dia Curia - Tumori Ereditari

Università degli Studi “G. d’Annunzio” di Chieti-Pescara
Facoltà di Medicina e Chirurgia - Dipartimento di Oncologia e Medicina
Sperimentale
Sezione di Patologia Molecolare
Espressione allelica del gene MYH in pazienti
con poliposi, APC negativi
M.Cristina Curia, Sabrina De Iure, Serena Veschi, Giandomenico Palka, Renato
Mariani-Costantini, Pasquale Battista, Alessandro Cama, Gitana Aceto.
Tumori Ereditari, Modena, 18-19 novembre 2010
La poliposi associata ad MYH:
adenomi colorettali multipli
aumento del rischio di cancro
TRASMISSIONE
AUTOSOMICA
RECESSIVA
Mutazioni costituzionali in MYH causano un
aumento di transversioni G:C
T:A nel genoma
Il coinvolgimento di MYH nella poliposi è stato
suggerito dall’elevata frequenza di transversioni
somatiche osservate in alcuni pazienti FAP
privi di alterazioni costituzionali di APC
AFAP
Se storia familiare
chiaramente
dominante
- mutazione in APC
Se storia familiare
NON chiaramente
dominante
- mutazione in MYH
- mutazione (de novo) in APC
DNA Damage, Repair, and Consequences
BER
replicazione
C
GO
C
G
danno ossidativo (ROS)
C
GO
A
GO
MYH
OGG1 GO
C
A
GO
riparo
C
GO
riparo
C
G
MYH : Adenina-DNA glicosilase specifica per l’appaiamento A/G
(BER pathway)
Mappa: 1p32-34
16 esoni - 11147 bp
5’ regione catalitica comune
ad altre glicosilasi BER
Motivo Helix-hairpin-helix
Specificità del mismatch
vari domini di legame al
motivo Fe-S forse
DNA: MSH6, A,
coinvolto nel favorire il
endonuclease
posizionamento
I apurinica
lungo l’elica del DNA
3’ riconoscimento
dell’ 8-oxo-G
proteina: 546 AA
Domini:
Localizzazione subcellulare:
Nucleare e mitocondriale
Funzione:
• Coinvolta nel riparo dei danni ossidativi sul DNA
• Inizia il riparo della A:oxoG a C:G rimuovendo l’adenina
impropria dallo scheletro di DNA
• Possiede attività DNA glicosilasica sia verso la A che la 2-OH-A
Malattia:
Poliposi adenomatosa familiare del colon autosomica recessiva
Obiettivi dello studio
 Verificare in pazienti APC negativi con poliposi e con mutazione
monoallelica di MYH una ridotta espressione dell’allele ritenuto WT
 Valutare l’effetto delle singole mutazioni di MYH sull’espressione
allelica
 Valutare l’espressione allelica relativa in pazienti MYH negativi
utilizzando varianti geniche frequenti
Primer extension
per lo studio della
espressione allelica relativa (ASE)
Varianti c.972G>C (H324Q nell’esone 12) e
c.64G>A (V22M nell’esone 2) del gene MYH
Discriminazione allelica sulla base
delle dimensioni
Estrazione DNA genomico e amplificazione del gDNA nella zona
contenente la variante
Identificazione di eterozigoti per varianti c.972G>C (H324Q) e
c.64G>A (V22M) di MYH mediante DHPLC
Estrazione RNA, retrotrascrizione RNA in cDNA
Amplificazione del cDNA nella zona contenente la variante
Reazione di primer extension:
gDNA vs cDNA
Quantizzazione delle altezze dei picchi corrispondenti ai 2 alleli
Calcolo del rapporto di espressione allelica, normalizzazione con il gDNA
Pazienti senza mutazione di APC
Fase 1: analisi del gene APC
Pazienti studiati:
26 AFAP
Metodi combinati :
DHPLC
Sequenza automatica
Fase 2: analisi del gene MYH
Pazienti studiati:
DHPLC
Sequenza automatica
26 AFAP
Espressione allelica germinale
Controlli di popolazione
150 controlli genotipizzati per la variante c.972G>C
45 controlli eterozigoti per
tale marcatore allelico di eterozigosità
Esempi di cromatogrammi relativi
all’analisi in DHPLC del gDNA di alcuni
dei controlli in studio
Test di validazione della variante c.972G>C (H324Q) di MYH
in individui eterozigoti (gDNA)
Individui
NG 51
N 242
N 252
N 254
N 278
N 844
N 848
GD 79
GD 83
GD 102
GD 122
N.° det
1
1
1
1
1
1
1
2
3
3
3
Rapporti
allelici
1.14
1.28
1.15
1.25
1.21
1.29
1.10
1.22
1.26
1.18
1.22
Media rapporti
allelici
1.21
SD
CV %
0.06
5.04
MUTAZIONI GERMINALI D I MYH IN PAZIENTI CON POLIPOSI , APC NEGATIVI
Paziente
Esone
Cambiamento nucleotidico
Conseguenze
Fenotipo
Familiarità
GD 69
GD 71
GD 123
GD 82
GD 68
2
2
2
7,10
7,12
NO
SI (verticale)
NO
SI(orizzontale)
NO
9,12
12
[p.Val22Met]
[p.Val22Met]
[p.Val22Met]
[p.Tyr165Cys]+[p.Arg260Trp]
[p.Tyr165Cys]+[p.Leu374Pro] +
[p.His324Glu]
[p.Asn224Asn]+ [p.His324Glu]
[p.His324Glu]
AFAP
AFAP
AFAP
FAP
AFAP
GD 83
GD 79
[c.64G>A]
[c.64G>A]
[c.64G>A]
[c.494A>G]+[c.778C>T]
[c.494A>G]+[c.1121T>C]
+[c.972G>C]
[c.672C>T] +[c.972G>C]
[c.972G>C]
SI(orizzontale)
NO
GD 81
GD 102
GD 122
GD 146
GD 108
GD 124
12
12
12
12
13
14
[p.His324Glu]+ [p.His324Glu]
[p.His324Glu]
[p.His324Glu]
[p.His324Glu]
[p.Arg412Cys]
[p.Glu466del] +
[p.Glu466del]
GD 117
IVS2
[c.972G>C]+[c.972G>C]
[c.972G>C]
[c.972G>C]
[c.972G>C]
[c.1234C>T]
[c.1395_1397del]+
[c.1395_1397del]
[IVS2+30A>G]
FAP
poliposi
diffusa
AFAP
AFAP
FAP
AFAP
FAP
FAP
NO
GD 118
IVS6
IVS15
IVS12
poliposi
multipla
AFAP
AFAP
AFAP
AFAP
AFAP
poliposi
diffusa
AFAP
AFAP
AFAP
FAP
FAP
poliposi
gastrica
SI (verticale)
Si(verticale)
SI(orizzontale)
Si(verticale)
Si(verticale)
GD 112#1
GD 48
GD 70
GD 78
GD 80
GD 92
GD 107
GD 111
GD 119
GD 121
GD 140
[IVS6+35A>G]+ [IVS15-40C>G]
[IVS12-27C>T]
SI (verticale)
SI(orizzontale)
SI (verticale)
NO
SI (verticale)
SI(orizzontale)
SI (verticale)
NO
Si(verticale)
SI (verticale)
SI (verticale)
NO
NO
Famiglia GD 82
Trasmissione orizzontale
FAP
49aa
FAP
54aa
eterozigoti composti
Y165C
Y165C
mutazioni di MYH
R260W
Esempi di cromatogrammi relativi a 2 casi
eterozigoti per la variante c.972G>C
primer
primer
Allele C
Allele C
Allele G
GD 79
Allele G
GD 83
Esempi di cromatogrammi relativi a 2 casi
eterozigoti per la variante c.972G>C
primer
Allele C
Allele G
GD 102
primer
Allele C
Allele G
GD 122
Conclusioni
 Pazienti senza mutazione di MYH possono presentare
altre alterazioni del gene a livello germinale quali uno
sbilancio d’espressione allelica
 Tali alterazioni genetiche in pazienti con mutazione
monoallelica
o
MYH-negativi
potrebbero
essere
associate ad aumentato rischio di cancro colorettale
 Se questa ipotesi fosse confermata è consigliabile
sottoporre gli individui portatori di sbilancio e i familiari
a rischio a protocolli di sorveglianza e prevenzione