrazione di enzima
denaturato
(tratto CD) asintotica
a un valore limite di
temperatura,
corrisponde alla
totale e irreversibile
inattivazione
dell'enzima per
denaturazione.
EFFETTO DELL TEMPERATURA
SULL’ATTIVITA’ ENZIMATICA
Chimotripsina da maiale
Gambero da ALASKA
Enzima di batterio che vive
in acque calde
La Velocità di reazione è
influenzata da numerose variabili:
– concentrazione di
substrato
– concentrazione di
enzima
– Inibitori
– Cofattori/coenzimi
– attivatori
– pH
– temperatura
Struttura generale degli enzimi
ione metallico
coenzima (vitamina)
gruppo prostetico
(legato covalentemente)
OLOENZIMA
APOENZIMA
(Parte proteica)
MECCANISMI DI AZIONE
