Lisa Branca

LAM biologia e musica
L’influenza della musica sulle cellule di lievito
Docenti responsabili:
Laura De Biasio e Francesca Dellea
Autore:
Lisa Branca
Liceo di Locarno 2013/2014
Lisa Branca
L’influenza della musica sulle cellule di lievito
LAM, Liceo Locarno
1. ABSTRACT
4
2. PREMESSE
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3. INTRODUZIONE
3.1 L’Effetto Mozart
3.2 La musica
5
7
4.CARATTERISTICHE DELL’ORGANISMO
4.1 Introduzione
4.2 Caratteristiche principali
4.3 Metabolismo cellulare eucariote
4.3.1 L’energia libera di Gibbs
4.3.2 ATP (adenosina trifosfato)
4.3.3 ATP: una molecola che permette alle reazioni non spontanee di avvenire
4.3.4 Respirazione cellulare e fermentazione
4.3.5 Condizioni di coltura per le cellule di lievito
4.3.6 La glicolisi
4.3.7 La fermentazione
4.3.8 Il destino del piruvato dopo la glicolisi
4.3.9 Coenzimi NAD+-NADH
4.3.10 Meccanismo di reazione del complesso NADH-NAD+
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5. PARTE SPERIMENTALE
5.1 Premessa
5.2 Metodologia e condizioni di coltura
5.2.1 Determinazione della torbidità della coltura
5.2.2 La legge di Lambert-Beer
5.2.3 Il colorimetro
5.2.4 L’influenza del saccarosio sulla tramittanza
5.2.5 Determinazione della mortalità cellulare
5.2.6 Aggregazione cellulare in una coltura
5.2.7 Il blu di tripano
5.2.8 La camera di Neubauer
5.2.9 Come usare la camera di Neubauer per il conteggio cellulare
5.2.10 Il saccarosio
5.2.11 Determinazione della concentrazione ideale di saccarosio
5.2.12 L’influenza della musica sulla coltura
5.2.13 La massa di una cellula di lievito
5.2.14 Calcolo della biomassa
5.2.15 Determinazione della CO2 e dell’etanolo prodotti
5.2.16 Determinazione del valore di pH
5.2.17 Il valore di pH
5.3 Risultati
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5.3.1 Massa di una cellula di lievito
5.3.2 Risultati inerenti la biomassa della colture in assenza di musica
5.3.3 Crescita di una coltura in presenza di musica
5.3.4 Andamento di una coltura con esposizione alla musica
5.3.5 Esperimento di controllo
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6. CONCLUSIONI
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7. BIBLIOGRAFIA
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8. GLOSSARIO
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9. RINGRAZIAMENTI
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1. ABSTRACT
Si parla sempre di più di utilizzo della musica in varie terapie curative; anche se la sua efficacia
come terapia alternativa non è ancora scientificamente provata, la scienza ha invece dimostrato che
la musica ha molteplici effetti sulla sfera emotiva dell’uomo, ne influenza per esempio l’umore, la
concentrazione e anche le capacità cognitive.
Lo scopo di questo LAM consiste nel dimostrare se e quanto la musica riesca ad influenzare la
produzione di CO2 ed etanolo (fermentazione alcolica) da parte di cellule di lievito (Saccharomyces
cerevisiae).
Questo lavoro, preceduto da un’introduzione teorica sulle caratteristiche fisiche e biochimiche delle
cellule di lievito, si basa principalmente su dati sperimentali ottenuti in laboratorio, i quali andranno
ad analizzare scientificamente l’influenza della musica sulla crescita cellulare.
Grazie a questo lavoro ho avuto la possibilità di approfondire temi interessanti inerenti al
metabolismo delle cellule di lievito e alle tecniche di laboratorio usate per la parte sperimentale, ciò
mi ha fatto rendere conto delle difficoltà che possono sorgere da lavori di questo tipo; nonostante
ciò gli esiti degli esperimenti hanno dimostrato che la musica ha un’influenza sulla crescita
cellulare. Questa relazione tra musica e metabolismo avvalora le ipotesi degli studi che vedono la
musica come una soluzione applicabile a vari campi.
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2. PREMESSE
La mia idea, una volta a conoscenza di essere stata inserita nel LAM di biologia e musica, era sin
dal principio di svolgere un lavoro di tipo sperimentale. La possibilità di svolgere un LAM di
questo genere ha suscitato un forte interesse in me, in quanto interessata, oltre che alle materie
scientifiche, agli esperimenti in laboratorio e alla possibilità di svolgere un lavoro diverso dagli
altri, in cui poter inserire qualcosa di pratico e originale.
Il seguente LAM è stato frutto di un lavoro che si è rivelato essere, come molti lavori di questo tipo,
più complicato e problematico di quanto avessi previsto, ma che alla fine, spero, ha comunque
portato risultati che mi permetto di reputare abbastanza interessanti, nonostante appunto i problemi
tecnici e logistici emersi.
Se non altro quest’esperienza, anche se non ho potuto avere tutti i dati che avevo previsto di
ottenere, mi ha dato modo di immedesimarmi, anche se solo per un’infima parte suppongo,
nell’arduo ruolo del ricercatore, il quale si vede spesso costretto a investire un sacco di tempo a
sperimentare e tentare nuove pratiche, non sempre ottenendo gli esiti sperati.
3. INTRODUZIONE
Innanzitutto è necessario spiegare perchè si è deciso di svolgere un LAM di questo tipo; come già
annunciato, gli studi sulla musica e sulla sua capacità di condizionare l’uomo a livello biochimico
sono sempre più frequenti e i risultati mostrano sempre di più quanto l’organismo umano non sia
indifferente all’esposizione della musica.
3.1 L’Effetto Mozart
L’Effetto Mozart è una teoria elaborata attorno agli anni ’90; essa mette in relazione la capacità
intellettiva dell’uomo con la musica di Wolfgang Amadeus Mozart, con l’ipotesi che la musica
classica possa avere degli effetti performanti sulle capacità cognitive delle persone.
Più recentemente questi esperimenti sono stati praticati, non più solo sull’influenza della musica
classica sull’uomo, ma anche sui vegetali. I risultati, anche se tutt’ora non sono accertati al 100%,
mostravano che la musica di Mozart influiva positivamente sulla germogliazione delle sementi; in
particolare si è notato che i semi sottoposti a musica germogliavano più rapidamente rispetto a
quelli che germogliavano in assenza di musica. Inoltre, successivamente è stato fatto anche un
paragone tra musica classica e musica heavy metal, per vedere se i risultati ottenuti sul effetto
Mozart fossero realmente attribuibili alla musica classica. Gli esiti dell’esperienza furono che le
piante sottoposte alla musica heavy metal crescevano in direzione opposta alla direzione di
provenienza della musica, le piante sottoposte alla musica di classica invece crescevano in direzione
della provenienza della musica.
Il lievito è una cellula di tipo eucariote, esattamente come quella umana, dunque vi è una certa
affinità tra le nostre cellule e quelle di lievito, questa similitudine strutturale permette di paragonare
in maniera più efficiente i risultati ottenuti con le cellule di lievito adattandoli alle cellule umane.
Il lievito inoltre è un tipo di cellula facile da coltivare e che si riproduce velocemente. Non richiede
ambienti o condizioni particolari in cui svilupparsi, per tali ragioni è considerato il modello
universale di cellula eucariote da coltura in vitro.
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Ciò che si andrà a verificare in questo lavoro si basa su un articolo della Metabolomics1, il quale
ipotizzava gli effetti che la musica poteva avere sulle colture di cellule di lievito; ne influenzava il
metabolismo, aumentandone il tasso di fermentazione.
Gli esperimenti che seguiranno sono stati svolti in ambiente anaerobico. Questa scelta è stata posta
al fine di limitare al minimo le possibili variabili di cui tenere conto durante l’esperimento;
l’ambiente aerobico infatti comporta la respirazione cellulare come via metabolica la quale è molto
più complicata della fermentazione. Inoltre in un ambiente aerobico ci sono molti più fattori in
gioco, i quali complicano gli esperimenti in laboratorio, rischiando anche di influenzarne gli esiti e
di falsare i risultati ottenuti.
1
http://link.springer.com/article/10.1007/s11306-011-0360-x
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3.2 La musica
È scientificamente provato che la musica influenzi non solo la sfera emotiva umana ma anche
l’attività cellulare svolta nel nostro organismo, per tali ragioni è sempre più utilizzata anche nelle
terapie curative, soprattutto in campo neurologico e psichiatrico 2.
In tale ambito si è inequivocabilmente dimostrato che il suono influisce sulla struttura fisica e
sull'energia delle cellule, distruggendo le cellule del cancro. Il ricercatore, compositore e
musicoterapeuta Fabien Maman, per esempio, ha stabilito delle correlazioni tra note musicali e i
punti dell'agopuntura nell'applicazione in biologia cellulare. Le conclusioni dei suoi studi, svolti
nell’università parigina di Jessieu, mostravano che il suono provocava sempre un cambiamento
notevole nelle cellule e nei loro campi magnetici. I risultati dei suoi esperimenti vengono espressi
nel modo seguente:
“Durante gli esperimenti si è notato che in assenza di suono le cellule sul vetrino tendevano ad
espandersi nel tentativo di aderire al supporto ma, a differenza della condizione di presenza di
suono, la crescita cellulare era più limitata. Senza suono infatti il diametro esterno delle cellule era
compreso tra i 10 e gli 11 millimetri, mentre con il suono esso oscillava tra gli 11 e i 19 millimetri.
Sotto l'influsso del suono la cellula in pratica raddoppiava di volume; in assenza di suono invece
essa non raggiungeva tali dimensioni neppure dopo 45 minuti in cui il diametro misurava solo 14
millimetri.”3
Fig 1, cellule cancerose in assenza di suono4
Fig 2, cellule cancerose in presenza di suono 5
Recenti studi, affermano ulteriormente che le alte e basse frequenze sonore influenzano la crescita
cellulare e la produzione di biomassa.
2 http://brainfactor.it/index.php?option=com_content&view=article&id=312:cervello-e-musicoterapia-brainfactor-
intervista-livio-bressan&catid=22:le-interviste-di-brainfactor&Itemid=13
3Citazione
4Figura
5Vedi
tratta dall’articolo pubblicato sul sito www.amadeux.net/
tratta da www.amadeux.net
nota 34
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Secondo tali ricerche, nell’esempio specifico del lievito, la musica, grazie alle sue frequenze,
sarebbe in grado di modificare il metabolismo basale cellulare, aumentando la crescita cellulare
della coltura di lievito.
Sottomettendo delle colture di Saccharomyces cerevisiae alla musica si vuole dimostrare se essa
influenza la crescita cellulare e in quale quantità.
La musica scelta, tra i vari generi, è stata quella classica; si è deciso per la Sinfonia 40 di Mozart, in
quanto Mozart è stato già frequentemente utilizzato in altri esperimenti del settore analogo. Un
esempio noto è l’Effetto Mozart sui vegetali (vedi pagine precedenti).
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4. CARATTERISTICHE DELL’ORGANISMO
4.1. Introduzione
Esistono numerosi generi e specie di cellule di lievito. Alcuni tipi, come la Candida albicans,
possono causare infezioni nell'uomo, quella comunemente conosciuta è la candidosi. Un altro
lievito, la Malassezia pachidermatis, è causa di dermatite e otite nel cane e nel gatto.
Le cellule protagoniste di questo lavoro sono i Saccharomyces cerevisiae, comunemente conosciute
come cellule di lievito; esse sono entrate nella vita degli uomini da una considerevole quantità
d’anni.
Il lievito è stato il primo sistema di lievitazione usato dall’uomo; fin dai tempi degli antichi egizi
infatti se ne faceva uso e viene tuttora utilizzato per innumerevoli attività culinarie, sia in ambito
casalingo sia in ambito professionale.
I Saccharomyces cervisiae, sono funghi unicellulari. Si tratta della specie di lievito più importante
nell'ambito dell'alimentazione umana e il suo utilizzo è noto per la panificazione e la produzione di
birra e vino. È infatti presente nelle purine, contenute nella superficie degli acini d’uva.
4.2. Caratteristiche principali
Le cellule di Saccharomyces cerevisiae (vedi fig.3) hanno una forma ovale/ellitica e un diametro di
5-10 µm. Si riproducono attraverso un processo di gemmazione, ovvero un tipo di riproduzione
asessuata. Dal peduncolo di una cellula si sviluppa un’escrescenza che, una volta separatasi da esso,
diventerà un nuovo organismo del tutto uguale alla cellula madre; tale riproduzione avviene senza
ricombinazione genetica. Il tempo di generazione di nuove cellule è di circa due ore. La coltura
mostra dunque cellule del tutto identiche facilitando lo studio del ciclo cellulare, ma, in quanto
eucariote, presenta la complessità della struttura interna di piante, animali e protisti, anche essi
eucarioti.
Fig. 3, cellule di lievito viste al microscopio elettronico 6 6
http://www.torinoscienza.it/multimedia/lievito_9867
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4.3 Il metabolismo cellulare eucariote
Definizione: Insieme delle reazioni chimiche che avvengono in una cellula o in un organismo
pluricellulare. Esso comprende tre settori: catabolismo, ovvero l’insieme delle reazioni di
demolizione delle molecole, anabolismo; insieme delle reazioni di sintesi delle macromolecole e
metabolismo energetico in cui l’energia liberata dalle reazioni è usata per produrre ATP, che
fornisce l’energia necessaria per far avvenire le reazioni anaboliche 7.
Fig. 4, cellula eucariote 8
La fig. 4 rappresenta la struttura interna di una qualsiasi cellula eucariote.
Il nucleo è sede del DNA cellulare, si tratta di una struttura caratteristica della cellula eucariote.
Mitocondri, reticolo endoplasmatico, apparato di Golgi e lisosomi sono organelli, anche questi
presenti solo nelle cellule di tipo eucariote. Nel mitocondrio avviene, in presenza di ossigeno, la
respirazione cellulare o, in sua assenza, la fermentazione. Si tratta di processi indispensabili per la
crescita cellulare e la sua sopravvivenza. Grazie ad essi si ottiene una molecola organica vitale per
le cellule: l’ATP, di cui si parlerà nei capitoli successivi.
7
Lilia Alberghina, Franca Tonini, Biologia Fondamenti e nuove frontiere, Arnoldo Mondadori Scuola, 2005.
8http://www.difossombrone.it/microbiologia/main04eucariote_procariote.htm
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Il reticolo endoplasmatico, suddiviso in liscio e rugoso, è un organello composto da sacche
collegate l’una con l’altra, all’interno di esse troviamo numerosi enzimi. Il reticolo endoplasmatico
è un organello polifunzionale; il reticolo endoplasmatico liscio (R.E.L) ha una funzione
prevalentemente di sintesi lipidica e detossificazione da sostanze nocive. Il reticolo endoplasmatico
rugoso (R.E.R), così chiamato per la presenza di ribosomi sulla sua membrana, ha una funzione
nella sintesi proteica, in quanto rielabora i peptidi neoformati dai ribosomi all’interno di sacche
cave contenenti numerosi enzimi, inglobandoli in vescicole che verranno inviate all’apparato di
Golgi, un altro organello composto anch’esso da sacche ripiegate e contenenti enzimi, ma senza
ribosomi legati alla membrana, qui le vescicole contenenti peptidi modificati, tramite ulteriori
modifiche da parte di enzimi, diverranno proteine complete pronte ad essere usate o esocitate dalla
cellula.
I ribosomi, presenti anche nelle cellule di tipo procariote (monere), sono strutture molecolari che
partecipano alla sintesi proteica (traduzione). Esistono due tipi di ribosomi: liberi nel citoplasma o
legati alla membrana.
4.3.1 L’energia libera di Gibbs
Quando si parla di metabolismo si parla principalmente di reazioni chimiche. A tale scopo può
risultare interessante capire cosa permette a queste reazioni indispensabili alla vita di avvenire.
Non tutte le reazioni sono spontanee; in un sistema chimico infatti l’energia si trova sotto forma di
energia di legame, quando questi legami si rompono rilasciano energia, quando la reazione in un
dato sistema termina si ha un’energia di legame finale, che può essere maggiore o minore di quella
iniziale. Quando l’energia finale di legame è minore di quella iniziale significa che il sistema ha
perso energia, la reazione risulta pertanto spontanea, ne sono un esempio la formazione dell’ATP
(vedi pagine successive). In caso contrario; se l’energia finale è maggiore di quella iniziale, ovvero
il sistema assorbe energia sotto forma di calore, significa che la reazione non è spontanea.
L’energia libera di Gibbs, espressa con il simbolo G, è una funzione di stato che descrive la quantità
di energia disponibile in un determinato luogo e fa parte di uno dei tre pilastri portanti della
termodinamica, i quali descrivono le variazioni di energia che si verificano in una data reazione.
L’energia libera di Gibbs dipende da una serie di fattori quali entalpia (△H), entropia (△S) e
Temperatura (T). Essa viene descritta secondo la seguente equazione:
Se la variazione di energia libera di Gibbs in una reazione risulta negativa (△G<0) la reazione
avverà in maniera spontanea.
Se la reazione procede con un’energia libera di Gibbs positiva (△G>0) allora la reazione non sarà
spontanea, tuttavia potrà comunque avvenire nel caso in cui le venga fornita la giusta energia;
accoppiandola per esempio ad altre reazioni spontanee.
Infine, quando l’energia libera di Gibbs risulta nulla in un sistema (△G = 0), significa che la
reazione è già avvenuta ed il sistema è all'equilibrio.
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Per permettere ad una reazione di avvenire bisogna dunque avere △G<0, in modo che la reazione
risulti spontanea, questo dipenderà strettamente dai valori di entalpia ed entropia, da cui △G
dipende.
Un tipo di reazione spontanea è ad esempio la combustione, una reazione non spontanea può essere
per esempio l’elettrolisi.
Nell’esempio specifico della fermentazione alcolica il passaggio da glucosio a piruvato è una
reazione esoergonica, la quale libera 2 molecole di ATP; in complesso ha un delta
△G = -29,6 KJ /mol, si tratta dunque di una reazione spontanea.
4.3.2 ATP (adenosina trifosfato)
L’ ATP (fig. 5) è una molecola che viene costantemente idrolizzata e rigenerata in modo da garantire
un’efficiente fornitura di energia libera di Gibbs, che viene messa a disposizione nella reazione, al
metabolismo cellulare. Si tratta di uno dei reagenti necessari per la sintesi dell’RNA,
l'accoppiamento della reazione di idrolisi dell'ATP, con altre reazioni non spontanee, permette la
sintesi di biomolecole o la loro degradazione (anabolismo e catabolismo), per queste ragioni si può
affermare che questa importantissima molecola sia alla base di ogni processo metabolico. Esso
viene idrolizzato ad ADP (adenosina difosfato) che viene riconvertito in ATP mediante vari processi
(vedi fig. 6).
!
!
9
Fig. 5, molecola di ATP 9
CAMPBELL REECE-TAYLOR-SIMON-DICKEY, Biologia, secondo biennio e quinto anno.
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Fig. 6, sintesi e idrolisi dell’ATP 10
L’ATP è in continuo equilibrio con la sua forma idrolizzata (ADP), entrambe le molecole risultano
cineticamente stabili, anche se l’ATP è un complesso ad alta energia. La reazione di idrolisi dell’
ATP ha un △G<0 e risulta esoergonica; in modo da fornire energia sufficiente a far avvenire
reazioni non spontanee (con G>0).
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CAMPBELL REECE-TAYLOR-SIMON-DICKEY, Biologia, secondo biennio e quinto anno.
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L'ATP, come già annunciato, è richiesto nella maggior parte di tutte le reazioni metaboliche
endoergoniche, anche la sua sintesi richiede △G>0.
Esso viene prodotto secondo la reazione endoergonica:
ADP + Pi + E => ATP
4.3.3 ATP: una molecola che permette alle reazioni non spontanee di avvenire
La reazione inversa alla formazione di ATP, ovvero l’idrolisi dell’ATP (reazione spontanea),
consente il trasferimento di energia utile per i vari processi metabolici che necessitano di essa,
ovvero le reazioni che non avvengono spontaneamente; un esempio classico sono i molteplici
enzimi, presenti in ogni organismo vivente, il cui lavoro spesso necessita ATP per avvenire. La
reazione di idrolisi dell’ATP è anch’essa mediata da un enzima: l’ATPasi e comporta l’idrolisi del
legame fosfoanidrico dell’ultimo gruppo fosforico della catena, tale reazione porta alla formazione
di una molecola di ADP (adenosina difosfato) e ad una di Pi (HPO42-) e al trasferimento di ΔG =
-30,5 KJ/mole.
Reazione di idrolisi dell’ATP in ADP:
ATP4- +H2O --> ADP3- + P + H+ ΔG=-30,5 KJ/mole (esoergonica)
4.3.4 Respirazione cellulare e fermentazione
Grazie alle informazioni sino ad ora acquisite sulle indispensabili componenti del metabolismo
cellulare (enzimi, coenzimi, ATP,…) ci si può addentrare nel tema che caratterizza la crescita e lo
sviluppo delle cellule Saccharomyces cerevisae, organismi anaerobici facoltativi, infatti è proprio
grazie a questo processo che molte cellule (lieviti, batteri) ricavano l’ATP necessario a svolgere
molte funzioni vitali.
La fermentazione è, come già annunciato, un processo biochimico che si svolge in anaerobiosi,
ovvero in assenza di ossigeno.
Un organismo anaerobico facoltativo è in grado di procurarsi l’ATP necessario per adempiere le
proprie necessità metaboliche sia mediante il processo di fermentazione, sia, in presenza di ossigeno
(O2), mediante il processo di fosforilazione ossidativa.
In condizioni aerobiche, in presenza dunque di ossigeno, prevale la respirazione cellulare. Se nel
substrato la concentrazione di zuccheri supera i 9 g/L si ha la prevalenza dell'attività fermentativa.
Questo fenomeno viene definito effetto Crabtree, il quale limita la crescita del lievito ed è perciò
normalmente indesiderato; questo effetto può essere ridotto con una diluizione che permette di
minimizzare l’eccesso di zuccheri.
I Saccharomices cerevisiae, in condizioni anaerobiche, ricavano energia grazie al processo di
fermentazione alcolica.
In questo lavoro, come già spiegato, per semplificare gli esperimenti e rendere i risultati più precisi
ed affidabili possibile, si è provveduto a sottoporre la coltura di lieviti ad un ambiente anaerobico,
facendo dunque prevalere l’attività fermentativa.
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In letteratura, inoltre, molti dati relativi ad esperimenti con cellule di lievito riportano un elevato
tasso di apoptosi nelle colture in presenza di ossigeno, che, dopo una certa concentrazione, risulta
tossico per l’organismo e ne determina il suicidio.
Il Saccharomyces cerevisiae è un organismo sensibile alla pressione. Quando la pressione nei
contenitori per la lievitazione supera le 8 atmosfere, esso comincia a mostrare degenerazioni.
Questo effetto viene anche utilizzato per il controllo del processo di lievitazione.
4.3.5 Condizioni di coltura per le cellule di lievito
Le cellule di Saccharomyces cerevisae possono essere coltivati sia in terreni liquidi che in terreni
solidi. In questo lavoro si è preferito usare il terreno liquido per semplificare la misurazione dei vari
parametri, in quanto, con i mezzi dati, risultava più semplice utilizzare un terreno di coltura liquido.
Per l’ambiente di coltura, come già spiegato, si è optato per l’ambiente anaerobico; a tale scopo la
coltura è stata posta in un contenitore a chiusura ermetica, in modo da non far entrare ossigeno.
Il volume complessivo della coltura di lievito era di 200 mL. Tutti i dati ricavati nelle esperienze si
riferiscono a 1 mL della soluzione di lievito testata. I dati con le sonde non sono stati sempre
disponibili come era previsto, si è quindi provveduto a ottenere dei dati alternativi per cercare di
colmare le lacune.
Ogni volta che è stata fatta una misurazione di un determinato parametro si è inoltre provveduto ad
agitare bene il contenuto del contenitore per impedire che le cellule di lievito si depositassero tutte
sul fondo e sfalsassero i risultati del campione prelevato.
Nel processo di fermentazione alcolica vengono impiegati molti enzimi. Ogni organismo necessita
di particolari condizioni nelle quali poter sopravvivere e riprodursi; uno dei motivi principali alla
base di queste necessità sta proprio negli enzimi, i quali sono fortemente influenzati dai fattori
ambientali. Generalmente ci si riferisce a:
1. La temperatura
2. Il valore di pH
3. La concentrazione del substrato
4. La concentrazione dell’enzima
È importante conoscere questi fattori (soprattutto i primi due), poiché possono offrire informazioni
estremamente utili sulla sopravvivenza e sulle necessità ambientali delle cellule di Saccharomices
cerivisiae.
Queste informazioni potranno motivare determinati risultati derivati dagli esperimenti che verranno
svolti in seguito su tali cellule.
1. La temperatura
L’aumento di temperatura ha due principali effetti sugli enzimi; l’aumento della velocità di reazione
e la denaturazione irreversibile proteica.
Un modesto aumento della temperatura provoca un aumento di agitazione molecolare che consegue
un aumento della velocità di reazione. Questi effetti possono avere importanti conseguenze sulla
coltura; un aumento della temperatura e quindi della velocità di reazione determina un aumento
dell’attività metabolica, delle reazioni di idrolisi, ecc, che determinano quindi una crescita più
rapida della coltura.
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Temperature troppo elevate tuttavia provocano una denaturazione irreversibile delle proteine, vedi
fig. 8, le quali non sono più in grado di lavorare in modo efficiente e di riconoscere i propri
substrati.
La temperatura ottimale è generalmente quella propria dell’ambiente cellulare, nel caso specifico
delle cellule di lievito si tratta di una temperatura di 30 ℃. In questa condizione le cellule di lievito
si dividono circa ogni 70-90 minuti, necessitano più tempo delle cellule batteriche (20 minuti).
Fig. 8, cambio di conformazione dell’enzima 11
2. Il valore di pH
Esistono limiti ben definiti nei quali un enzima è in grado di funzionare correttamente, le piccole
variazioni di pH in genere riducono l’attività enzimatica, mentre le variazioni ampie denaturano
l’enzima.
Solitamente il pH ottimale è intorno a 7 (neutro); ovviamente esistono delle eccezioni, come ad
esempio per gli enzimi digestivi, che possono necessitare pH molto acido o pH basico oltre che pH
neutro. Le cellule di lievito hanno una scarsa resa a pH bassi. Non si sono trovati dati precisi sul pH
ideale allo sviluppo delle cellule di Saccharomyces cerevisiae, in quanto ogni enzima ha il suo pH
ottimale, ma la letteratura suggerisce che il pH ottimale sia situato tra 5 e 6.
Una propietà della CO2 infatti è quella, in soluzione acquosa, di legarsi con H2O per formare H2CO3
(acido carbonico), ovvero un acido diprotico (in grado di liberare due protoni) che, in soluzione
acquosa, libera ioni H+, i quali vanno a diminuire il valore di pH, ovvero rendono la soluzione più
acida.
In questo modo possiamo utilizzare anche la CO2 per le sue caratteristiche acide in soluzione
acquosa, infatti maggiore è la crescita cellulare, maggiore sarà il tasso di fermentazione (che
consiste in una maggiore liberazione di CO2 in soluzione acquosa) e minore sarà il valore di pH
relativo alla soluzione.
11
https://www.google.it/#q=denaturazione+enzima
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4.3.6 La glicolisi
La glicolisi è una catena metabolica che caratterizza la prima parte del catabolismo cellulare, si
tratta di un processo che avviene nel citoplasma di ogni cellula e viene divisa in 10 tappe, vedi
fig. 9.
La glicolisi è la prima fase della fermentazione e permette alla cellula di generare 2ATP e 2NADH,
questo processo è presente in tutti i tipi di cellule, sia aerobiche che anaerobiche. La glicolisi
consiste nella catalisi del glucosio, che viene ossidato a 2 molecole di piruvato, una molecola
formata da 3 atomi di carbonio.
Il riassunto globale della glicolisi può essere descritto in 2 fasi principali.
Nella prima fase, conosciuta come fase preparatoria o fase di investimento energetico (che
corrisponde alle prime 5 tappe della glicolisi), la molecola di partenza, un monosaccaride come il
glucosio o un suo isomero, viene fosforilata da 2 molecole di ATP, con la formazione della
gliceraldeide 3-fosfato.
Successivamente, durante il corso della seconda fase, la gliceraldeide 3-fosfato viene defosforilata
da 4 molecole di ADP e dunque trasformata in piruvato; il guadagno energetico di questa fase
corrisponde a 4 molecole di ATP e a 2 di NADH. Il guadagno globale della glicolisi corrisponde
quindi a 2 molecole di ATP e a 2 molecole di NADH.
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Figura 9, le 10 tappe della glicosi 12
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CAMPBELL REECE-TAYLOR-SIMON-DICKEY, Biologia, secondo biennio e quinto anno.
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4.3.7 La fermentazione
Esistono diversi tipi di fermentazione: le più comuni sono la fermentazione alcolica, pilastro
portante nello studio delle cellule di lievito, e la fermentazione lattica, quest’ultima viene svolta da
alcuni batteri lattici per la produzione di formaggi e yogurt, ma in questa ricerca si parlerà
unicamente della fermentazione alcolica.
Prima dell’inizio della fermentazione alcolica (prima della glicolisi) il lievito scinde i disaccaridi
come il saccarosio (C12H22011) in monosaccaridi tramite l’enzima invertasi.
La fig. 10 mostra il processo di condensazione del saccarosio a partire dai suoi monomeri;
α-glucosio e fruttosio.
La reazione di scissione di un disaccaride, in questo caso il saccarosio, avviene come descritta dalla
seguente equazione (con formazione di glucosio e fruttosio; due isomeri):
C12H22O11 + H2O → C6H12O6 + C6H12O6
Fig. 10, sintesi del saccarosio 13
13
http://www.chimica-online.it/download/glucidi/disaccaridi.htm
19
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La fermentazione alcolica, come già annunciato, si svolge in due fasi; la prima è la glicolisi,
precedentemente descritta, la seconda avviene subito in successione alla glicolisi ed è una fase
importante della fermentazione, in quanto la distingue dalla respirazione cellulare. La fig. 11 mostra
schematicamente i possibili destini del piruvato nelle reazioni svolte dai vari organismi nelle varie
condizioni.
La reazione del chimico francese Joseph Louis Gay-Lussac descrive la reazione di idrolisi del
reagente glucosio nei prodotti di scarto etanolo e anidride carbonica.
C6H12O6 → 2 CH3CH2OH + 2 CO2
CH3CH2OH e CO2 sono molecole importanti in questo lavoro, poichè, potendo essere misurate con
le apposite sonde pasco, fungeranno da parametro per verificare l’influenza della musica sulle
cellule di lievito. Infatti una maggiore concentrazione di queste molecole determina una maggiore
attività metabolica e dunque una maggiore crescita cellulare da parte delle cellule in coltura.
Fig. 1114
Immagine tratta da: DAVID L. NELSON M:COX; I principi della biochimica di Lehninger, Zanichelli
2002, Terza edizione.
14
20
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4.3.8 Il destino del piruvato dopo la glicolisi
Esistono molteplici vie che il piruvato può prendere dopo la glicolisi; esse dipendono dall’ambiente
in cui esso di trova (aerobico o anaerobico) e dagli organismi che lo utilizzano. La fig.11, mostra
con chiarezza le possibili vie prese dal piruvato nelle differenti condizioni.
In condizioni aerobiche il piruvato viene decarbossillato e successivamente, dopo essere entrato nel
ciclo di Krebs, scartato sotto forma di CO2 e H2O; lo scopo di questa reazione è di ridurre coenzimi
NAD+ a NADH in preparazione alla fase ossidativa della respirazione cellulare.
In condizioni anaerobiche invece, visto l’ambiente privo di ossigeno, risulta impossibile scaricare
gli elettroni dall’NADH nella fase ossidativa, come avviene per la respirazione cellulare, poiché
manca l’accettore terminale di elettroni, ovvero l’ossigeno, quindi la fase ossidativa non può
compiersi. Gli organismi che vivono in ambienti anossici devono accontentarsi dell’energia ricavata
dalla glicolisi che, globalmente, consiste in due molecole di ATP e due coenzimi NADH.
Anche nella fermentazione è tuttavia necessario un agente che funga da accettore di elettroni.
Risulta infatti indispensabile riossidare NADH a NAD+, in modo da far andare avanti la reazione e
mettere a disposizione nuove molecole NAD+ per un nuovo ciclo di glicolisi. A questo scopo il
piruvato assume il ruolo di agente ossidante, ovvero accettore di elettroni che ossida le due
molecole di NADH in NAD+, con la formazione di 2 molecole di etanolo e 2 molecole di CO2.
Dal grafico sottostante si nota che, per la fermentazione alcolica, la quantità di NADH ossidato è la
stessa della CO2 rilasciato (rapporto 2:2).
Fig. 12, trasformazione del piruvato in etanolo 15
15
LILIA ALBERGHINA, FRANCA TONINI, Biologia Fondamenti e nuove frontiere, volume 1
21
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4.3.9 Coenzimi NAD+-NADH
Una delle principali caratteristiche delle reazioni chimiche dove interagiscono più specie chimiche,
come ad esempio la fermentazione o la respirazione cellulare, è lo spostamento di elettroni, mediato
da particolari molecole chiamate coenzimi, attivi in innumerevoli processi biochimici.
Fig. 13, reazione di ossidazione dell’NADH
I lieviti (e alcuni tipi di batteri) riciclano il NADH e lo convertono in NAD+ (nicotinammide adenin
dinucleotide); questa reazione di ossidazione (fig. 13) risulta indispensabile nel processo di
fermentazione, respirazione e altri numerosi processi cellulari.
4.3.10 Meccanismo di reazione del complesso NADH-NAD+
La figura 14 mostra la reazione di riduzione del coenzima NAD+ nella sua forma ridotta NADH.
Fig. 14, reazione di riduzione di NAD+16
16
http://www.chimicamo.org/chimica-organica/coenzimi.html
22
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Fig. 15, NAD+ (ossidato) 17
L’NAD+ viene ridotto (vedi fig. 15), dagli enzimi deidrogenasi (ossidoreduttasi) che fungono da
agenti riducenti (e da substrati) per tale reazione REDOX e vanno dunque incontro a una reazione
di ossidazione perdendo due protoni H+ e due elettroni. I due elettroni persi dal substrato vengono
trasferiti al coenzima, che si riduce e acquista uno ione idronio dall’ambiente circostante.
Nella forma NADH la molecola perde la sua carica positiva, poiché la carica presente sull’azoto (N)
dell’anello benzenonico della nicotinammide viene neutralizzata.
17
Quest’immagine rappresenta la forma ossidata di NADP (NAD+), con i relativi siti di riduzione (N+) e di attacco del
gruppo fosfato nel processo di riduzione a NADP.
23
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5. PARTE SPERIMENTALE
5.1. Premessa
Questo capitolo riguarda la parte più importante del LAM, in quanto determinerà gli esiti
dell’ipotesi sull’influenza della musica sulle cellule di lievito che si vuole andare a verificare.
Dopo aver acquisito, nel capitolo 2, alcune informazioni utili inerenti alle caratteristiche fisiche e
biochimiche dei Saccharomyces cerevisiae si può proseguire con la parte sperimentale della ricerca,
che consiste in due fasi.
5.2. Metodologia e condizioni di coltura
Prima di descrivere il procedimento svolto in quest’esperimento serve conoscere le tecniche e gli
strumenti usati per svolgere i diversi esperimenti, per poter così meglio interpretare i risultati
ottenuti.
La prima è una fase preparatoria adibita al trovare l’ambiente e le condizioni ideali allo sviluppo
delle cellule di lievito, allo scopo di calcolare, attraverso gli appositi mezzi, i tassi di crescita, di
mortalità e la biomassa, al fine di avere informazioni inerenti all’andamento biologico, chimico e
fisico di una coltura di Saccharomyces cerevisiae.
La seconda fase consiste nell’esporre le colture alla musica classica (Sinfonia 40 di Mozart) facendo
un paragone con le colture non esposte, per determinare se la musica ha un’influenza sullo sviluppo
cellulare.
In particolare, ciò che si andrà ad analizzare, sarà l’attività fermentativa delle cellule di lievito.
Come già precedentemente accennato, il lievito è un organismo anaerobico facoltativo, ciò significa
che a dipendenza dei casi può fare sia la respirazione cellulare aerobica sia quella anaerobica.
Tuttavia, per rendere il lavoro più semplice, si è deciso di eseguire esperimenti in ambiente
anaerobico, al fine di ridurre le variabili che si possono riscontrare sperimentalmente in un ambiente
aerobico.
È lecito preannunciare che quando il lavoro sperimentale è iniziato non si conosceva ancora
l’effetto Crambtree, ovvero non si sapeva che la fermentazione prevalesse con concentrazioni
molari di saccarosio superiori a 9 g/L e che, a condizioni di concentrazione inferiori, prevalesse
invece la respirazione cellulare. Per tali ragioni la concentrazione di saccarosio scelta non è stata in
grado di determinare, almeno fino a quando l’ossigeno era presente nella coltura, la prevalenza di
un’attività fermentativa.
Gli esperimenti sono stati svolti al Liceo cantonale di Locarno, seppure i dati non risulteranno
precisi come quelli ottenibili attraverso un laboratorio specializzato, essi potranno comunque dare
indicazioni attendibili ai fini dell’esperimento.
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5.2.1 Determinazione della torbidità della coltura
Scopo
Lo scopo di questa esperienza è calcolare il valore di trasmittanza con l’ausilio della legge di
Lambert-Beer per ognuna delle 5 soluzioni preparate a una settimana di distanza.
Materiale
Colorimetro
Pipetta
Soluzioni di lievito alle
varie concentrazioni
molari di saccarosio
Procedimento
Si procede con una serie di 5 diluizioni 1/3 di una soluzione di
saccarosio a titolo noto; in ognuna delle 5 soluzioni preparate
viene inserito 1mL di lievito in soluzione acquosa (stessa soluzione
per tutte e 5 le diluizioni), successivamente si sigillano le provette
contenenti le varie soluzioni di lievito e saccarosio.
Si procede inserendo ogni provetta nel colorimetro che provvede
a calcolarne la trasmittanza secondo la legge di Lambert-Beer.
Una volta trovata la soluzione più idonea per proseguire
l’esperimento, ovvero la soluzione la cui trasmittanza risulta più
bassa, si procede con un ulteriore verifica; è opportuno infatti fare
un’ulteriore controllo per verificare che la soluzione scelta sia
veramente la più idonea per lo sviluppo delle cellule di lievito.
Nota: per rendere l’esperimento il più coerente possibile è
necessario verificare se il saccarosio utilizzato per le varie
soluzioni influenza il valore di trasmittanza delle varie soluzioni
preparate.
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5.2.2 La legge di Lambert-Beer
La legge di Lambert-Beer viene usata in ottica e correla la quantità di luce assorbita da un mezzo
allo spessore e alla natura chimica del mezzo attraversato. Tale relazione viene espressa tramite
l’equazione sottostante che rappresenta il valore di trasmittanza (T), ovvero il valore che misura la
quantità di luce assorbita dal mezzo, facendo il rapporto tra luce emessa (I0) e luce trasmessa (I1).
La seguente figura (fig. 16) mostra un esempio dell’applicazione della legge di Lambert-Beer per
un fascio l0 che attraversa un campione a concentrazione c e lunghezza l.
Fig.1618
l = cammino ottico (cm)
α = coefficiente di estinzione molare (1000 cm2 /L)
c = concentrazione (mol/L)
l0 = luce trasmessa
l1 = luce emessa
18
http://www.chimicamo.org/chimica-analitica/assorbimento-di-energia-raggiante-legge-di-lambert-beer-2.html
26
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5.2.3 Il colorimetro
Si tratta di uno strumento in grado di misurare la trasmittanza in percentuale di una data soluzione
a una data lunghezza d’onda.
Fig. 17, colorimetro Pasco
5.2.4 L’influenza del saccarosio sulla tramittanza
In seguito ai valori di trasmittanza ricavati dal saccarosio posto in soluzione acquosa, in assenza
dunque di lievito, si è verificato che esso non influenza il valore di trasmittanza, dunque la
concentrazione di saccarosio non compromette i dati dell’esperimento. Possiamo fare questa
affermazione dal momento che, misurando con il colorimetro la trasmittanza dell’acqua contenente
saccarosio, è risultata una trasmittanza del 100%, ovvero quella dell’acqua.
Questo risultato afferma che tutta la luce emessa è riuscita ad attraversare il liquido e che nessun
fascio di luce è stato assorbito dal reticolo cristallino di saccarosio disciolto in soluzione, come
invece avviene per altri fattori che influenzano sulla torbidità di una soluzione (batteri, lieviti,...).
Il reticolo cristallino del saccarosio si distrugge una volta che il saccarosio è disciolto. Le singole
molecole di saccarosio interagiscono con le molecole d'acqua tramite legami intermolecolari senza
assorbire i raggi luminosi (la soluzione è limpida e trasparente).
Le cellule di lievito invece assorbono una parte della luce.
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5.2.5 Determinazione della mortalità cellulare
Scopo
Si vuole verificare che la concentrazione scelta sia la più adatta allo sviluppo cellulare.
Materiale
Blu di tripano (colorante)
Cellule di lievito in soluzione
Microscopio ottico
Pipetta
Procedimento
Utilizzando un’apposita pipetta Gibson, si preleva una
goccia dal campione che si vuole analizzare posizionandola
sulla camera di Neubauer e coprendola con il vetrino
coprioggetti.
Analizzare dapprima la mortalità del campione che si è
rivelato essere il più idoneo alle esigenze metaboliche dei
Saccharomyces cerevisaie e compararla con la soluzione
che dopo di essa ha mostrato essere la più idonea.
Camera di Neubauer
Vetrino copriogetti
Contatore cellulare manuale
Successivamente mettere una goccia di blu di tripano ad un
lato del vetrino coprioggetti, in modo che venga assorbito
per capillarità al di sotto del vetrino coprioggetti e si fonde
con la soluzione di lievito da analizzare al microscopio.
Infine, utilizzando il contatore cellulare manuale, contare
separatamente le cellule vive (bianche) dalle cellule morte
(blu), osservandole al microscopio 10X.
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5.2.6 Aggregazione cellulare in una coltura
In seguito alle sperimentazioni fatte si è potuta notare un’importante caratteristica fisica nelle
colture di lievito, ovvero che le cellule di lievito tendono a formare degli aggregati. Questo
fenomeno si è potuto verificare spesso nelle colture osservate; a volte l’aggregazione era meno
pronunciata di altre, altre volte ancora era quasi del tutto assente e non ha segnato particolari
problemi nella misurazione dei valori di trasmittanza o nel conteggio cellulare.
Per quanto riguarda il processo di aggregazione è lecito fare una distinzione (vedi immagini
sottostanti).
Fig. 18, aggregazione di una coltura di lievito contaminata
Fig. 19, coltura di lievito contaminata
Le fig. 18 e 19 mostrano una coltura di cellule di lievito dopo 3 giorni dalla preparazione.
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Si può notare un accentuato processo di aggregamento cellulare, che però risulta troppo pronunciato
per una normale coltura in crescita. Dopo aver osservato dei campioni al microscopio, si è notata la
presenza di corpi estranei alla coltura.
Si può concludere che gli aggregati cellulari sono dovuti ad una contaminazione della coltura, la
quale ha portato allo sviluppo di muffe o batteri che hanno compromesso l’esperimento.
Questa ipotesi è stata confermata dal conteggio cellulare che mostra un numero di cellule
drasticamente calato dal Giorno 2 al Giorno 3 (vedi tab.1).
Giorno 1
Giorno 2
Giorno 3
Zona 1
Zona 2
numero di cellule
(0,004µL)
(0,004 µL)
in 1mL
189 cellule
218 cellule
50'875'000 cellule
262 cellule
148 cellule
52'500'000 cellule
67 cellule
69 cellule
34'000’000 cellule
Tab. 1
Come ulteriore verifica si è misurato, tramite pHmetro, il pH di tale soluzione e si è riscontrato un
risultato molto basso: 5,6.
In base ai dati ricavati si può supporre che, probabilmente, tutte le cellule di lievito sono morte.
Oltre al drastico calo di cellule in soluzione, alla presenza di muffe e/o batteri un tale valore di pH è
sicuramente troppo basso in una coltura di soli 3 giorni, anche perchè il numero di cellule presenti
non sarebbe stato sufficiente per causare un tale abbassamento del valore di pH.
Una coltura di cellule di lievito non contaminata si mostra come la fig. 20.
Fig.20, coltura non contaminata
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La fig. 20 mostra una coltura di cellule di lievito dopo 7 giorni dalla preparazione; a occhio nudo si
può notare che non sono presenti alcuni segni di aggrumazione. L’aggrumazione cellulare dei
Saccharomyces cerevisiae infatti non è particolarmente visibile a occhio nudo19 , ma solo
osservando le cellule al microscopio si notano degli ammassi di cellule più o meno grandi, a
dipendenza di quando la coltura è stata preparata.
Le soluzioni acquose di cellule di lievito non contaminate si mostrano infatti, abbastanza limpide o
con un leggero principio di aggregazione. Nelle soluzioni non contaminate osservate al microscopio
ottico è possibile distinguere abbastanza chiaramente una cellula dall’altra, riuscendo a contare
abbastanza precisamente anche le eventuali cellule che potrebbero formare piccoli aggregati.
5.2.7 Il blu di tripano
Il blu di tripano (trypan blue) è un colorante in grado di visualizzare selettivamente le cellule morte.
Questo colorante non è in grado di colorare le cellule vive in quanto la membrana cellulare, dotata
di una estrema selettività, è in grado di praticare un’esclusione del blu di tripano20 che impedisce la
penetrazione di questo colorante nel citoplasma; nelle cellule morte invece il blu di tripano penetra
facilmente, esse infatti non hanno più la membrana cellulare intatta, questo rende facile distinguere
al microscopio le cellule vive dalle cellule morte, in quanto queste ultime si colorano. Il blu di
tripano non è tuttavia in grado di distinguere le cellule necrotiche dalle cellule apoptotiche21 .
Un esempio visivo dell’azione del blu di tripano viene mostrato dalla fig. 21.
Fig. 21, plasmacellule del connettivo lasso viste al microscopio ottico
Fig. 22, blu di tripano
19
In alcune colture non contaminate si è potuto osservare che l’aggregazione era più marcata che in altre.
Tuttavia, nelle colture con un’aggregazione visibile a occhio nudo, essa non appariva grande e uniforme come nelle
fig. 18 e 19, ma piuttosto erano più visibili che in altre colture alcuni piccoli ammassi di cellule concentrati sul fondo
del contenitore.
20
Tecnica speciale assunta dai Saccharomyces per espellere questa sostanza dal proprio corpo, le modalità con qui tali
cellule attuano tale processo non sono ancora ben note.
21
La differenza tra morte per apoptosi e morte per necrosi sta che in quest’ultima la morte della cellula è involontaria
(indotta per esempio da una bruciatura o altro), la morte per apoptosi è una morte programmata dalla cellula, che si
“sacrifica” per salvaguardare le altre.
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Essa mostra una colonia di plasmacellule del connettivo lasso della mucosa della bocca; esse si
distinguono per la disposizione della cromatina a “raggi di ruota”, che viene evidenziata in questa
figura dal blu di tripano.
La fig. 23 mostra invece la struttura chimica del colorante blu di tripano.
Fig. 23, struttura chimica del blu di tripano
5.2.8 La camera di Neubauer
Fig. 24, camera di Neubauer
La camera di Neubauer (fig. 24) è un tipo di emocitometro, che permette di contare in modo preciso
un determinato numero di cellule in una coltura, mettendo in relazione il numero di cellule ad un
dato volume. Questo mezzo permette di vedere lo stato fisico delle cellule osservate, verificando se
sono vive o morte. A questo scopo si utilizza un colorante, come il blu di tripano (vedi pagine
precedenti). Grazie a questa camera si può inoltre verificare anche se si sono sviluppati altri tipi di
organismi nella coltura (ad esempio batteri o muffe). La conta cellulare con la camera di Neubauer
viene effettuata utilizzando un microscopio.
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5.2.9 Come usare la camera di Neubauer per il conteggio cellulare
La camera di Neubauer è divisa in 9 principali quadrati, con l’ingrandimento 10x è possibile
contare le cellule presenti in ogni quadrato, a loro volta composti da 16 quadratini ognuno con
un’area di 0,0025 mm2, per un totale di:
0,0025 X 16= 0,04mm2, ovvero 0,004mm3 che corrispondono a 0,004 µL.
Fig. 25, struttura della camera di Neubauer
5.2.10 Il saccarosio
Per questo lavoro si è deciso di usare il saccarosio come fonte di nutrimento per le cellule di lievito,
in quanto si tratta di una molecola frequentemente usata a tali fini in colture analoghe. I
Saccharomyces cerevisiase presentano infatti una forte affinità fermentativa nei confronti di
saccarosio e glucosio. A seconda dei ceppi, il comportamento dei lieviti nei confronti di altri
carboidrati, quali galattosio, maltosio e/o raffinosio, è variabile.
Il saccarosio, comunemente noto come zucchero da tavola o zucchero bianco, è un disaccaride
costituito da una molecola di glucosio e una di fruttosio unite da un legame alfa,beta-1,2glicosidico.
Può essere presente negli steli della canna da zucchero e nelle radici della barbabietola da zucchero.
Esso prenderà parte agli esperimenti svolti prossimamente, fungendo da nutrimento per le cellule di
lievito e permettendo dunque la fermentazione.
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Fig.2622, molecola di saccarosio
5.2.11 Determinazione della concentrazione ideale di saccarosio
Non essendoci riferimenti nell’articolo23 a cui si è ispirato questo lavoro, in merito alla
concentrazione di saccarosio da utilizzare per la preparazione di una coltura di Saccharomyces
cerevisiae si è deciso di scegliere una concentrazione di partenza a caso (88mM). Al fine di ottenere
4 soluzioni a differenti concentrazioni si è proseguito con una serie di diluizioni 1/3:
88 mM, 29,33 mM, 3,26 mM, 1,08 mM.
Il volume della coltura, al fine di consentire lo spazio alle sonde, si è scelto essere 200 mL.
La temperatura a cui la coltura è stata esposta è quella ambiente (circa 25℃), anche se la
temperatura ideale allo sviluppo di tali cellule si situa sui 30℃.
L’esperimento durerà complessivamente 5 giorni, durante i quali si provvederà a misurare i vari
parametri: conteggio cellulare, valori di trasmittanza, mortalità, valori di pH, tasso di respirazione
cellulare ed eventualmente fermentazione (liberazione di CO2, ev. etanolo).
22
http://www.scarbolozuccheri.com/zucchero.htm
23
ink.springer.com/article/10.1007/s11306-011-0360-x
34
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5.2.12 L’influenza della musica sulla coltura
Materiale
Lievito
Saccarosio
Contenitore (per la soluzione madre)
Contenitori a chiusura ermetica
Pipetta Gibson
Camera di Neubauer
Colorimetro
Blu di tipano
Sonde dell’etanolo e della CO2
Ph-metro
Procedimento
Il procedimento per questo esperimento è molto simile a
quello dell’esperimento precedente; dapprima preparare
una soluzione madre in maniera analoga all’esperimento
4.
Successivamente prelevare 4 campioni da 1mL con
l’apposita pipetta Gibson e metterli distintamente negli
appositi contenitori a chiusura ermetica contenenti
200mL d’acqua e la stessa quantità di saccarosio usata
per la preparazione della soluzione madre.
Due soluzioni fungeranno da “monitori di crescita
cellulare”; sottoporre a una di esse la musica.
Oltre al conteggio cellulare e alla misurazione del valore
di trasmittanza, misurare il valore di pH della coltura e
la mortalità cellulare (per mezzo del blu di tripano).
Analogamente, per la misurazione dell’attività
fermentativa, sottoporre una delle soluzioni provvista di
sonde alla musica e lasciare l’altra in assenza, in modo
che possa fungere da controllo.
Musica (Sinfonia 40 Mozart)
35
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5.2.13 La massa di una cellula di lievito
Scopo
Si vuole misurare la massa di una singola cellula di lievito.
Questo dato servirà al momento del calcolo della biomassa di una coltura di lievito, per il
quale è necessario conoscere la massa della singola cellula di lievito.
Materiale
Righello
Microscopio
Vetrino coprioggetti
Procedimento
Usando il microscopio ottico 10X con una
riga calcolare la grandezza delle cellule.
Per avere una media generale si fa
riferimento a 10 cellule di lievito.
Successivamente calcolare la massa di una
singola cellula di lievito.
Vetrino portaoggetti
Soluzione di lievito a concentrazione nota
Formule utilizzate:
Dimensioni reali= Dimensioni righello :
Ingrandimento totale
Vsfera= 4/3 . π . r3
Vpanetto = Vcubo = l3
ncellule panetto = Vcubo / Vcellula
Massa del panetto di lievito / ncellule panetto = massa
cellula di lievito
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5.2.14 Calcolo della biomassa
Scopo
Si vogliono preparare due distinte soluzioni a concentrazione nota di saccarosio in soluzione
acquosa con le quali monitorare la crescita cellulare.
Questo esperimento serve a dare indicazioni in merito all’andamento di una coltura di cellule di
Saccharomyces cerevisae, in particolare informazioni in merito alla biomassa, al tempo di
raggiungimento della capacità portante (periodo stimato entro 4-5 giorni).
Materiale
Lievito
Saccarosio
Contenitore (per la
soluzione madre)
Contenitori a chiusura
ermetica
Pipetta Gibson
Camera di Neubauer
Colorimetro
Sonde dell’etanolo e della
CO2
Procedimento
Si vuole preparare una soluzione madre di 0,5L a titolo noto di
lievito e saccarosio.
Per fare ciò è necessario calcolare la massa di saccarosio che ci
permette di avere una soluzione di 0,5L alla concentrazione che
si è rivelata nell’esperimento 1 (e preferibilmente anche
nell’esperimento 2) essere la migliore, alla quale verrà aggiunto del
lievito fresco.
La soluzione deve essere lasciata fermentare in ambiente aerobico
per 6 ore.
Successivamente prelevare 2 campioni da 1mL con l’apposita
pipetta Gibson e metterli distintamente negli appositi contenitori a
chiusura ermetica contenenti 200mL d’acqua e la stessa quantità di
saccarosio usata per
la preparazione della soluzione madre.
Una soluzione fungerà da “monitore di crescita cellulare”, l’altra,
grazie alle specifiche sonde, misurerà la produzione di etanolo e
CO2 della coltura.
N.B: verificare che i contenitori, una volta inserita la soluzione di
lievito, siano chiusi ermeticamente, in questo modo le cellule di
lievito potranno fermentare; una mancata chiusura provoca l’entrata
di ossigeno nella soluzione e le cellule di lievito opteranno per la
respirazione cellulare anzicchè la fermentazione alcolica.
Lasciare le soluzioni a fermentare per un periodo indeterminato, si
provvederà ogni giorno a monitorare la crescita cellulare grazie alla
camera di Neubauer, nonché la trasmittanza.
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5.2.15 Determinazione della CO2 e dell’etanolo prodotti
Queste sonde serviranno a monitorare la fermentazione delle cellule di lievito in vitro, analizzando
la variazione di CO2 ed etanolo nel corso del tempo rappresentata da un grafico. I dati raccolti con
tali mezzi saranno finalizzati a verificare l’influenza della musica sulle cellule di Saccharomyces
cerevisiae, in particolare andranno a misurare il tasso metabolico cellulare, che si può correlare
direttamente alla crescita della coltura. Dato che la concentrazione di saccarosio molare è inferiore a
9 g/L, secondo la letteratura prevale la respirazione cellulare all’attività fermentativa, almeno fino a
quando l’ossigeno è disponibile. In questo caso la sonda dell’etanolo servirà a verificare per quanto
la respirazione cellulare avrà luogo nella coltura e quando invece prevarrà la fermentazione alcolica
(ovvero quando l’ossigeno sarà finito, si tratta infatti di un ambiente isolato dagli scambi di gas con
l’esterno).
Fig. 27, sonde Pasco per la CO2 e l’etanolo
Le sonde vengono calibrate rispettivamente con aria ed etanolo al fine di poter efficientemente
rilevare le concentrazioni di CO2 ed etanolo all’interno di una coltura di Saccharomyces cerevisae.
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5.2.16 La determinazione del valore di pH
Il pH-metro viene immerso nel campione e provvede a misurare la concentrazione di ioni idronio
contenuti all’interno del campione. In tal modo è possibile calcolare la concentrazione di ioni
idronio presenti all’interno della coltura e il rispettivo valore di pH.
Fig. 28, ph-metro
Il pH-metro è un utensile in grado di misurare il valore di pH di una data soluzione. I prodotti della
fermentazione infatti influenzano il valore di pH; partendo da questa informazione si può
determinare l’attività fermentativa di una coltura, analizzando questi valori.
5.2.17 Acidità e pH
Negli esperimenti che seguiranno si rivelerà importante conoscere alcune propietà fondamentali
della CO2 (ossia uno scarto della fermentazione alcolica) in soluzione acquosa.
La CO2 infatti, come già precedentemente annunciato, può essere usata come parametro per
verificare l’influenza della musica sula crescita di una coltura di lieviti, in quanto, assieme
all’etanolo, segno principale e facilmente rilevabile di attività fermentativa.
La CO2 derivante dal processo fermentativo può essere utilizzata, indirettamente, anche per
calcolare il valore di pH, con ausilio del pH-metro.
39
Lisa Branca
L’influenza della musica sulle cellule di lievito
LAM, Liceo Locarno
5.3 Risultati
Il primo scopo di questo lavoro era trovare la concentrazione di saccarosio ideale allo sviluppo
cellulare. Dalla tabella sottostante (tab. 2) si possono osservare i valori di trasmittanza relativi alle 4
diluizioni fatte. Si nota che il valore di trasmittanza del campione 4, relativo a 1,08 mM, risulta
essere quello con valore di trasmittanza minore. A tale concentrazione la percentuale di luce che
attraversa la soluzione è inferiore rispetto alle altre concentrazioni, ciò significa che in tale
campione è presente un numero maggiore di cellule.
Facendo un paragone con le altre concentrazioni possiamo notare che i valori di trasmittanza sono
più alti. Il campione 1,08 mM infatti, ha trasmittanza 64,4% contro l‘84,7% del campione a 3,26
mM, l‘83,9% del campione a 29,33 mM e il 98% del campione 88 mM.
La concentrazione 1,08 mM è dunque, tra quelle date, quella più adatta allo sviluppo della coltura,
le cellule di lievito infatti crescono più rapidamente e ciò conferisce una maggiore torbidità alla
soluzione e conseguentemente la diminuizione del valore di trasmittanza.
Bisogna tenere conto che la fermentazione avviene a concentrazioni di saccarosio superiori ai 9g/L
(26 mM). Probabilmente il lievito, almeno finchè vi era ossigeno, svolgeva preferibilmente una
respirazione cellulare e non la fermentazione. Come già annunciato, inizialmente, non conoscendo
questa caratteristica delle cellule di lievito, ci si era preoccupati solamente di trovare la
concentrazione ideale allo sviluppo cellulare e non ci si era chiesti se a quella concentrazione
prevaleva la fermentazione o la respirazione cellulare, si credeva che un ambiente chiuso favorisse
la fermentazione. Per tali ragioni, una volta trovata la concentrazione ideale di saccarosio, si è
proseguito con gli esperimenti successivi. Questo fatto determina una complicazione, infatti, negli
esperimenti che seguiranno, non si sa per quanto tempo i lieviti hanno svolto respirazione cellulare
e quando hanno cominciato a fare la fermentazione (ovvero quando è finito l’ossigeno). Tuttavia,
per i fini dell’esperimento, questo fattore non rappresenta un problema particolarmente grande,
poichè in entrambe le colture le condizioni erano le stesse e quindi i risultati possono essere
comparati.
In condizioni aerobiche le cellule di lievito hanno più ATP a disposizione e quindi
crescono meglio.
Trasmittanza %
100.00
75.00
50.00
25.00
0
88 mM
29.33 mM
3,26 mM
Tab. 224
24
Valori di trasmittanza realtivi a una coltura di lievito dopo una settimana.
40
1,08 mM
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L’influenza della musica sulle cellule di lievito
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TRASMITTANZA (%)
Campione 1 (88 mM)
98.00
Campione 2 (29.33 mM)
83.90
campione 3 (3.26 mM)
84.70
campione 4 (1.08 mM)
64.40
Si sono ottenuti dunque i seguenti risultati:
1,08 mM ≈ 1.10-3 mol/L = 1mM
1.10-3 mol/L . 0,5L= 5.10-4 mol
MM(C12H22O11)=342 g/mol
Massa saccarosio 5.10-4 . 342 g/mol= 0,172g
Si conosce ora la massa di saccarosio necessaria alla preparazione della soluzione madre e
all’ambiente di sviluppo della coltura.
Una volta preparata la soluzione madre si è proseguito monitorando la crescita cellulare e i valori di
trasmittanza.
Nell’esperimento che segue, lo scopo era accertarsi che la concentrazione di saccarosio scelta
(1,08 mM) fosse davvero la più ideale allo sviluppo cellulare. A tali propositi si è utilizzato il
colorante blu di tripano; aggiungendo una goccia di questo colorante alla goccia posta sul vetrino da
analizzare al microscopio, si è potuta rilevare la mortalità cellulare presente in due distinte colture
(1,08 mM e 29,33 mM). La scelta della concentrazione 29,33 mM come campione da paragonare al
campione a concentrazione ideale (88 mM) è stata fatta perchè tale soluzione era, in termini di
concentrazione mM la più simile a quella ideale (1,08 mM).
I seguenti risultati appurano che la concentrazione trovata è la più ideale allo sviluppo cellulare,
come si era ipotizzato osservando i valori di trasmittanza: la mortalità media relativa alla
concentrazione di 88 mM è minore rispetto alla mortalità media rilevata per la concentrazione di
29,33 mM, 3,715 (concentrazione 1,08 mM vedi tab.3) contro 19,11 (concentrazione 29,33 mM
vedi tab.4).
41
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L’influenza della musica sulle cellule di lievito
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cellule vive cellule morte
mortalità
37
2
5,13%
2a zona
32
2 5,88%
3a zona
50
2 3,85%
4a zona 36
0 0%
media
155
6
3,715% 1a zona
Tab. 3 (1,08 mM)
cellule vive cellule morte mortalità
1a zona 39
9
18,75%
2a zona 32
7
17,9%
3a zona
15
4
21,05%
4a zona
42
12
18,75%
media
128 32
19,11%
Tab. 4 (29,33 mM)25
25
Vedi nota precedente.
42
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5.3.1 Massa di una cellula di lievito
I dati sottostanti (tab.5) mostrano che una singola cellula di lievito ha un peso di 3,907. 10-5 µg.
Il metabolismo cellulare, come descritto in precedenza, si suddivide in due parti.
Ci sono i processi anabolici e i processi catabolici. Per determinare gli effetti della musica sui
processi anabolici è stata determinata la biomassa prodotta in un certo lasso di tempo. Al fine di
determinare la biomassa delle colture al termine dell'esperienza, è stato necessario determinare la
massa di una cellula di lievito.
Qui sotto sono mostrati i calcoli fatti e i dati ottenuti al fine di calcolare la massa di una cellula di
lievito:
Grandezza cellulare
Grandezza relativa a 10 cellule=
2mm.6 cellule +1mm. 4 cellule
Volume di una
cellula di lievito
Massa di una cellula di
lievito
4/3 . π . 23 = 33,49
µm3
Vpanetto= 3 . 3 . 4 = 36 mm3 =
36 .1012 µm3
ncellule = 36.1012/ 33,49=
1,075. 1012 cell.
totale= 16mm per 10 cellule
media= 16mm : 10 cellule= 1,6mm
42g (Mpanetto lievito) : 1,075. 1012 =
3,907. 10-5 µg.
Dimensioni reali= dimensioni
righello : Ingrandimento totale
formule utilizzate:
4/3 . π . r3
(volume della sfera)
formule utilizzate:
Vpanetto = Vcubo
1,6 . 10 -3 µn : 40 . 10 =4µm
(diametro della cellula)
Tab.5
I dati soprastanti mostrano che una singola cellula di lievito ha un peso di 3,907. 10-5 µg.
Questa informazione, come già anticipato, si rivelerà molto utile per calcolare la biomassa di una
coltura di cellule di lievito.
43
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5.3.2 Risultati inerenti la biomassa della coltura in assenza di musica
Il calcolo della biomassa ha lo scopo di calcolare, oltre che la massa effettiva di cellule presenti
nella coltura di Shaccaromyces cerevisae, anche la quantità di CO2 ed etanolo liberati da ogni
singola cellula di lievito della coltura, al fine di monitorare l’attività fermentativa di essa.
A causa di problemi di tipo tecnico, non è stato possibile avere dei dati con le sonde dell’etanolo e
della CO2, le quali avrebbero dovuto misurare la concentrazione di etanolo e anidride carbonica
prodotti dalle cellule di lievito durante la fermentazione.
Questo risultato, seppure non indispensabile per gli esiti finali di questo LAM, si sarebbe rivelato
molto utile. Avrebbe permesso un paragone quantitativo del tasso di fermentazione di una singola
cellula di lievito nelle due situazioni (presenza e assenza di musica).
44
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5.3.3 Crescita cellulare di una coltura in assenza di musica
Una volta preparata la soluzione madre si è proseguito monitorando la crescita cellulare e i valori di
trasmittanza. Prima di confrontare la crescita cellulare in presenza o in assenza di musica, è stato
importante verificare la variazione della popolazione (cellule vive e morte) di lievito durante un
periodo di tempo di 168h, periodo di tempo scelto in maniera più o meno casuale, ma necessario a
dare un’indicazione sulle informazioni base di una coltura di lieviti (valori di trasmittanza ideali,
mortalità). In questo modo è stato possibile individuare la tempistica degli esperimenti successivi
che, per motivi tecnici (durante il week-end non era possibile accedere al laboratorio), sono stati
ridotti da 168h (7 giorni ) a circa 120 ore (5 giorni).
numero di cellule [* 1000]
70000
52500
35000
17500
0
0
18
44
73
91
97
121
145
163
187
tempo (h)
Grafico a, la crescita cellulare
Il grafico a mostra l’andamento di una coltura di cellule di lievito in un ambiente di 25℃ nell’arco
di 187h. Al tempo 0h abbiamo un numero di cellule pari 59875* 1000 in un campione da 1 mL. La
capacità portante, ovvero il numero massimo di elementi che un determinato ambiente può
supportare, viene raggiunta a 97h con un numero di cellule pari a 69000* 1000 cellule per 1 mL
(per un totale di 1,38. 1010 cellule nell’intera coltura). A 187h abbiamo 53500* 1000 cellule per 1
mL. Possiamo indicativamente affermare che la capacità portante viene raggiunta dopo circa 91h
dalla preparazione della coltura (circa 3-4 giorni). Ovviamente si possono solo dare informazioni
approssimative poiché il metabolismo cellulare si sa essere influenzato da diversi parametri tra cui
temperatura, pH, pressione.
45
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La coltura aumenta e diminuisce in quanto numero di elementi in modo abbastanza irregolare, si
può tuttavia affermare che, dopo la fascia temporale relativa a 97h, il numero di cellule comincia a
calare, possiamo escludere il dato a 163h, in ogni caso un valore alto come quello a 97h non viene
più raggiunto.
Tali risultati relativi al grafico di andamento della coltura e ai valori di trasmittanza in funzione del
tempo non hanno la finalità di mostrare novità, possono tuttavia offrire dei risultati riguardanti
l’andamento di una coltura di lievito, quali le modalità di crescita, la durata di vita di una coltura e
la relativa biomassa.
trasmittanza (%) a 480 nm
100
75
50
25
0
0
18
24
43
66
72
90
96
120
138
162
168
186
192
tempo (h)
Grafico b, la trasmittanza
T
0
18
24
43
66
72
90
96
91.8
80.4
76.7
79.5
77.4
68.6
64.8
63.11
120
57.8
138
57.9
162
57.3
168
53.2
186
59.2
192
51.9
Tab. 6, trasmittanza misurata a 480 nm durante un periodo di 192 ore.
Il grafico soprastante mostra risultati in merito ai valori di trasmittanza in funzione del tempo.
Si nota che i dati del grafico della trasmittanza non coincidono perfettamente con i dati ottenuti nel
grafico dell’andamento cellulare in funzione del tempo.
46
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Nel grafico della trasmittanza, escludendo il dato ottenuto a 186h (asse delle ascisse), che può
essere considerato un errore di calcolo, i valori di trasmittanza calano costantemente, segno di un
aumento del numero di cellule nella coltura (vedi legge di Lambert Beer).
I valori di trasmittanza infatti diminuiscono progressivamente anche se il numero di cellule, a
partire dal sesto giorno, è in diminuizione; questo rappresenta un’incongruenza.
Osservando le colture in soluzione acquosa e le cellule al microscopio ottico, si è potuto constatare
che tali cellule tendono ad aggregarsi, formando dei piccoli complessi. Questi complessi
solitamente, tendono ad accumularsi sul fondo della soluzione, si tratta di un fenomeno che accade
di frequente nelle colture cellulari (vedi metodi). I risultati di tali valori di trasmittanza possono
essere spiegati facendo riferimento alla modalità di prelievo dal compione della coltura; prima del
prelievo infatti la coltura è stata agitata in modo da distribuire in maniera omogenea le cellule in
tutta la soluzione, tuttavia non è stato possibile rompere manualmente gli aggregati di cellule; per
tali ragioni il campione prelevato mostrava un valore di trasmittanza oscillante.
Visto che non si era sicuri di come poter spiegare tale risultanza, si è provveduto a tenere il primo
valore mostrato dal colorimetro, anche se sicuramente si trattava di un dato inesatto e influenzato
dall’aggregamento cellulare della coltura.
Nell’esempio specifico delle colture di Saccharomyces cerevisae si è potuto notare che il fenomeno
di aggregamento cellulare avviene, anche se poco accentuato, già a partire dal secondo giorno.
Anche il conteggio cellulare è sicuramente stato influenzato da questo processo; risulta infatti
difficile contare, con i mezzi dati, il numero esatto di cellule quando esse si aggregano, poichè le
cellule non sono ben identificabili quantitativamente.
Questi risultati, seppure mostrano delle imprecisioni, hanno potuto offrirci un’indicazione utile in
merito al comportamento di una coltura di lievito, le osservazioni sul processo di aggregazione
possono essere usate come utile strumento per spiegare eventuali fenomeni fisici o incongruenze nei
dati ottenuti nei seguenti esperimenti.
47
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5.3.4 Andamento della coltura con esposizione alla musica
Per motivi tecnici legati alla funzionalità del colorimetro, la trasmittanza di questo esperimento è
stata misurata alla lunghezza d’onda di 620nm al posto di 480nm.
Trasmittanza % a 620 nm
90
82.5
75
67.5
0
20
45
74
tempo (h)
Trasmittanza (%) a 620 nm Musica
Trasmittanza (%) a 620 nm No Musica
Grafico c, la trasmittanza
0
Trasmittanza (%) a 620 nM
Musica
20
79.8
72.9
0
Trasmittanza (%) a 620 nM No
Musica
45
20
79.80
74
69.8
45
77.41
71.0
74
73.21
67.61
Il grafico della trasmittanza ci mostra valori che diminuiscono più rapidamente per la soluzione a
cui è stata sottoposta la musica piuttosto che per la soluzione non esposta alla musica. Tali dati ci
mostrano un più rapido aumento del numero di cellule nella coltura sottoposta alla musica, fatta
eccezione per il dato ottenuto a 74 h, dove il valore di trasmittanza risulta essere più alto delle ore
precedenti.
48
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110000000
numero di cellule
82500000
55000000
27500000
0
20
45
74
tempo (h)
numero di cellule Musica
numero di cellule No Musica
Grafico d, il conteggio cellulare
0
numero di cellule
No Musica
48750000
0
numero di cellule
Musica
48750000
20
45
74
62375000
79625000
86420000
20
45
74
62500000
85625000
39750000
Il numero di cellule aumenta più rapidamente nella coltura sottoposta alla musica fino alle 74h. Nei
primi tre dati la differenza più marcata è riscontrabile a 45h, dove la popolazione di cellule di lievito
esposte alla musica risulta superare in maniera piuttosto marcata la coltura con cellule non esposte
alla musica. A 74h vediamo che il numero di cellule per la coltura sottoposta alla musica è
drasticamente diminuito rispetto alla precedente misurazione, mentre il numero di cellule presenti
nella coltura non esposta alla musica è aumentato rispetto al dato a 45h.
49
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0.8
tasso di crescita cellulare
0.6
0.4
0.2
0
-0.2
0
20
45
74
tempo (h)
tasso di crescita cellulare Musica
tasso di crescita cellulare No Musica
Grafico e, il tasso di crescita cellulare
0
Tasso di crescita cellulare
No Musica
0
0
Tasso di crescita cellulare
Musica
0
20
45
74
0.279
0.633
0.773
20
45
74
0.282
0.756
-0.185
I dati realativi al grafico e e alla tabella sottostante si possono paragonare ai risultati del grafico
dell’andamento della coltura (vedi pagina precedente). Tale grafico mette in evidenza l’improvvisa
decrescita della coltura sottoposta alla musica nell’intervallo tra 45h e le 74h. Si può inoltre notare
che a 45h il tasso di crescita della coltura esposta alla musica supera di gran lunga quello della
coltura non esposta alla musica, determinandone una popolazione molto maggiore (vedi dati del
grafico precedente).
50
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9
pH
8
7
6
5
0
20
45
74
tempo (h)
pH - Musica
pH - No Musica
Grafico f, l’andamento del pH
0
pH - No Musica
20
7
0
pH - Musica
45
6.8
20
7
74
6.7
45
6.5
6.4
74
6.2
5.6
Possiamo notare che, per la coltura sottoposta alla musica, il pH cala più rapidamente, soprattutto
tra le 45h e le 72h, dove cala di ben 0,6 unità. Questo risultato è dovuto al fatto che la soluzione
sottoposta alla musica ha un tasso metabolico maggiore rispetto all’altra coltura. Di conseguenza, le
cellule sottoposte alla musica hanno rilasciato più CO2 nell’ambiente circostante, abbassando il
valore di pH. Si può notare che a 72h il pH della coltura sottoposta alla musica ha un valore di pH
pari a 5,6, si tratta di un pH che è risultato troppo acido per le cellule di lievito. Tali dati possono
spiegare l’improvvisa decrescita cellulare tra le 45h e le 72h, l’acidità della soluzione è risultata
fatale per la coltura, il numero di cellule è drasticamente calato a causa dell’eccessiva acidità della
soluzione. Quest’ipotesi è stata confermata grazie al saggio con il blu di tripano, che ha potuto
rilevare una mortalità cellulare del 23,2% nella soluzione esposta alla musica, mentre ha rilevato
una mortalità nulla nell’altra soluzione.
Tuttavia, anche senza i dati delle sonde, si può provvedere a calcolare la CO2 prodotta da ogni
singola cellula di lievito nei vari intervalli di tempo.
51
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L’influenza della musica sulle cellule di lievito
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Una propietà della CO2 è quella di protonarsi in soluzione acquosa, reagendo con H2O forma
l’acido carbonico.
Ka acido carbonico : 4,3. 10-7
ka = [ H+ ] [ HCO3-] : [H2CO3]
pH26 = 5,6 (coltura esposta alla musica)
pH27 = 6,4 (coltura non esposta alla musica)
[ H+ ] = 10−5,6 = 2,51.10−6 mol/L
[ H+ ] = 10−6,4 = 3,98. 10−7 mol/L
[H2CO3] = 10−5,6. 2 : 4,3. 10-7 = 1,5. 10−5 mol/L
[H2CO3] = 10−6,4. 2 = 1,58. 10−13 mol/L
Dalla relazione:
H2O + CO2 → H2CO3
Si nota che il rapporto CO2 /H2CO3 è 1:1, si può quindi approssimare che la concentrazione di acido
carbonico è pari a quella di anidride carbonica ([H2CO3]= [CO2]). I risultati soprastanti mostrano
una maggiore emissione di CO2 per la coltura esposta alla musica.
26
Ci si riferisce al pH finale della soluzione di lievito esposta alla musica.
27
Ci si riferisce al pH finale della soluzione non esposta alla musica.
52
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L’influenza della musica sulle cellule di lievito
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5.3.5 Esperimento di controllo
Al fine di appurare i dati ottenuti dall’esperimento 5 si è provveduto a svolgere, procedendo
analogamente seguendo il procedimento descritto per l’esperimento 5, un controllo che possa
confermare o eventualmente contrastare ciò che si è dedotto dall’esperienza soprastante e rendere
dunque più veritiero e attendibile il lavoro svolto in tale ambito. Si è deciso di monitorare la crescita
cellulare e il valore di pH, purtroppo i risultati inerenti alle sonde, le quali, messe in relazione con il
grafico della crescita cellulare, avrebbero dovuto darci informazioni inerenti il tasso si
fermentazione e la biomassa delle distinte colture.
90000000
numero di cellule
67500000
45000000
22500000
0
20
25
41
49
65
72
89
98
tempo (h)
numero di cellule Musica
numero di cellule No Musica
Grafico g, la crescita cellulare
0
numero di
cellule No
Musica
25
41
49
65
72
89
98
32700000 47110000 48210000 51210000 51240000 68910000 71140000 80110000 77200000
0
numero di cellule
Musica
20
20
32700000 43110000
25
41
47810000 58110000
53
49
65
72
56120000
78120000
79940000
89
98
86120000 81130000
Lisa Branca
L’influenza della musica sulle cellule di lievito
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Il grafico g dell’andamento delle colture mostra ancora una volta una crescita di cellule di lievito
globalmente maggiore nella coltura sottoposta alla musica, tranne per i dati concernenti le prime
25h durante le quali la coltura cresciuta in assenza di musica aveva un tasso di respirazione
cellulare 28 rispetto alla coltura sottoposta alla musica.
Dopo questo primo periodo di adattamento, che può essere spiegato facendo riferimento al fatto che
probabilmente, anche se la quantità prelevata per ogni misurazione era la medesima, in un
campione potevano esserci un numero maggiore di cellule rispetto all’altro, successivamente la
coltura sottoposta alla musica ha mostrato superare il tasso metabolico dell’altra coltura. Tale
affermazione è riscontrabile dai dati del grafico e della tabella soprastanti, che mostrano infatti, a
partire dai dati delle 41h, un aumento cellulare maggiormente accentuato.
Grafico h, la biomassa
Biomassa
(3,907. 10-5 µg)
No Musica
Biomassa
(3,907. 10-5 µg)
Musica
0
20
25
41
49
65
72
89
1277.59
1840.59
1883.57
2000.78
2001.95
2692.31
2779.44
3145.14
0
20
25
41
49
65
72
89
98
1277.59
1528.03
1594.45
2270.36
2192.61
3052.15
3123.26
3286.57
3169.75
28
98
3016.2
Parliamo di respirazione cellulare in questo caso in quanto, per via dell’effetto Crambtree descritto in precedenza, in
un ambiente dove la concentrazione di saccarosio è inferiore ai 9 g/L prevale la respirazione cellulare anzicché la
fermentazione.
54
Lisa Branca
L’influenza della musica sulle cellule di lievito
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Commentando questo grafico si possono trarre conclusioni simili a quelle descritte per il grafico
precedente. Si nota che la coltura sottoposta alla musica ha in generale, fatta eccezione per i dati
delle prime 25h per le motivazioni precedentemente espresse, una biomassa maggiore, che
raggiunge il suo apice (per entrambe le colture) a 89h.
Successivamente, a 98h, possiamo notare che la biomassa di entrambe le colture è calata rispetto ai
dati ricavati a 89h. Probabilmente la capacità portante, raggiunta a 89h, ha determinato un calo della
popolazione di cellule di lievito, per entrambe le colture.
55
Lisa Branca
L’influenza della musica sulle cellule di lievito
LAM, Liceo Locarno
8.00
pH
7.25
6.50
5.75
0
20
25
41
49
65
72
89
98
tempo (h)
pH Musica
pH No Musica
Grafico i, andamento del pH
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7
6.8
6.8
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72
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89
6.1
89
5.8
98
5.9
98
5.7
IL grafico i mostra chiaramente che il tasso di respirazione cellulare della coltura sottoposta alla
musica è maggiore. A partire dalle 41h il pH della coltura sottoposta alla musica comincia ad
abbassarsi più rapidamente rispetto alla coltura non esposta alla musica. La concentrazione di ioni
idronio, che determina il valore di pH della coltura, aumenta all’aumentare della concentrazione
molare di CO2 presente in soluzione, determinando un maggiore abbassamento per la coltura
esposta alla musica.
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Si può infine notare che nonostante un pH non particolarmente basso (soprattutto per la coltura non
esposta alla musica), entrambe le colture cominciano, nell’intervallo di tempo tra le 89h e le 98h, a
diminuire in quanto numero di elementi, segno che la capacità portante per entrambe le colture è
stata raggiunta in quest’intervallo di tempo, anche se il numero delle cellule nella coltura con la
musica era probabilmente maggiore del numero di cellule nell’altra coltura. Un’ulteriore conferma
del raggiungimento della capacità portante viene riportata dai valori di mortalità cellulare, che
risultano essere rispettivamente 12,2% per la coltura esposta alla musica e 6,4% per la coltura non
esposta alla musica.
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6. CONCLUSIONI
Nonostante la mancanza di dati con le sonde della CO2 ed etanolo si è potuto lo stesso raggiungere i
fini del lavoro, ovvero determinare il ruolo della musica sul metabolismo delle cellule di lievito.
Innanzitutto una parte indubbiamente importante di quest’ultima fase sta nel fare un confronto tra i
dati ottenuti e quelli attesi.
Dopo vari esperimenti, si è potuto constatare una certa differenza nella modalità di crescita tra le
colture esposte alla musica e quelle non esposte. Ciò mostra che la musica sembrerebbe avere un
certo influsso sulle cellule e sul loro metabolismo. I risultati per gli esperimenti con la musica
descritti nelle pagine precedenti ce lo confermano, mostrando ad esempio un pH minore per le
colture esposte alla musica, probabile segno di maggiore attività metabolica (probabilmente più
respirazione cellulare rispetto alla fermentazione) e di una popolazione di cellule di lievito
maggiore. Tale risultato è correlabile con i valori della crescita cellulare, della trasmittanza e della
biomassa che mostrano una maggiore crescita cellulare e una maggiore torbidità per le colture
esposte alla musica. In base a tali dati si può confermare che esiste una correlazione tra torbidità
della coltura e crescita cellulare; la torbidità della soluzione aumenta (ovvero la trasmittanza
diminuisce) all’aumentare del numero di cellule presenti nella coltura. Chiaramente non possiamo
sapere con estrema precisione in che misura la musica influenza la crescita cellulare. Ciò è anche
dovuto al fatto che i dati delle le sonde non sono sempre stati disponibili. Non si può inoltre sapere
la modalità con la quale la musica influenza le cellule di lievito, ovvero come il suono influenza il
metabolismo cellulare; per ottenere tali risultati si dovrebbero infatti utilizzare tecniche più
elaborate, di cui non si disponeva.
In conclusione non possiamo dire che, secondo i seguenti esperimenti, la musica ha un’influenza
abbastanza rilevante sulle cellule di lievito. Gli esiti di questo lavoro sembrerebbero volgere a
favore dell’influenza della musica sulla respirazione cellulare dei Saccharomyces cerevisiae, in
particolare incrementandola.
Ovviamente per chiarire meglio la questione servirebbero ulteriori parametri, ma si può comunque
affermare che la musica non lascia tali cellule indifferenti...
Da questa osservazione potrebbero emergere possibili sviluppi in tale ricerca, che potrebbero
consistere nel cambiare alcuni parametri nella coltura, ad esempio alterare il pH, creare un ambiente
di coltura con temperatura costante T=30℃ (ideale), o cambiare le condizioni di coltura facendo
avvenire unicamente la fermentazione alcolica e non la respirazione cellulare e osservare la
reazione delle distinte colture in presenza e assenza di musica.
Si potrebbe proseguire la sperimentazione con sonde della CO2 e dell’etanolo (o dell’ossigeno)
funzionanti, per verificare fino a quando una coltura in un ambiente chiuso ermeticamente può fare
respirazione cellulare (ovvero quanto velocemente le distinte colture consumano l’ossigeno). Infatti
quando la coltura comincia a produrre etanolo significa che la via metabolica svolta dai lieviti sarà
la fermentazione, oppure, se si utilizza la sonda dell’ossigeno, quando essa non percepisce più
ossigeno all’interno della coltura significa che la coltura, in assenza di ossigeno, avrà optato per la
fermentazione.
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7. BIBLIOGRAFIA
Documenti cartacei:
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CAMPBELL REECE-TAYLOR-SIMON-DICKEY, Biologia, secondo biennio e quinto anno
LILIA ALBERGHINA, FRANCA TONINI, Biologia Fondamenti e nuove frontiere, volume 1
FRANCO BAGATTI, ALESSANDRO DESCO, ELIS CORRADI, CLAUDIA ROPA, A tutta
chimica, Zanichelli, Terza edizione
.
HAROLD HART, CHRISTOPHER M.HADAD, LESLIE E.CRAINE, DAVID J.HART, Chimica
organica, Zanichelli, Settima edizione.
.
LAM in biologia e chimica 2007, Liceo Cantonale di Locarno, svolto da MATTEO LAVA
Siti internet:
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http://www.bioinorg.unito.it
http://www.chimica-online.it
http://xfiles.farmacia.uniba.it
http://www.amadeux.net/sublimen/dossier/suono_voce_e_cellule.html
studxwebmedicina.altervista.org/bioch2.ppt
http://www.biologia.unige.it/corsi/morelli1/12.pdf
http://www.buetzer.info/fileadmin/pb/pdf-Dateien/Enzyme%20als%20Regler.pdf
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8. GLOSSARIO
Candidosi: si tratta di un’infezione che colpisce generalmente le mucose superficiali orali e genitali,
ma che può diventare sistemica e potenzialmente mortale.
Catalizzatore: si tratta di una specie chimica che interviene durante lo svolgimento di una reazione
chimica aumentandone la velocità, rimanendo comunque inalterato al termine della stessa
(a differenza dei reagenti, che si consumano al procedere della reazione).
Denaturazione: modifica strutturale indotta di una molecola; in generale si parla principalmente di
due tipi di denaturazione, quella irreversibile e quella reversibile.
Enzima: si definisce enzima un catalizzatore dei processi biologici.
La maggioranza degli enzimi sono proteine e sono dunque composti da amminoacidi, una piccola
minoranza di enzimi sono particolari molecole di RNA chiamate ribozimi (o enzimi a RNA).
Emocitometro: complesso formato da uno speciale vetrino portaoggetti con opportuno coprioggetto.
ΔG: entità termodinamica conosciuta come energia libera di Gibbs; essa descrive la quantità di
energia disponibile in un determinato spazio (energia libera). Una reazione è detta esoergonica e
spontanea quando ΔG è negativo ed è endoergonica e non spontanea quando ΔG è positivo, con il
simbolo ΔG=0 si indica l’equilibrio chimico.
Isomero: si definiscono isomeri quelle sostanze diverse per proprietà fisiche e spesso anche per
comportamento chimico che hanno tuttavia la stessa formula bruta, stesso peso molecolare e stessa
composizione percentuale di atomi.
Modello chiave-serratura: sta a indicare la specificità del sito catalitico con il substrato, proprio
come una chiave è specifica ad una determinata serratura.
Organismo anaerobico facoltativo: esistono due tipi di organismi anaerobi; gli anaerobi facoltativi
(come i lieviti) e gli anaerobi obbligati, i quali necessitano di un ambiente anossico per vivere
poiché l’ossigeno risulta tossico per loro.
Purina: è una molecola organica eterociclica aromatica, composta da un anello pirimidinico fuso
con un anello di imidazolo.
pH: il pH è una scala di misura dell'acidità o dell'alcalinità di una soluzione, esso è inversamente
proporzionale all’acidità di una soluzione.
Il valore di pH è definito come:
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Con la medesima formula si può utilizzare, invece che gli ioni idronio, la concentrazione di OH− , in
questo modo otteniamo il valore di pOH. Il valore di pH (che va dal grado 1 al 14) può essere anche
calcolato con l’ausilio della formula:
pH= 14-pOH
Un valore di pH è definito acido quando il suo valore è inferiore a 7, è considerato basico invece
quando tale valore supera il 7. Un pH=7 corrisponde ad un pH neutro.
Reazione endoergonica: reazione che richiede energia utile (lavoro)
Reazione esoregonica: reazione che libera energia utile (lavoro)
REDOX: reazione di ossidoriduzione, nella quale una specie chimica viene ossidata (agente
riducente) e un’altra viene ridotta (agente ossidante).
Sito attivo: è la parte reattiva della molecola, si tratta di una sorta di “tasca molecolare”costituita da
amminoacidi e divisa in due regioni, una capace di riconoscere e legare con il substrato, l’altra
capace di avviare la catalisi ogni volta che il substrato si lega all’enzima.
Substrati: Gli enzimi sono dotati di alta specificità: la maggior parte dei catalizzatori infatti
reagiscono con un solo substrato (si parla infatti di modello chiave-serratura), il quale si lega al sito
attivo(fig. 6) presente sull’enzima.
Fig. 629: meccanismo chiave-serratura
Velocità di reazione: l’enzima attua il processo di catalisi, esso infatti funge da catalizzatore nelle
reazioni chimiche, aumentandone la velocità di reazione e quindi raggiungendo più velocemente lo
stato di equilibrio termodinamico (vedi fig. 29).
È importante tenere conto che un enzima incrementa unicamente le velocità delle reazioni
chimiche, diretta e inversa (dal composto A al composto B e viceversa), senza intervenire sui
processi che regolano la spontaneità della reazione considerata.
A⇔B
In altre parole, agiscono dal punto di vista cinetico senza modificare la termodinamica del
processo.
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http://www.chimicamo.org/chimica-organica/attivita-catalitica-degli-enzimi.html
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Fig. 29, confronto tra reazione catalizzata da enzima e reazione non catalizzata
È importante inoltre tenere conto che l’enzima, alla fine di ogni reazione rimane immutato, ovvero
non si modifica chimicamente in alcun modo pur partecipando alle reazioni, questa caratteristica
apporta innumerevoli vantaggi alle cellule, poiché, non modificando la loro conformazione e
dunque rimanendo attivi, non devono investire energia (ATP) per la costruzione di enzimi
sostitutivi.
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9. RINGRAZIAMENTI
Come prima cosa desidero ringraziare i miei docenti responsabili; la prof.ssa Laura de Biasio e la
prof.ssa Francesca Dellea per la grande pazienza e disponibilità che hanno avuto nei miei confronti,
per tutto il prezioso aiuto che mi hanno offerto e per il tempo investito.
Desidero inoltre ringraziare anche i miei docenti di BIC; il prof. Riccardo Graber e il prof. Fabio
Selva per il materiale e il grande aiuto fornito, assieme al prof. Michele D’Anna e al prof. Ruben
Moresi che mi hanno aiutato con le sonde Pasco. Ringrazio la prof.ssa Giosiana Codoni, per il
prezioso aiuto offerto nella stesura finale del LAM. Ringrazio inoltre tutti i docenti di biologia che
nel momento del bisogno mi hanno sempre aperto il laboratorio di biologia permettendomi di
continuare la sperimentazione.
Infine voglio ringraziare tutti gli amici, familiari e persone che si sono mostrate solidali verso il mio
lavoro, che mi hanno aiutato e che mi hanno sostenuto moralmente.
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