Mantovani/Maranghi - Studi tossicologici [PDF

Nuovi possibili indicatori
negli studi tossicologici
Alberto Mantovani
Francesca Maranghi
Dipartimento di Sanità Alimentare ed Animale, ISS
[email protected], [email protected]
http://progetti.iss.it/inte/
Indicatori negli studi tossicologici
- Generali (es. incremento ponderale)
- Funzionali (es. neurocomportamentali)
- Morfologici (es. istologici)
NUOVI
- Modificazioni quali-quantitative (microarray,
PCR) della trascrizione genica, della espressione
di proteine (es. Western Blot)
Livello osservazionale: metabolismo cellulare
Focalizzarsi su un aspetto specifico
per capire alcuni problemi generali
L’uso di strategie basate sulla trascrittomica
(microarray + PCR)
per la valutazione del rischio di
INTERFERENTI ENDOCRINI
(IE, http://progetti.iss.it/inte/)
Crescono i dati
che uso nella
- Identificazione di IE
- Caratterizzazione di meccanismi
- Sensibilità (basse dosi; precoce osservazione)
- Specificità (“signatures” caratteristiche per determinati
meccanismi)
- Markers per comprendere
a) esposizione combinate (miscele)
b) interazioni di IE con altri fattori
PROBLEMI
1) Evidenziazione di cluster che comprendono
- Geni specifici per un determinato meccanismo
(signatures) (es. Bisfenolo A, agonista di ERa
in MCF-7 ed in confronto con E2, Singleton et
al., Environ Res 2005)
- Cascate di geni che vengono modulati quando
si interagisce con un recettore nucleare (es. AR)
con effetti su fattori di trascrizione, cascate
enzimatiche, apoptosi
Espressione genica in testicoli di topo
neonato trattati con androgeni
(Zhou et al., Biology of Reproduction, 2005)
- Geni a risposta rapida (ligando-AR attivato–ARE):
manca sintesi proteica de novo
- Geni a risposta ritardata: interazione con cofattori
sintesi proteica de novo (SRC1: attivazione dei
segnali per attivazione di recettori nucleari)
- Geni a risposta secondaria: non hanno ARE,
rispondono ad altri fattori regolati da AR
PROBLEMI (2)
2) Significato in ambito tossicologico
- Necessità di studi sperimentali in cui si
valuta l’espressione genica nell’ambito di
relazione dose-risposta
tempo di esposizione
- Necessità di dati per rafforzare con nuovi
approcci biomolecolari le strategie di testing
tossicologico (es. linee guida OECD)
PROBLEMI (3)
3) Interpretazione biologica
Modulazione dell’espressione genica:
- Allostasi riassestamento di una condizione
fisiologica turbata nella sua omeostasi
- Trascrittomica: risposta più rapida, sensibile
(dose/tempo), complessa da interpretare
- Proteomica: risposta direttamente correlata
all’effetto
Xenobiotici e meccanismi
di regolazione
Trascrizionale/post-trascrizionale
(S. Chodhuri, Tox.Mech.Methods, 2005)
- Es. Metallotioneina (MT, proteina protettiva nei
confronti di metalli pesanti)
Epatocita: umano > topo, regolazione trascrizionale
Esposizione a Cd: amplificazione genica di MT
- Es. promotori alternativi tessuto-specifici: fattori
ormonali modulano espressione nei tessuti di aromatasi
Xenobiotici e meccanismi
di regolazione (2)
- Es. Alternative splicing: 2-5 Esanedione nelle cellule
del Sertoli: Stem cell factor dalla forma legata alla
membrana alla forma solubile
- Es. micro-RNA: regolazione traslazionale, importante
durante lo sviluppo e differenziazione (2% dei geni
umani sinora)
(Alvarez-Garcia & Miskea, Development, 2005)
Xenobiotici e meccanismi
di regolazione (3)
- Es. degradazione di mRNA: ipossia, diabete
stabilizzano CYP2E1 con aumento dello stress
ossidativo
- Es. Coattivatori; importanti per tutti i fattori
(IE) che interagiscono con i recettori nucleari:
Differenze fra tessuti diversi
in vitro (linee stabilizzate!) e in vivo
Xenobiotici e meccanismi
di regolazione (3)
- Es. fattori specifici trascrizionali (NF_KB: stress
ossidativo, infiammazione, apoptosi)
- Es. Retroelementi (es. retrovirus endogeni ERV):
regolazione di geni adiacenti, suscettibile
all’ambiente cellulare (differenziazione, metilazione
del DNA), citochine, retinoidi, steroidi
(Taruscio & Mantovani, Cytogenet. Genome Res., 2004)
Complessità degli effetti
- IE (ant)agonisti recettoriali:
Interazioni fra recettori nucleari, es. ftalati che sono
agonisti del recettore non”ligando-specifico” PXR che
attiva CYP3A (Wyde et al., Toxicol Sci. 2005)
Interazioni di IE con più recettori, es. organoclorurati
(Villa et al., Toxicol Appl Pharmacol. 2004)
Complessità dei bersagli
- Tessuti con vari tipi cellulari (es. testicolo): espressione
di AR necessaria in cellule del Sertoli, Leydig e mioidi
peritubulari, non necessaria nell’epitelio germinale
- Fasi dello sviluppo: espressione di AR nel ratto dal
giorno 15 di gravidanza in cellule mioidi, dal giorno 5
postnatale nelle cellule del sertoli
(You & Sar, Endocrine, 1998)
Complessità dei bersagli (2)
- Alimentazione dei roditori da laboratorio: la presenza
nella dieta di vegetali contenenti fitoestrogeni (es.
soia) modula l’espressione di alcuni geni rilevanti per
l’omeostasi endocrina (es. IGF-1 e Grhr)
anche se non di geni (es. PR) notoriamente attivati
mediante l’interazione con i recettori estrogeni (Naciff
et al., Environ Health Perspect., 2004)
Predittività
- Valutazione dei dati di “post-genomica” in confronto con
pietra di paragone dei parametri convenzionali (funzionali,
istologia) (Pathway Mapping, Phenotypic Anchoring:
Moggs, Toxicology, 2005)
- I dati di trascrittomica/proteomica portano ad una
maggiore attenzione verso i meccanismi di regolazione
(Perturbazione dei sistemi di segnalazione: systems
toxicology Heijne et al., Expert Rev Proteomics. 2005
Prospettive per l’uso nella
valutazione tossicologica
- Impressionante quantità di piattaforme/kit disponibili
- Riproducibilità interlaboratorio: robustezza del sistema,
confrontabilità delle procedure di normalizzazione
(SNOMAD: pevsnerlab.kennedykrieger.org/;
SAM: www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM/)
- Validazione di sistemi per la gestione ed interpretazione
di grandi quantità di dati
- Necessità di studi interlaboratorio con sostanze a
meccanismo noto
- Valgono il costo ?
Prospettive per l’uso nella
valutazione tossicologica
“firme” di meccanismi
Sistemi rapidi e sensibili in vitro
- per screening (la sostanza X è un IE ?)
- per interagire con altri sistemi (es. QSAR)
Intelligent, mechanism based, testing stragies
(Combes & Balls Altern Lab Anim. 2005)
- per indirizzare i complessi test in vivo a lungo
termine, es., il test a 2 generazioni (OECD 416):
quali dei tanti parametri ?
Prospettive per l’uso nella
valutazione tossicologica
- Possibili biomarcatori di dose efficace (e suscettibilità ?),
es. pesticidi
basse dosi di Fenbuconazolo –inibitore di aromatasi- e
malathion –organofosforico sospetto IE- in cellule umane
(Mankame et al., Toxicol Ind. Health, 2004); Gwinnet al.,
Environ Health Perspect. 2005)
- Miscele vs. loro componenti (Oberemm et al., Toxicol Appl
Pharmacol. 2005) (un esempio: esposizione multipla a IE
persistenti e che bioaccumulano)
capire i meccanismi per una ricerca traslazionale
Grazie per l’attenzione!
Alberto Mantovani
[email protected]
Francesca Maranghi
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progetti.iss.it/inte