Trasformazione genetica di Limonium spp. mediante inserimento dei geni rol ABC
Vengono sotto riportate delle immagini riguardanti alcune specie di Limonium trasformate geneticamente mediante
l'utilizzo di Agrobacterium tumefaciens recante i geni rol ABC di Agrobacterium rhizogenes.
Cosa sono i geni rol ABC
Uno degli argomenti più interessanti della biologia degli organismi superiori è rappresentato dallo studio della
morfogenesi e dello sviluppo. Queste tematiche richiamano immediatamente l'attenzione sul ruolo giocato dagli ormoni
nell'induzione e nel controllo di questi fenomeni.
Negli ultimi anni lo studio molecolare di una patogenesi diffusa in natura, causata dal batterio del suolo Agrobacterium
rhizogenes, ha suggerito la possibilità di studiare una strategia alternativa sia per alterare lo sviluppo di una pianta sia
per produrre eventi morfogenetici del tipo precedentemente descritto.
Agrobacterium rhizogenes è in grado di indurre al sito di inoculo in piante dicotiledoni la formazione di radici avventizie
(hairy root), cioè di indirizzare cellule più o meno specializzate verso la morfogenesi radicale. Questo fenomeno è
dovuto al trasferimento di un frammento di DNA (T-DNA) dal plasmide Ri contenuto nel batterio alla cellula vegetale.
Questo T-DNA, che non è espresso nel batterio, si integra covalentemente nel DNA eucariotico e viene trascritto e
tradotto: l'attivazione di questi geni causa, fra l'altro, la neoplasia organogenetica che si manifesta sotto forma di
radici. L'induzione della patogenesi da parte degli Agrobacterium (rhizogenes e tumefaciens hanno in comune lo stesso
meccanismo di infezione) rappresenta un caso unico in natura, che può essere ricondotto ad una sorta di parassitismo
genetico. I geni del T-DNA posseggono e riconoscono segnali di tipo eucariotico e una volta entrati nella cellula
superiore, si esprimono.
Alcuni di essi producono enzimi i quali portano alla modificazione di certi aminoacidi in molecole chiamate opine che il
solo batterio infettante è in grado di metabolizzare come fonte di carbonio e di azoto. È evidente come ciò possa
essere di vantaggio per il batterio rispetto ad altri batteri del suolo suoi concorrenti e come la morfogenesi neoplastica
incrementi la fonte del prodotto nutritivo.
Da radici hairy root indotte dal batterio è stato possibile ottenere, direttamente o più spesso via coltura di tessuti,
intere piante transgeniche contenenti il T-DNA trasformante.
L'analisi fenotipica di questi individui ha messo in evidenza una serie di modificazioni caratteristiche che sono state
comprese nella dizione fenotipo hairy root. Seppure con alcune diversità tra le specie studiate, le piante transgeniche
hr presentano un colore verde piu intenso nelle foglie, una taglia più bassa con accorciamento degli internodi, perdita
della dominanza apicale con maggior sviluppo delle gemme ascellari, accartocciamento fogliare, una accentuata
rizogenesi con parziale perdita del geotropismo radicale, una riduzione della fertilità e della produzione di seme e in
specie biennali o poliennali una riduzione del periodo di vita.
Una valutazione approssimativa di questo fenotipo non faceva certo pensare ad una possibile utilizzazione di un gruppo
di geni in grado di scatenare alterazioni così peggiorative della pianta.
Il T-DNA di A. rhizogenes, di cui si conosce la sequenza nucleotidica, è però composto di 18 open reading frames
(ORFs), cioè presumibilmente di 18 differenti funzioni geniche, la dissezione delle quali e il loro trasferimento in pianta
offrivano la possibilità di mettere in relazione singoli geni o combinazioni degli stessi con una particolare modificazione
fenotipica.
Seguendo questa strategia si è potuto appurare che il fenotipo hairy root può essere indotto trasferendo nella pianta
solo tre dei 18 geni presenti nel T-DNA, in particolare ORF 10,11,12 (secondo una definizione genetica rol A.B,C, dove
rol sta per root locus) e che l'intensità delle modificazioni è funzione sia del numero di copie del frammento di T-DNA
presente sia del livello di espressione dei geni stessi.
A questo primo risultato, che permetteva di ricondurre una serie di alterazioni all'attività sinergica di un ristretto
numero di geni, ne sono seguiti altri che hanno permesso di assegnare più specifiche funzioni ad ognuno dei tre geni
suddetti o a loro combinazioni ad attività cooperativa.
Ad esempio ORF 10 (rol A) induce la formazione di piante decisamente nanizzate con accentuato accorciamento degli
internodi; le foglie di piante rol A sono di colore verde intenso, di dimensioni ridotte e accartociate;
Il promotore di rol A fa esprimere il gene nelle cellule del tessuto floematico di steli, radici e foglie.
ORF 11 (rol B) riduce la dominanza apicale, la senescenza delle foglie più vecchie è anticipata, la fertilità dei fiori è
ridotta ed è il gene responsabile per l'induzione radicale;
L'espressione di rol B, sotto il controllo del proprio promotore, è localizzata nelle cellule meristematiche, nelle cellule
del parenchima del floema e dello xilema
ORF 12 (rol C) è responsabile dell'induzione dei seguenti caratteri: modifica della forma delle foglie, riduzione della
dimensione delle foglie e dei fiori, accorciamento degli internodi, colorazione pallida delle foglie, parziale sterilità
maschile dei fiori e sembra essere associato ad una aumentata capacità di crescita delle gemme ascellari.
L'espressione di rol C, sotto il controllo del proprio promotore, raggiunge alti valori nelle radici e negli steli mentre è
meno evidente nelle foglie; è specifica del floema. L'espressione di rol C varia con lo sviluppo della pianta.
Inoltre coppie di questi geni, diversamente assortiti, causano alterazioni sufficientemente definite nello sviluppo della
pianta.
Queste associazioni gene-carattere nulla ci dicono dei meccanismi molecolari attraverso i quali si manifesta il carattere
e si può solo speculare sulle possibili attività di questi geni.
Né la conoscenza della sequenza nucleotidica è stata di aiuto, in quanto i polipeptidi dedotti non sono associabili ad
alcuna proteina di cui a tutt'oggi sia nota la sequenza.
Per ciò che riguarda altri geni del T-DNA, sembra che questi abbiano effetti minori sul fenotipo delle piante
transgeniche, anche perché questo frammento di DNA trasformante presenta casi di ridondanza dovuta sia a geni
duplicati che a geni con sequenze di probabile origine comune.
In un settore come quello delle ornamentali, dove la bellezza associata alla novità del prodotto giocano un ruolo
essenziale nella domanda del mercato, la possibilità di ottenere nuovi colori e nuove architetture della pianta,
rappresenta da sempre l'obbiettivo fondamentale perseguito da breeders e ricercatori.
