Università degli Studi “G. d’Annunzio” di Chieti-Pescara Facoltà di Medicina e Chirurgia - Dipartimento di Oncologia e Medicina Sperimentale Sezione di Patologia Molecolare Espressione allelica del gene MYH in pazienti con poliposi, APC negativi M.Cristina Curia, Sabrina De Iure, Serena Veschi, Giandomenico Palka, Renato Mariani-Costantini, Pasquale Battista, Alessandro Cama, Gitana Aceto. Tumori Ereditari, Modena, 18-19 novembre 2010 La poliposi associata ad MYH: adenomi colorettali multipli aumento del rischio di cancro TRASMISSIONE AUTOSOMICA RECESSIVA Mutazioni costituzionali in MYH causano un aumento di transversioni G:C T:A nel genoma Il coinvolgimento di MYH nella poliposi è stato suggerito dall’elevata frequenza di transversioni somatiche osservate in alcuni pazienti FAP privi di alterazioni costituzionali di APC AFAP Se storia familiare chiaramente dominante - mutazione in APC Se storia familiare NON chiaramente dominante - mutazione in MYH - mutazione (de novo) in APC DNA Damage, Repair, and Consequences BER replicazione C GO C G danno ossidativo (ROS) C GO A GO MYH OGG1 GO C A GO riparo C GO riparo C G MYH : Adenina-DNA glicosilase specifica per l’appaiamento A/G (BER pathway) Mappa: 1p32-34 16 esoni - 11147 bp 5’ regione catalitica comune ad altre glicosilasi BER Motivo Helix-hairpin-helix Specificità del mismatch vari domini di legame al motivo Fe-S forse DNA: MSH6, A, coinvolto nel favorire il endonuclease posizionamento I apurinica lungo l’elica del DNA 3’ riconoscimento dell’ 8-oxo-G proteina: 546 AA Domini: Localizzazione subcellulare: Nucleare e mitocondriale Funzione: • Coinvolta nel riparo dei danni ossidativi sul DNA • Inizia il riparo della A:oxoG a C:G rimuovendo l’adenina impropria dallo scheletro di DNA • Possiede attività DNA glicosilasica sia verso la A che la 2-OH-A Malattia: Poliposi adenomatosa familiare del colon autosomica recessiva Obiettivi dello studio Verificare in pazienti APC negativi con poliposi e con mutazione monoallelica di MYH una ridotta espressione dell’allele ritenuto WT Valutare l’effetto delle singole mutazioni di MYH sull’espressione allelica Valutare l’espressione allelica relativa in pazienti MYH negativi utilizzando varianti geniche frequenti Primer extension per lo studio della espressione allelica relativa (ASE) Varianti c.972G>C (H324Q nell’esone 12) e c.64G>A (V22M nell’esone 2) del gene MYH Discriminazione allelica sulla base delle dimensioni Estrazione DNA genomico e amplificazione del gDNA nella zona contenente la variante Identificazione di eterozigoti per varianti c.972G>C (H324Q) e c.64G>A (V22M) di MYH mediante DHPLC Estrazione RNA, retrotrascrizione RNA in cDNA Amplificazione del cDNA nella zona contenente la variante Reazione di primer extension: gDNA vs cDNA Quantizzazione delle altezze dei picchi corrispondenti ai 2 alleli Calcolo del rapporto di espressione allelica, normalizzazione con il gDNA Pazienti senza mutazione di APC Fase 1: analisi del gene APC Pazienti studiati: 26 AFAP Metodi combinati : DHPLC Sequenza automatica Fase 2: analisi del gene MYH Pazienti studiati: DHPLC Sequenza automatica 26 AFAP Espressione allelica germinale Controlli di popolazione 150 controlli genotipizzati per la variante c.972G>C 45 controlli eterozigoti per tale marcatore allelico di eterozigosità Esempi di cromatogrammi relativi all’analisi in DHPLC del gDNA di alcuni dei controlli in studio Test di validazione della variante c.972G>C (H324Q) di MYH in individui eterozigoti (gDNA) Individui NG 51 N 242 N 252 N 254 N 278 N 844 N 848 GD 79 GD 83 GD 102 GD 122 N.° det 1 1 1 1 1 1 1 2 3 3 3 Rapporti allelici 1.14 1.28 1.15 1.25 1.21 1.29 1.10 1.22 1.26 1.18 1.22 Media rapporti allelici 1.21 SD CV % 0.06 5.04 MUTAZIONI GERMINALI D I MYH IN PAZIENTI CON POLIPOSI , APC NEGATIVI Paziente Esone Cambiamento nucleotidico Conseguenze Fenotipo Familiarità GD 69 GD 71 GD 123 GD 82 GD 68 2 2 2 7,10 7,12 NO SI (verticale) NO SI(orizzontale) NO 9,12 12 [p.Val22Met] [p.Val22Met] [p.Val22Met] [p.Tyr165Cys]+[p.Arg260Trp] [p.Tyr165Cys]+[p.Leu374Pro] + [p.His324Glu] [p.Asn224Asn]+ [p.His324Glu] [p.His324Glu] AFAP AFAP AFAP FAP AFAP GD 83 GD 79 [c.64G>A] [c.64G>A] [c.64G>A] [c.494A>G]+[c.778C>T] [c.494A>G]+[c.1121T>C] +[c.972G>C] [c.672C>T] +[c.972G>C] [c.972G>C] SI(orizzontale) NO GD 81 GD 102 GD 122 GD 146 GD 108 GD 124 12 12 12 12 13 14 [p.His324Glu]+ [p.His324Glu] [p.His324Glu] [p.His324Glu] [p.His324Glu] [p.Arg412Cys] [p.Glu466del] + [p.Glu466del] GD 117 IVS2 [c.972G>C]+[c.972G>C] [c.972G>C] [c.972G>C] [c.972G>C] [c.1234C>T] [c.1395_1397del]+ [c.1395_1397del] [IVS2+30A>G] FAP poliposi diffusa AFAP AFAP FAP AFAP FAP FAP NO GD 118 IVS6 IVS15 IVS12 poliposi multipla AFAP AFAP AFAP AFAP AFAP poliposi diffusa AFAP AFAP AFAP FAP FAP poliposi gastrica SI (verticale) Si(verticale) SI(orizzontale) Si(verticale) Si(verticale) GD 112#1 GD 48 GD 70 GD 78 GD 80 GD 92 GD 107 GD 111 GD 119 GD 121 GD 140 [IVS6+35A>G]+ [IVS15-40C>G] [IVS12-27C>T] SI (verticale) SI(orizzontale) SI (verticale) NO SI (verticale) SI(orizzontale) SI (verticale) NO Si(verticale) SI (verticale) SI (verticale) NO NO Famiglia GD 82 Trasmissione orizzontale FAP 49aa FAP 54aa eterozigoti composti Y165C Y165C mutazioni di MYH R260W Esempi di cromatogrammi relativi a 2 casi eterozigoti per la variante c.972G>C primer primer Allele C Allele C Allele G GD 79 Allele G GD 83 Esempi di cromatogrammi relativi a 2 casi eterozigoti per la variante c.972G>C primer Allele C Allele G GD 102 primer Allele C Allele G GD 122 Conclusioni Pazienti senza mutazione di MYH possono presentare altre alterazioni del gene a livello germinale quali uno sbilancio d’espressione allelica Tali alterazioni genetiche in pazienti con mutazione monoallelica o MYH-negativi potrebbero essere associate ad aumentato rischio di cancro colorettale Se questa ipotesi fosse confermata è consigliabile sottoporre gli individui portatori di sbilancio e i familiari a rischio a protocolli di sorveglianza e prevenzione