CICLO DI KREBS (o DELL’ACIDO CITRICO) È un processo ossidativo che ha un ruolo centrale nel metabolismo energetico delle cellule eucariotiche. Avviene nella matrice mitocondriale. È alimentato soprattutto dall’Acetil-CoA, metabolita chiave prodotto dal catabolismo ossidativo dei carboidrati, dei lipidi, di vari amminoacidi. L’energia rilasciata dalle ossidazioni del ciclo di Krebs è conservata come potere riducente (NADH e FADH2) che alimenta la sintesi di ATP mitocondriale. Per ogni molecola di Acetil-CoA che viene ossidata nel ciclo vengono prodotti: 3 NADH 1 FADH2 1 GTP (ATP) Acetil-CoA Citrato Ossalacetato Malato Isocitrato Ciclo dell’acido citrico chetoglutarato Fumarato Succinil-CoA Succinato L’acetil-CoA entra nel ciclo di Krebs nella reazione di condensazione con l’ossalacetato che produce il CITRATO liberando CoA-SH H+ ACETIL-CoA CITRATO SINTASI CITRATO OSSALACETATO SITO ATTIVO DELLA CITRATO SINTASI:I residui di Asp375 e His274 attivano l’Acetil-CoA, l’His320 attiva l’ossalacetato L’O carbonilico diventa ossidrile (strappa un H+ all’His320) D. Voet – C. W. Pratt – J. G. Voet, FONDAMENTI DI BIOCHIMICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2013 17 | 16 ISOMERIZZAZIONE: Il gruppo –OH deve essere spostato sul carbonio 2 3 2 CITRATO ACONITASI ACONITASI Cis-ACONITATO 3 2 ISOCITRATO Nella cellula, in condizioni reali la reazione è esoergonica, è spinta in avanti dal consumo di isocitrato nella reazione successiva. FLUOROACETIL-CoA: INIBITORE SUICIDA DELL’ACONITASI H | F—C—C | H È un metabolita del FLUOROACETATO (Tossina usata come pesticida) O S-CoA È riconosciuto come substrato dalla citrato-sintasi che lo condensa con l’ossalacetato per formare FLUOROCITRATO Il Fluorocitrato quando entra nel sito attivo dell’ACONITASI interagisce fortemente con essa inibendola in modo IRREVERSIBILE, bloccando quindi tutto il ciclo e la respirazione cellulare F Decarbossilazione ossidativa dell’isocitrato Il gruppo –OH in C-2 dell’isocitrato subisce un’ossidazione che porta alla produzione di NADH (NADPH) e alla formazione di un α-chetoacido H+ rilasciato dall’ossigeno CO2 ISOCITRATO DEIDROGENASI :H- (ione idruro trasferito sul NAD+) Isocitrato α-chetoglutarato SITO ATTIVO DELL’ISOCITRATO DEIDROGENASI: MECCANISMO • 1 ione idruro è ceduto dal C-2 al NAD+, • il gruppo ossidrilico in posizione 2 diventa un carbonile, • L’intermedio ossalosuccinato interagisce con uno ione Mn2+ che destabilizza il gruppo carbossilico in C-3 • Il gruppo carbossilico in posizione 3 esce come CO2 • Si forma un intermedio enolato, stabilizzato dallo ione Mn2+ • Entra un H+ che va a legarsi al C-3 e si ottiene un alfa-chetoacido. D. Voet – C. W. Pratt – J. G. Voet, FONDAMENTI DI BIOCHIMICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2013 17 | 20 Ossidazione dell’α-chetoglutarato: questa reazione porta alla formazione di un legame TIOESTERE ad alta energia e alla produzione di NADH Lipoammide TPP FAD Complesso dell’αchetoglutarato deidrogenasi α-chetoglutarato Succinil-CoA Simile per struttura e funzione al complesso della piruvato deidrogenasi (sono utilizzati gli stessi coenzimi e avviene la decarbossilazione ossidativa di un α-chetoacido) L’idrolisi del legame tioestere ad alta energia è accoppiata alla fosforilazione di un nucleoside-difosfato (GDP, nei mammiferi, o ADP, piante e batteri). Si ottiene GTP o ATP. Succinil-CoA sintetasi Succinil-CoA Succinato Legame tioestere ad alta energia SITO ATTIVO DELLA SUCCINIL-CoA SINTETASI: MECCANISMO Un fosfato inorganico spiazza il CoA e si forma un anidride mista: succinil-fosfato L’His fosforilata ruota verso il sito di legame per il GDP Il GTP scambia il gruppo fosfato con l’ADP per formare ATP Il gruppo fosfato è ceduto ad un residuo di His dell’enzima e si libera succinato Il fosfo-enzima cede il gruppo fosfato al GDP e si forma GTP GTP + ADP GDP + ATP Nucleoside difosfato-chinasi Ossidazione del succinato a fumarato COMPLESSO II della catena di trasporto di e- mitocondriale Trasferisce gli e- al complesso III QH2 Q SUCCINATO DEIDROGENASI SUCCINATO FUMARATO FUMARASI FUMARATO Aggiunta STEREOSPECIFICA TRANS di acqua al doppio legame. Quando il fumarato è nel sito attivo dell’enzima l’aggiunta della molecola d’acqua può avvenire solo in una direzione. Stato di transizione carbanionico FUMARASI L-MALATO Il ciclo di Krebs si conclude con un’ossidoriduzione che riforma l’ossalacetato e produce NADH L-MALATO MALATO DEIDROGENASI OSSALACETATO Nelle cellule la reazione è fortemente spinta in avanti perché l’ossalacetato è continuamente rimosso dalla citrato sintasi la quale mantiene bassa la concentrazione di ossalacetato nel mitocondrio. BILANCIO ENERGETICO: Se partiamo dall’ossidazione di 1 molecola di glucosio possiamo ottenere energia sufficiente a sintetizzare 36 (o 38) molecole di ATP sistema navetta del NADH glucosio diidrossiacetonefosfato/glicerolo 3-fosfato Glicolisi 2 ATP + 2 NADH 2 piruvato → 2 Acetil-CoA (PDH) Ciclo di Krebs 2 NADH sistema navetta del NADH malato/aspartato 2 NADH 6 NADH + 2 FADH2 + 2 GTP(ATP) TOTALE: 4 ATP 10 NADH >>>> ~ 30 ATP 2 FADH2 >>>> ~ 4 ATP ~ 38 ATP 2 FADH2 TOTALE: 4 ATP 8 NADH >>>> ~24 ATP 4 FADH2 >>>> ~ 8 ATP ~ 36 ATP Sistema navetta malato/aspartato (attiva nel fegato e nel cuore) GLICOLISI 1 2 Malato deidrogenasi citosolica 7 Transamminazione 3 6 Traslocatore malato/α-chetoglutarato Malato deidrogenasi mitocondriale Traslocatore aspartato/glutammato 5 4 Al complesso I Viene transamminato ad aspartato e nella reazione viene riprodotto α-chetoglutarato Regolazione del ciclo di KREBS: basata sul fabbisogno di ATP da parte della cellula. -disponibilità substrato -inibizione da accumulo di prodotti -inibizione allosterica Inibitore citosolico ATP, citrato, NADH + ADP della PFK-1 Sucinato deidrogenasi: subisce la regolazione della Fosforilazione Ossidativa Citrato sintasi, Isocitrato deidrogenasi e α-chetoglutarato deidrogenasi: regolate allostericamente Negli organismi areobici il ciclo di KREBS s’interseca con diverse altre vie anaboliche e cataboliche. Alcuni intermedi del ciclo di Krebs sono precursori nelle vie di biosintesi e diverse vie cataboliche producono intermedi del ciclo attraverso reazioni anaplerotiche Ac. Grassi Ac. grassi, amminoacidi REAZIONI ANAPLEROTICHE DEL CICLO DI KREBS: riforniscono il ciclo di intermedi Fegato, Rene PIRUVATO OSSALACETATO Piruvato carbossilasi – ATP, Biotina-dipendente – Cuore, muscolo schelettrico FOSFOENOLPIRUVATO OSSALACETATO Citosol cellule eucariotiche/procariotiche PIRUVATO NADPH + H+ + HO MALATO PEP-carbossichinasi – GDP-dipendente – Enzima malico - NADPH-dipendente – + NADP+ CARBOSSILAZIONE RIDUTTIVA