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SCREENING MICROBIOLOGICO E
TOSSICOLOGICO
Dott.ssa Donatella GIACOSA
Responsabile Laboratorio Biologico
SMAT SpA
Un sondaggio sulle
performance di alcuni
agenti contaminanti…
Performances di alcuni agenti contaminanti
AGENTE
UTILIZZATO
Concentrazione in mg/litro
per EFFETTO ACUTO
(con ingestione di 0,5 litri)
10.000 m3
1.000 kg
Arsenico
100
Cianuro
25
250 kg
Tossina botulinica
0,14
1,4 kg
Sarin
0,05
0,50 kg
Salmonella typhi
10.000 bact.
10 - 50 g
MONITORAGGIO IN CONTINUO presso SMAT
LABORATORIO ON-LINE CENTRO RICERCHE:
Acqua grezza (impianti Po)
Acqua potabile (Po1, Po2, Po3, La Loggia)
52 parametri CF, monitoraggio biotossicologico
LABORATORIO ON-LINE LAGUNAGGIO:
Ingresso laguna
Uscita laguna
14 parametri CF, monitoraggio radioattività e biotossicologico
MONITORAGGIO BIOTOSSICOLOGICO IN CONTINUO
100,0
80,0
60,0
40,0
100,0
20,0
80,0
0,0
60,0
40,0
20,0
0,0
PUNTI DI FORZA DEL MONITORAGGIO IN CONTINUO
• Rileva in tempo reale variazioni nella qualità dell’acqua, situazioni di
allarme e di allerta
• Permette di intervenire sul trattamento di potabilizzazione
• Coopera alla protezione dell’ambiente
• Diminuisce i costi analitici
e PROPRII DEL MONITORAGGIO TOSSICOLOGICO IN CONTINUO
• Esamina l’acqua «nel suo insieme», tenendo
conto delle reciproche interferenze dei
contaminanti
• Esamina gli organismi tester nel loro habitat, in
riferimento alla loro «salute»
Caratteristiche del test della chemiluminescenza
Vantaggi
 Rilevazione presenza contaminanti tossici
 Semplice, rapido, idoneo all’applicazione in
campo
Aspetti problematici
Scarsamente confrontabile con altri test di tossicità
Strumentazione dedicata
Molti interferenti (sodio tiosolfato, cloro, ammoniaca)
Caratteristiche del test di tossicità batterico
(Vibrio fischeri)
Vantaggi
 Rilevazione presenza contaminanti tossici
 Semplice, rapido, diffuso, affidabile
 Differenti tipi di test (screening,
comparazione, curva dose/risposta)
Aspetti problematici
Strumentazione dedicata
Sensibilità
Caratteristiche dei test di tossicità con crostacei
Vantaggi
 Rilevazione presenza contaminanti tossici
 Semplice
 Strumentazione normalmente in dotazione ai
laboratori (termostati, lampade,
stereomicroscopio)
Aspetti problematici
Durata (compresa la riattivazione)
Caratteristiche dei test immunocromatografici
Vantaggi
 Utilizzo in campo
 Semplice, rapido
Aspetti problematici
Sensibilità
test qualitativo
CONTAMINAZIONE
MICROBIOLOGICA
CLASSICA
INTENZIONALE
Batteri
Fecali
Saprofiti
Opportunisti
Aeromonas
Staphylococcus
Pseudomonas
(in foto)
Patogeni
Legionella
Escherichia
Salmonella
Vibrio
Brucella spp.
Vibrio cholerae
Francisella tularensis
Yersinia pestis
Campylobacter spp.
Bacillus anthracis
(in foto)
Principio di valutazione dell’ATP
ATP + E + LH2
E-LH2-AMP + PP
E-LH2-AMP + O2
OSSILUCIFERINA + AMP + CO2 + LUCE
E-LH2-AMP = complesso luciferinadenilato
E = luciferasi
LH2 = luciferina
AMP = adenosimonofosfato
PP = pirofosfato
RLU = Unità di luce relativa
Test dell’ATP: procedimento
1. Allestimento
del campione
campione
2. Estrazione
dell’ATP
3. Reazione
enzimatica
+ estraente
+ reattivo
Vantaggi
 Rilevazione presenza contaminanti microbiologici «metabolicamente
attivi» (ad esempio, non adatto per spore, virus, parassiti)
 Semplice e rapido, poco costoso, test di prima linea
 Ridotti volumi di campione
 Elevata sensibilità
Aspetti problematici
- Strumentazione dedicata
- rapida degradazione ATP
- diversa quantità di ATP nelle cellule batteriche
- interferenti: molecole organiche
- necessario conoscere il «rumore di fondo» della matrice se si analizza il
campione tal quale
Caratteristiche del test dell’ATP
Analisi batteriologiche: impiego di test rapidi nello
screening per l’emergenza (situazione fine 2005, per le Olimpiadi)
CONTAMINAZIONE MICROBIOLOGICA INTENZIONALE:
ESTRAZIONE DEL DNA BATTERICO PER L’ANALISI BIOMOLECOLARE
Filtrazione del campione (1L) su membrana in PC (0.45 mm)
Sospensione in 10mL (concentrato batterico)
Ultrafiltrazione (taglio 100000 Da) o purificazione su colonna
(centrifugazione 2200g per 10 min)
Recupero di 200 mL circa (concentrato batterico)
Aggiunta di soluzione lisante (50 mL)
Riscaldamento a 95°C (10 min)
ultra-centrifugazione a 10000g per 1 min
Recuperare il surnatante (DNA ESTRATTO, circa 150mL, 80% di campione)
N.B. L’analisi strumentale viene effettuata su 10 mL, corrispondenti a circa 83 mL di
campione originale; il DNA ESTRATTO può essere conservato a -20°C per 6 mesi
CONTAMINAZIONE MICROBIOLOGICA INTENZIONALE:
VIRUS E PARASSITI
Volume da analizzare: 100L per il monitoraggio, 5L per
contaminazione intenzionale, per ciascun tipo di target
Parassiti: (protozoi Giardia e Cryptosporidium): filtrazione da 1 a
5L di campione (su PC, 1 mm) e procedere secondo il metodo
routinario
Virus: prelevare almeno 5 L (recipienti in plastica); metodo
biomolecolare (PCR)
Pretrattamento: ultrafiltrazione (taglio 30000 Da) oppure
filtrazione/concentrazione su membrana elettropositiva ed eluizione
in volume ridotto; altrimenti conservare il campione a 5°C
BIBLIOGRAFIA
• Istituto Superiore di Sanità – Rapporti ISTISAN 05/4 –
Sicurezza dei sistemi acquedottistici (2005)
• Department of Homeland Security Science and Technology –
PNNL-21713 – Biodetection Technologies for First Responders
(2012)
• S. States et al. – Utility-based analytical methods to ensure
Public water supply security - JAWWA (2003)
Grazie per l’attenzione!