Lezione 6
Analisi di sequenze biologiche e
ricerche in database
Schema della lezione
• Allinemento: definizioni
• Allineamento di due sequenze
• Ricerca di singola sequenza in banche dati
(Alignment-based database searching)
– FASTA, BLAST
• Allinemento: definizioni
• Allineamento di due sequenze
• Ricerca di singola sequenza in banche dati
(Alignment-based database searching)
– FASTA, BLAST
Allineamento di sequenze
Determinare la similarità e dedurre
l’omologia
Allineare
Definire il numero di passi necessari per trasformare una
sequenza nell’altra utilizzando passaggi mutazionali come
-sostituzione
-inserzione/delezione
mismatch
1 LA CASA È NUOVA
2 LA CASSA È VUOTA
1 LA CAS-A È –NUO-VA
2 LA CASSA È V-UOT-A
5 indels
gap
1 LA CASA È NUOVA
2 LA CASSA È VUOTA
1 LA CAS-A È NUOVA
2 LA CASSA È VUOTA
match
1 indels + 2 sostituzioni
Tra le due soluzioni mostrate (ce ne sono altre!), quale scegliamo?
Esistono criteri e algoritmi che ci possono aiutare
Perchè allineare?
• Per fornire una misura di quanto sequenze
nucleotidiche o aminoacidiche siano
“imparentate”, abbiano in comune
• Questa parentela ci permette di fare inferenze
biologiche in termini di
– relazioni strutturali
– relazioni funzionali
– relazioni evolutive
• Alignment-based database searching
Terminologia
• La misura QUANTITATIVA: Similarità
– Si esprime in genere come % di identità, quantifica
i cambiamenti che sono avvenuti dal momento
della divergenza tra due specie (sostituzioni, Indels)
– Identifica i residui cruciali per mantenere la
struttura o la funzione di una proteina
Alti livelli di similarità possono indicare una divergenza recente tra
le sequenze, una storia evolutiva comune, simile funzione
biologica
Terminologia
• Una valutazione di STATO: Omologia
– Implica l’esistenza di relazioni evolutive
– Geni omologi: geni che si sono originati per
divergenza da un antenato comune
– I geni SONO o NON SONO omologhi, non esiste una
misura quantitativa dell’omologia
Eyeless ha un ruolo importante nel
dirigere lo sviluppo dell’occhio in
drosofila; Pax6 lo stesso nel topo
Eyeless e Pax6 sono decisamente
simili in sequenza e funzione
http://evolution.berkeley.edu/
probably > 500 MYA
Terminologia
Ortologhi: Geni che si sono separati in seguito ad un evento
di speciazione
• Le sequenze discendono da un antenato comune
• Molto probabilmente codificano per proteine con domini simili e
simili strutture tridimensionali
• Spesso mantengono funzioni simili
• Possono essere usati per predire funzioni geniche in genomi nuovi
Paraloghi: Geni che si sono evoluti per duplicazione in una
specifica linea evolutiva
• E’ meno probabile che mantengano funzioni simili, più comunemente
evolvono nuove funzioni
Allineamenti globali e locali
• Globale
– trova l’allineamento ottimale sul totale della
lunghezza delle sequenze
– È la soluzione migliore per sequenze di lunghezza
simile ed omologhe
– Al dimiuire del grado di similarità (es. aumento
distanza evolutiva, alto tasso di ricombinazione) i
metodi di allineamento globale tendono a
peggiorare molto in efficienza
Allineamenti globali e locali
• Locale
– Ha lo scopo di trovare regioni simili (es. domini)
in due sequenze (“paired subsequences”)
– Le regioni fuori dalle aree di allineamento locale
vengono escluse
– Può essere generato più di un allineamento
locale per ogni coppia di sequenze confrontate
– Scelta indicata nel caso di due sequenze a
similarità ridotta o di differenti lunghezze
Local vs. Global Alignment
• Global Alignment
--T—-CC-C-AGT—-TATGT-CAGGGGACACG—A-GCATGCAGA-GAC
| || | || | | | |||
|| | | | | ||||
|
AATTGCCGCC-GTCGT-T-TTCAG----CA-GTTATG—T-CAGAT--C
• Local Alignment—migliore per trovare regioni
conservate
tccCAGTTATGTCAGgggacacgagcatgcagagac
||||||||||||
aattgccgccgtcgttttcagCAGTTATGTCAGatc
Allineamenti locali: perchè?
• Due geni in specie diverse possono essere simili in
corte regioni conservate e diversi nel resto della
sequenza.
• Esempio:
– I geni Homeobox (chiaramente omologhi) hanno
corte regioni chiamate omeodomini altamente
conservate tra specie.
– Un allineamento globale non troverebbe gli
omeodomini perchè cercherebbe di allineare
l’INTERA sequenza
• Allinemento: definizioni
• Allineamento di due sequenze
• Ricerca di singola sequenza in banche dati
(Alignment-based database searching)
– FASTA, BLAST
Allineamento: ipotesi circa l’omologia
posizionale (discendenza da antenato
comune) di due residui in due (o più)
sequenze
Un allineamento a coppie consiste di una serie di
residui o basi accoppiati, una per sequenza.
Ci sono tre tipi di coppie:
(1) match = stesso nucleotide (o AA) in entrambe le sequenze
(2) mismatch = diverso nucleotide (o AA) in una delle sequenze
(3) gap = una base (o AA) in una sequenza e niente nell’altra
GCGGCCCATCAGGTAGTTGGTG-G
GCGTTCCATC--CTGGTTGGTGTG
111221111133212111111131
Come si può fare in modo non manuale??
Dot plot: matrici a punti
Gibbs and McIntyre 1970
Non produce direttamente un allineamento, ma una mappa delle zone di somiglianza
Le due sequenze vengono scritte come colonne e righe di una matrice
Si inserisce un punto dove le due sequenze sono identiche
Sequenza 2: inversione
Dot plot: matrici a punti
Vantaggi: visivamente si intuisce che cosa è successo
Sequenza 2: delezione (potrebbe essere
anche un’inserzione in seq1)
Passo in diagonale verso una casella con un punto= match.
Diagonale verso una casella vuota = mismatch.
Orizzontale = gap nella sequenza2.
Verticale = gap nella sequenza1.
Svantaggi:
Non è possibile
identificare
l’allineamento migliore.
Le matrici di nucleotidi
sono spesso confuse
per via dell’alta
ripetitività dei simboli
(sono solo 4!)
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Come si può migliorare il metodo dot plot
eliminando un po’ di rumore di fondo?
Ad esempio pesando i diversi cambiamenti
usando dei criteri
Matrici di punteggio e penalità per i gap
• Il vero allineamento tra due sequenze è
quello che riflette in modo accurato le loro
relazioni evolutive.
• Poichè il vero allineamento non è conosciuto
in pratica si cerca l’allineamento ottimale:
minimizza i mismatches e i gaps secondo certi
criteri….purtroppo ↓ mms ↑ gaps
↓ gaps ↑ mms
(
(
(
Matches
Mismatches
Gaps
(1 terminal)
Matches
Mismatches
Gaps
Matches
Mismatches
Gaps (both
terminal)
Matrici di punteggio e penalità per i gap
Lo schema di punteggio include una penalizzazione per
le in-del (gap penalty) e una matrice di punteggio
(scoring matrix) M(a,b), che specifica ogni tipo di
match (a = b) o di mismatch (a b).
Le unità nella matrice di punteggio possono essere
nucleotidi nelle sequenze di DNA o RNA, i codoni nelle
regioni codificanti, o gli aminoacidi nelle sequenze
proteiche.
Cos’è una matrice di punteggio?
• Matrice che associa un punteggio ad ogni coppia
di entità che troviamo in un allineamento
• Ogni linea e ogni colonna rappresentano un
residuo (4 nucleotidi o 20 aminoacidi)
• La diagonale è l’identità
• Il triangolo inferiore corrisponde alle sostituzioni e
il superiore è simmetrico (non necessario)
• I valori negativi indicano penalità per certe
sostituzioni, l’algoritmo di allineamento cercherà
di evitarle
• I valori positivi indicano sostituzioni ‘accettate’ in
termini evoolutivi, strutturali o funzionali
Perché è importante capire le matrici di
punteggio?
• Compaiono in ogni analisi che implichi un
confronto tra sequenze
• Implicano un determinato percorso evolutivo
• Possono influenzare fortemente il risultato
delle analisi
DNA scoring matrices
Di solito sono semplici. La più semplice:
M(a,b) assegna valori positivi se a = b (match),
altrimenti negativi (mismatch)
0 if a b
M(a,b)
0 if a b
DNA scoring matrices
Matrici più complesse possono distinguere ad esempio
tra transizioni e trasversioni (le prime avvengono più
facilmente trattandosi di molecole più simili, però ci
sono 4 possibili trasversioni e solo 2 transizioni)
Amino acid/protein scoring matrices
Margareth Dayhoff 1965: “Atlas of potein sequences” contenente le
sequenze aminoacidiche di 65 proteine
Inizio delle collezioni di dati da cui avranno origine le banche dati
elettroniche
Dayhoff et al. nel decennio 1970-1980 hanno proposto una procedura
per il calcolo di matrici di punteggio per quantificare la propensione di
AA a mutare l’uno nell’altro durante l’evoluzione (matrici 20 x 20).
Alla base c’è l’osservazione delle proteine note:
MATRICI DI SOSTITUZIONI EMPIRICHE
Amino acid/protein scoring matrices
Empirical substitution matrices
PAM matrix (Percent/Point Accepted Mutation Matrix)
BLOSUM (BLOcks SUbstitution Matrix)
PAM (Percent/Point Accepted Mutation)
Una point accepted mutation —PAM — è la sostituzione di un AA
nella struttura primaria di una proteina con un altro AA, che
viene ‘tollerata’ dalla selezione naturale.
Dalle PAM sono escluse le mutazioni sinonime, le letali, o non
tollerate dalla selezione naturale in qualche maniera (l’esclusione
è ovvia: non si osserveranno!).
Costruzione di una matrice PAM
• Per costruire le matrici PAM (1970-80) sono stati identificati tra le
sequenze proteiche conosciute in quegli anni, 71 gruppi di sequenze
con almeno l’85% di identità (poca distanza evolutiva > allineamento
semplice> bassa possibilità di mutazioni multiple ad un sito).
• Le sequenze sono state allineate: 1572 cambiamenti osservati
Gruppi di proteine
> 85% identità
• Sono state stimate le ‘mutabilità’ dei diversi AA (propensione di un
certo AA ad essere sostituito) > OSSERVAZIONE!!
Gruppi di proteine
> 85% identità
• I dati sono stati combinati per produrre una Mutation Probability
Matrix in cui ogni valore indica la probabilità che l’AAx sia sostituito
con l’AAy attraverso una o più mutazioni accettate in uno specifico
intervallo evolutivo, rispetto alla probabilità che i due aminoacidi
siano stati allineati per caso (calcolata come freq AAx * freqAAy).
• 1 PAM è la quantità di cambiamenti evolutivi che porta, in
media, ad una sostituzione ogni 100 residui aminoacidici
(1%)
• Moltiplicando la matrice PAM01 per se stessa N volte
ottengo matrici per distanze evolutive sempre maggiori
• PAM60: mi aspetto in media 60 cambiamenti ogni 100 AA
• PAM250: 250 cambiamenti ogni 100 AA (un AA può mutare più volte)
Gruppi di proteine
> 85% identità
PAMN
matrix
ogni valore indica la probabilità che l’AAx sia sostituito con l’AAy attraverso una o più
mutazioni accettate in uno specifico intervallo evolutivo, rispetto alla probabilità che i due
aminoacidi siano stati allineati per caso
P>0
P=0
P<0
lo scambio AAx ↔ AAy si osserva più frequentemente di quanto atteso per caso
la frequenza della sostituzione è indistinguibile da quella casuale
lo scambio AAx ↔ AAy è più raro di quanto atteso per caso
BLOSUM (BLOcks SUbstitution Matrix)
• Henikoff and Henikoff (1992): matrice basata su molte più
osservazioni della PAM: scambi aminoacidici calcolati su circa
2000 «blocchi»
• Blocco: regione conservata di una famiglia di proteine senza
indels
• Direttamente calcolate sulla base di allineamenti locali
– Probabilità di sostituzione (conservazione)
– Frequenza degli aminoacidi
Cosa rapprsenta il numero dopo BLOSUM?
Esempio: BLOSUM n include nei blocchi sequenze con MASSIMO n% di
identità
Sequenze con > n% di dientità vengono clusterizzate e sostituite da
un’unica sequenza che rappresenti il cluster (vedi ad esempio le ultime
due dello schema)
Default in BLAST
E: Asp D: Glu
Equivalenze
Non esiste la matrice perfetta, dipende dal dataset
che stiamo analizzando e da quanto le sequenze da
allineare sono conservate
Gap penalties
Quanto è probabile una
certa sostituzione
(matrici)
Costo delle indels (GAP)
• Costo dell’introduzione di un gap (Gap opening penalty: G)
• Costo dell’estensione di un gap (Gap extension penalty: L*n)
• Costo complessivo:
G+Ln
Questi
sono valori
usati
spesso, ma
si possono
cambiare!
Algoritmi di allineamento
• Obiettivo: trovare il miglior allineamento, cioè
il massimo numero di simboli identici e il
minor numero di gap (=minor numero di
mutazioni = più breve percorso evolutivo)
• Per due sequenze di DNA di 200 basi ci sono
10153 possibili allineamenti….meglio non farli a
mano!
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Algoritmi di allineamento
• Esausitivi o esatti: esplorano tutte le possibili soluzioni e
scelgono la migliore (lenti, computazionalmente intensi, precisi)
• Euristici: prendono ‘scorciatoie’ e cercano di arrivare ad una
soluzione ottimale basandosi su ipotesi plausibili
Algoritmi di allineamento comuni
Algoritmo
Esaustivo?
Gaps?
Loc/Glo
Mul align
Db searches
Needleman Si
-Wunsch
Si
Global
Si
No
SmithWaterman
Si
Si
Local
Si
Si
FASTA
No
Si
Local
Si
Si
BLAST
No
No
Local
No
Si
Needleman-Wunsch
• Exact global alignment method
– Non molto buono in molti casi (es. db searches,
ricerca di piccole regioni di similarità, allinemanti
tra sequenze con grosse differenze di lunghezza)
– Il più rigoroso e completo se lo scopo è di allineare
sequenze che non si sono evolute per exon
shuffling, inserzione/delezione di domini, etc.
– Il metodo migliore se le sequenze sono di
lunghezze simili e si sono evolute da un antenato
comune attraverso mutazioni di punto, piccole
ind/dels
Smith-Waterman
• Exact local alignment method
– Modifica del N-W che permette di allineare in
locale (non serve allineare tutta la seq)
– Allineamento molto buono per db searching,
allineamento multiplo e a coppie
– Esaustivo, quindi può essere molto lento. A
differenza del N-W considera qualunque
allineamento che parta da qualunque posizione
della sequenza, non solo quelli che cominciano
all’inizio e terminano alla fine
• Allinemento: definizioni
• Allineamento di due sequenze
• Ricerca di singola sequenza in banche dati
(Alignment-based database searching)
– FASTA, BLAST
Ricerche in database
L’algoritmo deve identificare le sequenze
omologhe e non omologhe separate da
un valore soglia
ricerca
Query (sequenza sonda)
FP: falsi
positivi
Caso 1: buon lavoro
dell’algoritmo
Sequenze nelle banche
dati
Sequenze non
omologhe
VP: veri
positivi
FN: falsi
negativi
VN: veri
negativi
Sequenze
omologhe
FN
Caso 2: c’è una zona in
cui non è possibile
discriminare omologhe
e non
VN
FP
VP
Punteggio soglia
Regione di sovrapposizione
FASTA: http://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta/
Pearson WR (1996) Effective protein sequence comparison. Academic Press Inc 227-258
Pearson WR and Lipman DJ (1998) Improved tools for biological sequence comparison. PNAS 85:2444
• Euristico locale
– Prima identifica regioni di identità tra la sequenza sonda
(‘query’) e le sequenze in db. (KTUP)
– I geni o proteine con la densità maggiore di segnale
vengono riesaminati
– L’allineamento viene esteso ad entrambi i lati delle regioni
di match aggiungendo gaps e mismatches sulla base di
matrici di punteggio
– L’allineamento ottiene un punteggio
NB: leggere l’HELP del programma
FASTA algoritm
Trova sottosequenze
identiche
Le rivaluta assegnando
nuovi punteggi con le
matrici di punteggio (PAM,
BLOSUM etc)
FASTA algoritm
Unisce segmenti usando i
gaps, elimina gli altri
Usa programmi dinamici
(simili agli algoritmi NW e SM
visti in precedenza) per
creare l’allineamento
ottimale: ottiene un
punteggio «Sopt»
FASTA algoritm
Assegnazione di un «Sopt» a ciascuna sequenza
della banca dati
Le sequenze con punteggi superiori ad una
certa soglia sono riportate in ordine
decrescente
Possiamo guardarle per vedere se hanno un
senso biologico ( > omologia)
Se non lo identifichiamo guardiamo l’E value
(significatività statistica)
E value: significatività statistica
• Attesa (Expectation) di trovare PER CASO uno
Score come quello osservato
E value: significatività statistica
Non si interpretano come p values dove
p < 0.05
sono generalmente considerati significativi
Regola generale
E values < 10-6 sono molto probabilmente significativi.
10-6 < E values < 10-3 meritano una seconda occhiata.
E values < 10-3 andrebbero scartati (ci aspettiamo di trovare 0.001
sequenze non correlate alla nostra-falsi positivi- che ottengono un
punteggio superiore a quell’S).
BLAST
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